Summary
Este protocolo presenta un método para evaluar la actividad proteolítica de una proteasa de rotación intrínseca baja actividad, solo en un contexto celular. Específicamente, este método se aplica para evaluar la actividad proteolítica de PCSK9, un factor clave del metabolismo de los lípidos cuya actividad proteolítica se requiere para su última función hipercolesterolémicos.
Abstract
Cualquiera convertasa subtilisin/kexin tipo 9 (PCSK9) es una proteasa de facturación solo que regula los niveles de lipoproteína de baja densidad (LDL) y, en consecuencia, las enfermedades cardiovasculares. Aunque PCSK9 proteólisis se requiere para su efecto completo hipercolesterolémicos, la evaluación de su función proteolítica es un reto: PCSK9 sólo es conocido por sí mismo allegarse se somete sólo un volumen único y después de la proteólisis, conserva su sustrato en su sitio activo como inhibidor de auto. Los métodos presentados aquí describen un ensayo que supera estos desafíos. El análisis se centra en la proteólisis intermolecular en un contexto basado en la célula y escote acertado enlaces a la actividad de luciferasa secretada, que puede ser fácilmente leída hacia fuera en el medio condicionado. Mediante pasos secuenciales de mutagénesis, transitorios de la transfección y una lectura de luciferasa, el ensayo puede probar PCSK9 proteólisis en condiciones de perturbación ya sea genética o molecular de un modo de alto rendimiento. Este sistema es idóneo para ambos la evaluación bioquímica de clínicamente descubierto sin sentido solo polimorfismos de nucleótido simple (SNPs), así en cuanto a la proyección de los inhibidores de molécula pequeña de proteólisis PCSK9.
Introduction
PCSK9 apunta el receptor de LDL (LDL-R) para la degradación, elevar el colesterol LDL (LDL-C) y conducir a enfermedad aterosclerótica del corazón1,2. Terapéutica dirigida a PCSK9 robusta reducir C-LDL y mejorar los resultados cardiovasculares de los pacientes, incluso cuando se añade a una agresiva terapia hipolipemiante con estatinas3,4. Sin embargo, las terapias actualmente aprobadas se limitan a enfoques basados en anticuerpos y sufren de falta de rentabilidad de5,6. Para resolver este problema, se necesitan alternativas terapéuticas menos costosos, a fin de identificar a los pacientes capaces de obtener mayores beneficios, o ambos.
Enfoques de molécula pequeña podrían objetivo intracelular PCSK9, proporcionan una mejor vía de administración y reducir los costos, haciendo que el "Santo Grial" en esta zona7. Sin embargo, PCSK9 ha probado difícil de droga por pequeñas moléculas. Como una proteasa, dirigida a la función proteolítica de PCSK9 es una estrategia atractiva, como uno mismo-proteólisis es el paso tarifa-limitador de PCSK9 maduración8 y se requiere para su máximo efecto sobre el LDL-R9. Hasta la fecha, sin embargo, esta estrategia no ha tenido éxito, probablemente debido a la bioquímica única de PCSK9: PCSK9 solamente sí mismo segmenta10, realizando una reacción single-facturación y después uno mismo-escote, la PCSK9 prodomain sigue siendo límite en el sitio activo como una auto-inhibidor11, impidiendo la lectura de cualquier otra actividad de proteasa.
Este artículo presenta un método para evaluar la función proteolítica PCSK9 en moda alto rendimiento8. Mediante mutagénesis sitio-dirigida, los investigadores pueden utilizar este análisis para los efectos de la codificación de SNPs encontradas la clínica para evaluar efectos sobre la proteólisis, el paso de limitación de velocidad de maduración PCSK9. Además, este método será útil en el diseño de pantallas de alto rendimiento para identificar moduladores de proteólisis PCSK9, que se prevén que, en definitiva, alterar la presentación de PCSK9 en el LDL-R (y modulan efectos hipercolesterolémicos de PCSK9) . Por último, este protocolo puede ser adaptado a otras proteasas con actividad intrínsecamente baja, siempre que i) un par de sustrato-proteasa específica puede encontrarse, y ii) un anclaje intracelular adecuado puede establecerse para el substrato.
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Protocol
1. dirigida mutagénesis del Vector de la proteasa
- Diseño y orden de oligonucleótidos sintetizados de costumbre instalar una mutación de interés utilizando una modificación de protocolos de mutagénesis sitio-dirigida estándar12. Cartillas desaladas estándar (sin purificación adicional) son perfectamente aceptables.
Nota: Un enfoque general a los diseños del primer implica crear cartillas parcialmente superpuestos como se indica en la tabla 1, usando una calculadora de temperatura (Tm) fusión específica a la polimerasa de interés. - Establecer reacciones en cadena de polimerasa (PCR) para la mutagénesis sitio-dirigida en el hielo, como se indica en la tabla 2.
- Ciclo de la PCR como se indica en la tabla 3.
- 2-5 μl de cada PCR en un gel de agarosa al 1% y visualizar los productos para confirmar una amplificación exitosa.
Nota: Una polimerización en cadena acertada mostrará una banda de DNA única y prominente en el marcador del tamaño aproximado de la plantilla (~7.8 kB). - Añadir 0,5 μl (por reacción de 25 μl) de DpnI e incubar las muestras a 37 ° C durante 1 h.
- Transformar 2 μl de la reacción en químicamente competentes de Escherichia coli.
Nota: Una cepa de e. coli rápido crecimiento reducirá tiempos de incubación, pero cualquier cepa clonación será aceptable. - Las transformaciones en agar Luria-Bertani (LB) con carbenicilina de 50-100 μg/mL de la placa. Incubar las placas durante la noche a 37 ° C.
- Seleccione colonias de 2-4 para crecer en un cultivo en pequeña escala (2-5 mL de medio LB con carbenicilina de 50-100 μg/mL). Incubar el cultivo a 37 ° C a 220 rpm hasta que es turbia.
- Aislar el plásmido de DNA de las células utilizando un kit de purificación (es decir, "miniprep") de DNA de plásmido según las instrucciones del fabricante. Cuantificar la concentración de ADN eluída usando un espectrofotómetro microvolume.
- La secuencia del plásmido ADN utilizando extensivamente un servicio de secuenciación de Sanger (como un núcleo o centro comercial). Preparar las muestras de ADN según las especificaciones del servicio. Cebadores utilizados con éxito en reacciones de secuenciación previa se observan en la tabla 4.
Nota: Debido a la amplificación por PCR del plásmido toda, la secuenciación de la región entera de la codificación PCSK9 se recomienda para cada mutante.
2. alto rendimiento base de Luciferase proteólisis ensayo
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Galjanoplastia de la célula (día 0)
- Utilizar células HEK293T de paso bajo para experimentos y una cultura de Dulbecco modificado medio de Eagle (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS). Realizar todo la célula de trabajo en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos hasta el momento de analizar la actividad de luciferasa. Estimar el número de pozos y las placas necesarias para el experimento, anticipando que transfecciones se realizará por triplicado para cada condición de prueba.
- Disociar las células HEK293T un frasco de padres tratándolos con un volumen mínimo de 0.05% tripsina-dihidratada del ácido (EDTA) para cubrir las células. Inactivación del tripsina-EDTA con 2 volúmenes de DMEM suplementado con 10% FBS y la transferencia de las células a un tubo estéril. Contar las células usando un contador de células automatizado (y la coloración con trypan azul). Centrifugar el tubo a 500 x g durante 5 minutos recuperar las células.
- Aspire el medio que contiene tripsina y reconstituir las células del medio de cultivo a una concentración de 2 x 105 células/mL. Usando una pipeta multicanal, transferir 100 μl de las células a cada pozo de una placa de 96 pocillos de blanco (opaco-abajo), que da una concentración final de siembra de 2 x 104 células/pozo.
Nota: Para los experimentos iniciales, puede ser útil además de semilla de una hermana, placa de 96 pocillos de fondo claro, con el fin de controlar el crecimiento celular y la adhesión durante el protocolo y la guía solución de problemas futuros. - Incube las células a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 h.
- Preparar un plato principal de plásmidos en un formato de 96 pozos. Diluir cada plásmido en tampón de elución (Tris-HCl, pH 8,5) a 50 ng/μL en un pozo individual de una placa de 96 pocillos.
- Preparar 4 pozos para el control positivo (WT) plásmido8de plásmido de control negativo (S386A)8y buffer libre de plásmido (para simulacros transfecciones). Si drogas u otros tratamientos a base de celular están siendo planeadas, preparan la placa principal con el plásmido de control positivo (WT) en cada pocillo, junto con 4 pozos de cada uno de los plásmidos de control negativo (S386A) y el tampón libre de plásmido.
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Transfección (día 1)
- Preparar la mezcla de transfección en un formato de placa de 96 pozos utilizando placas de deep-well de 96 pocillos. Realizar las transfecciones en triplicado, asegurándose de preparar los suficientes reactivos para tener en cuenta pérdidas de pipeteo y transferencia.
Nota: Los cálculos siguientes preparan suficiente reactivo para correr una placa de 96 pocillos en triplicado (Estimado conservador para 420 pozos).- Hacer una mezcla maestra de un reactivo de transfección de lípidos diluido, agregar 50,4 μL del reactivo a 2050 μl de suero reducido medio. Hacer una mezcla maestra de un reactivo de precomplexation de ADN, añadiendo 33,6 μl del reactivo en 1730 μl de suero reducido medio.
- Utilizando una pipeta multicanal, alícuota 16,8 μl de la mezcla de reactivo de precomplexation de ADN diluida en cada pocillo de la placa de la pozo profundo.
- Utilizando una pipeta multicanal, alícuota 3,2 μl (160 ng) de cada plásmido de la placa principal en cada pocillo de la placa de la pozo profundo.
- Usando una pipeta multicanal, alícuotas de 20 μl de la mezcla de reactivo de transfección lípidos diluido a cada bien de la placa y mezclar el contenido de cada pocillo utilizando la pipeta multicanal. Cubrir las placas y los deje reposar a temperatura ambiente (RT) por 10-15 min a formar complejos de lípidos: ADN.
Nota: En la transfección, los componentes finales por pocillo será como sigue: 40 ng de ADN, 0.12 μl de reactivo de transfección y 0.08 μl del ADN pre-complejación reactivo y el contenido de cada bien será 10 μl volumen total (suero reducido medio).
- Suavemente cambiar el medio en las células 293T en placas de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal, teniendo cuidado de no para romper las células. Reemplazar el medio aspirado con 95 μl de DMEM suplementado con 10% FBS.
Nota: Este sería un momento adecuado para tratar las células con cualquier fármaco de interés. - Añadir 10 μl de la mezcla de transfección a cada correspondiente bien mediante una pipeta multicanal. Agitar suavemente la placa para mezclar el contenido en los pozos. Incubar la placa a 37 ° C con 5% CO2 durante 24 h.
Nota: El volumen final de los pozos llega a 105 μl, para tener en cuenta para la evaporación más de 24 h.
- Preparar la mezcla de transfección en un formato de placa de 96 pozos utilizando placas de deep-well de 96 pocillos. Realizar las transfecciones en triplicado, asegurándose de preparar los suficientes reactivos para tener en cuenta pérdidas de pipeteo y transferencia.
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Ensayo (día 2)
- Preparar una solución stock de reactivos coelenterazine: ascorbato de sodio de 3 M [disuelto en tampón fosfato salino (PBS), preparado fresco] 5 M NaCl, 10 mg/mL de seroalbúmina bovina (BSA, disuelta en PBS, preparado fresco) y coelenterazine de 2 mM (disuelto en metanol acidificado con 200 μL de 3 HCl N / 10 mL).
Nota: El coelenterazine de 2 mM se puede almacenar por 2 semanas cuando se guarda a-80 ° C y en ausencia de luz. - Preparar los reactivos de x coelenterazine 2 para la lectura de la luciferasa, con un reactivo independiente de cada de las células y el medio, según la tabla 5. Primero se mezclan todos los reactivos excepto la coelenterazine, filtrar la mezcla a través de un filtro de jeringa 0,22 μm y agregue el coelenterazine. Proteger los reactivos de la luz hasta que están listos para añadirse a las placas.
Nota: Debido a la pérdida de la solución de filtración, hacer suficiente reactivo para tener en cuenta tanto la pérdida de filtración, así como de las transferencias. Tabla 5 muestra la concentración final de los reactivos 2 x (así como la cantidad de solución madre a añadir para leer una placa de 96 pocillos con un reactivo). - Eliminar las células de la incubadora 24 horas después de la transfección. Usando una pipeta multicanal, transfiera 50 μl de medio condicionado de cada pozo a una placa de 96 pocillos (opaca) fresca, con fondo blanco.
- Etiqueta de las placas en cuanto a si contienen células o medio. Si más de una placa de 96 pocillos se transfected, etiquete las placas para garantizar que cada placa de medio que contiene se empareja con su placa de la matriz de las células.
- Usando una pipeta multicanal, añada 50 μl de 2 x coelenterazine no lítico reactivo a la placa que contiene sólo medio condicionado. Suavemente balancee o agitar la placa en la ausencia de luz durante 5-10 min a TA.
- Usando una pipeta multicanal, añada 50 μl del reactivo de coelenterazine lítica de 2 x a la placa que contiene las células. Suavemente balancee o agitar la placa en la ausencia de luz durante 5-10 min a TA.
- Después de la incubación, lectura a la luminiscencia de la placa sólo por medio de un lector de placas. Luego, lee la luminiscencia de la placa que contiene la celda en el mismo lector de placas.
- Deseche las placas y guardar los archivos de análisis de datos.
- Preparar una solución stock de reactivos coelenterazine: ascorbato de sodio de 3 M [disuelto en tampón fosfato salino (PBS), preparado fresco] 5 M NaCl, 10 mg/mL de seroalbúmina bovina (BSA, disuelta en PBS, preparado fresco) y coelenterazine de 2 mM (disuelto en metanol acidificado con 200 μL de 3 HCl N / 10 mL).
3. Análisis de los datos
- Realizar un análisis de los datos iniciales utilizando el software de hoja de cálculo. Crear una hoja de cálculo que contiene los resultados de la célula y las placas de medio.
- Inspeccione manualmente los datos de las placas de la célula para identificar pozos mal transfected. Pozos que muestran < 5% - 10% de la lectura del plásmido de control negativo (S386A) se debe considerar como mal transfected, haciendo la interpretación de los datos sospechosos.
- Calcular la luminiscencia del fondo promedio de cada plato de los pozos transfected mock. Restar el fondo de cada plato de los valores de esa placa.
Nota: Este valor puede ser despreciable dependiendo del lector de placa utilizado. - Proceso de los datos mediante el cálculo de la proporción de actividad de luciferasa en el medio en comparación con el conjunto de la actividad luciferasa para cada pozo. Porque la placa de la célula contiene ambos medio condicionado además de las células, y la placa sólo medio contiene la misma cantidad de medio condicionado como la placa de la célula, es conveniente utilizar la siguiente ecuación:
Aquí, RLU = unidades de luminiscencia relativa, la lectura resta de fondo desde el lector de la placa. - Calcular la media luciferase secretado del control positivo (WT) y los pocillos de control negativo (S386A).
- Evaluar la calidad general del experimento mediante el cálculo de un factor Z de13:
Nota: Los valores activos provienen del control positivo (WT) y los valores inactivos vienen de los pozos de control negativo (S386A). Valores más cercanos a 1 indican una mayor calidad de experimental. Considere repetir el experimento u optimizar el flujo de trabajo si el valor es inferior a 0. - Transferir los datos desde el programa de hoja de cálculo en software de análisis de datos científicos.
- Normalizar la actividad de luciferasa secretada a los valores promedio de control positivo (WT) y el control negativo (S386A), ajuste el control positivo como 1 y el control negativo como 0.
- Limpiar los datos de outliers mediante el método de eliminación (derrota) de regresión y aislados, establecer la tasa máxima falso descubrimiento al 1%.
- Evaluar las diferencias estadísticamente significativas comparando los datos para cada condición mutante (o mutante) a la media de la actividad de la WT (normalizada a un valor de 1). Realizar múltiples desapareado t-tests, corrección de comparaciones múltiples con el método de Holm-Sidak y α = 0.05.
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Representative Results
El ensayo de proteólisis de alto rendimiento se basa en superar tres grandes retos. En primer lugar, para superar la salida intrínsecamente baja de una proteasa PCSK9 de solo volumen, una proteasa PCSK9 carecer la inhibitoria prodomain se utiliza, con la secuencia de escote en la cola de la prodomain vinculada a una luciferasa que puede ser secretada14. En segundo lugar, para satisfacer la necesidad de que la proteasa doblar en complejo con su inhibitoria prodomain, que los dos polipéptidos son coexpressed en trans en un contexto celular15,16, a través de un vector de bicistronic. En tercer lugar, para diferenciar la hendida del substrato uncleaved, se trunca la proteasa PCSK9 en C678, que impide la salida de la PCSK9 complejo desde el retículo endoplásmico (ER), pero no tiene efecto sobre la función proteolítica17,18 . Tomados en conjunto, esto permite una evaluación de la luciferase secretada como un proxy para la presencia y el grado de proteólisis PCSK9 (figura 1A). El plazo general del ensayo es corto, con los pasos de mutagénesis sitio-dirigida del vector del ensayo (días 1 - 2) seguido por transfección transitoria (día 3) y lectura del luciferase (día 4) todo completado en tan pronto como 4 días, con un tiempo mínimo "práctico" ( Figura 1B).
En general, este análisis permite la evaluación simultánea de la proteólisis PCSK9 bajo una variedad de condiciones, con la lectura de un ensayo de luciferasa. Después de la adquisición y procesamiento, los datos se pueden visualizar en formato tabla o mapa de calor. En particular, análisis mutacionales de codificación SNPs se adaptan bien a este enfoque. La figura 2 muestra un mapa de calor de una biblioteca de mutagénesis de saturación evaluar la especificidad de secuencia de escote de la proteasa PCSK9 en sitios substrato P6 a través de P6'. Los resultados muestran que la secuencia óptima de escote es esencialmente la misma que la secuencia de la WT (SSVFAQ | SIPWNL). En particular, la mutación de la P6 o P4 a P1' residuos es mal tolerado por la proteasa, consistente con la ranura de encuadernación poco profundas, hidrofóbico para estas posiciones en la estructura cristalina de los maduros, troceados PCSK9. Desde el punto de vista del desarrollo del inhibidor, este perfil de especificidad de secuencia estrecho es un hallazgo útil, como sugiere que ningún sustrato idealizado mimética podría desbancar la secuencia endógena del escote. La figura 3 muestra la actividad de escote relativa (frente a la WT) de una biblioteca de SNP sin sentido descrito en la clínica, trazado sobre la estructura primaria de PCSK9. De la 84 SNP evaluado, más la mitad mostró un cambio significativo en actividad en comparación con la proteasa de peso. Estos resultados sugieren que las alteraciones en la actividad proteolítica de PCSK9 son de hecho bastante común en la población clínica, y dichas modificaciones pueden ayudar a explicar la variabilidad en los niveles de colesterol LDL en la clínica.
Figura 1: Esquema general del ensayo de escote alto rendimiento en trans PCSK9. (A) este panel muestra un esquema bioquímico del análisis presentado aquí. El substrato consiste en la secuencia de la señal de PCSK9 (gris oscuro) y el prodomain (rojo) vinculados a la luciferasa que puede ser secretada (NLuc, verde) por la secuencia de escote PCSK9 (amarillo). La proteasa consiste en la secuencia de la señal (gris oscuro), el dominio catalítico (gris claro) y cisteina-histidina Rico (CHR) dominio que contiene la base de C679X. El par de sustrato-proteasa es coexpressed en cantidades estequiométricas en un vector de bicistronic basada en 2A, susceptible de manipulación genética. Coexpression, la proteasa y sustrato Co doblan y permanecen secuestradas en el retículo endoplásmico (ER). Con actividad de la hendidura, la luciferasa es liberada del complejo y segregada, donde pueden ser detectado por el ensayo de luciferasa de medio condicionado. Perturbaciones posibles a la actividad de escote incluyen, pero no se limitan a la manipulación genética (perturbación A) o la presencia de pequeñas moléculas (perturbación B). (B) este panel muestra la línea de tiempo para el ensayo general. Mutagénesis sitio-dirigida en el plásmido de peso se realiza en días -1 y 0, seguido de la transfección en el día 1 y el ensayo de luciferasa en el día 2, para un tiempo total de 4 días. Esta figura ha sido adaptada de Chorba et al. 8. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: secuencia de la especificidad de la proteasa PCSK9. (A) este mapa muestra la actividad proteolítica, normalizado a fondo y peso, para cada mutante solo aminoácido de una biblioteca de mutagénesis de saturación de la P6 a través de P6' secuencia de escote. La identidad de secuencia WT se muestra en la parte inferior, con los valores de la secuencia WT se muestra tanto en la parte superior y resaltada en rectángulos blancos. Un valor de 0 (negro) indica actividad de fondo y un valor de + 1 (verde) indica el valor del peso. (B) este calor mapa muestra la desviación estándar de los valores de la proteólisis de la misma biblioteca de mutagénesis de saturación, con valores más bajos en negros y más altos valores en rojo. Los valores en rectángulos blancos discontinuas representan mutantes que mostró valores significativamente diferentes de la proteólisis de la de la proteasa de peso, según Holm-Sidak corrige, t-pruebas con α < 0.05. Los datos mostrados son de 3 experimentos independientes, cada una con 3 repeticiones. Esta figura ha sido adaptada de Chorba et al. 8. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: efectos del SNPs PCSK9 en función proteolítica. (A) este panel muestra la estructura primaria de PCSK9, que contiene la secuencia de señal (SS; contorno negro), el prodomain (contorno rojo), el dominio catalítico (contorno gris) y la histidina cisteína rico dominio (CHR; contorno azul). (B) este panel muestra la ubicación de SNPs clínicas 84 (rectángulos amarillos con líneas negras) en el ensayo de proteólisis, asignado a la estructura primaria. (C) este panel muestra los valores de los 47 SNPs con actividad proteolítica significativamente alterada en comparación con la proteasa de peso, según Holm-Sidak corrige desapareado t-pruebas con α < 0.05. Los valores se asignan a la estructura primaria de PCSK9, con un valor de -1 (rojo) que indica no actividad proteolítica y un valor de + 1 (cian) que indica una mejoría 2 veces sobre la proteasa de peso. Esta figura ha sido adaptada de Chorba et al. 8. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: diseño de cartilla PCR dirigida mutagénica. Cebadores PCR tienen parcialmente superposición de secuencias, según el diseño mostrado. Se muestra un ejemplo de un par de exitoso primer debajo de la mesa. Haga clic aquí para descargar este archivo.
| Componente | Stock | Volumen (μL) | Final |
| Ultrapura H2O | 17.5 | volumen total de 25 μl | |
| Tampón de reacción de polimerasa | 5 X | 5 | 1 X |
| Deoxynucleótidos (dNTPs) por | 200 ΜM | 0.5 | 4 ΜM |
| Plantilla (wild-type (WT)) | 2 ng/μl | 0.5 | 1 ng (total) |
| Cartilla (Fwd) | 20 ΜM | 0.625 | 500 nM |
| Cartilla (Rev) | 20 ΜM | 0.625 | 500 nM |
| DNA polimerasa de alta fidelidad | 2 U/ΜL | 0.25 | 0.5 U (total) |
Tabla 2: componentes de un PCR para mutagénesis sitio-dirigida. Los componentes se deben agregar en el orden en que se enumeran, con la mezcla que se mantuvo en hielo hasta que la reacción comience.
| Paso | Temp (° C) | Tiempo | |
| Desnaturalización inicial | 1 | 98 | 30 s |
| Desnaturalización | 2 | 98 | 10 s |
| De recocido | 3 | (Plantilla de mdel T) * + 1 | 20 s |
| Extensión | 4 | 72 | 30 s/kilobase (kb) (4 min) |
| Ciclismo | 5 (ir al paso 2, total de 35 ciclos) | ||
| Extensión final | 6 | 72 | 5 min |
| Mantenga | 7 | 12 | Mantenga |
| * - Elegir la T inferiorm plantilla de par de la cartilla | |||
Tabla 3: parámetros de ciclismo sugeridos para la PCR. Los parámetros sugeridos representan un buen punto de partida, pero pueden requerir optimización.
| Cartilla de | Ubicación de recocido | Secuencia (5' a 3') |
| 1 | Promotor del CMV | CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG |
| 2 | PCSK9 A95 | TCTCGCAGTCAGAGCGCAC |
| 3 | C-terminal de NLuc | TGTGCGAACGCATTCTGGCG |
| 4 | PCSK9 C301 | GCCAGCGCCTGGCTAGG |
| 5 | E501 PCSK9 | GAGGCCCAAGGGGGCAAG |
Tabla 4: validado iniciadores para la secuenciación de. Cada primer se ha utilizado con éxito en la región de la codificación de la plásmidos que se hace referencia en este método de secuenciación.
| Componente (stock) | No-líticas (medio) | Líticas (células) | Cantidad de 96 pocillos (1 plato) |
| Ascorbato de sodio (3 M) | 300 mM | 300 mM | 700 ΜL |
| NaCl (5 M) | 5 mM | 5 mM | 7 ΜL |
| BSA (10 mg/mL, de 1%) | 0.10% | - | 700 ΜL |
| Triton X-100 | - | 0.10% | 7 ΜL |
| PBS | A 50 μL/pocillo | A 50 μL/pocillo | A 7000 μl |
| Filtrar por membrana de 0.22 μm y transferencia 5880 μl del filtrado en el tubo fresco | |||
| Coelenterazine (2 mM) | 40 ΜM | 40 ΜM | 120 ΜL |
| Volumen total: 6000 μl | |||
Tabla 5: componentes de 2 reactivos de x coelenterazine para lecturas de luciferase. Reactivos no lítica y líticos se requieren para cada pozo que se analiza, con el fin de evaluar por separado el medio condicionado y las células transfected. Los reactivos se mezclan y se filtra antes de la adición de la coelenterazine. Después de la adición de coelenterazine, proteger el reactivo de la luz hasta que esté listo para su uso.
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Discussion
Los procedimientos experimentales descritos presentan un método para superar la actividad intrínsecamente baja de la facturación única proteasa PCSK9 y evaluar su función proteolítica de forma robusta. El concepto clave del análisis se basa en convertir un evento de facturación solo en una lectura enzimático amplificado. Las fortalezas del análisis incluyen el relativamente poco tiempo y facilidad de uso del reportero de luciferasa, así como su escalabilidad a los enfoques de alto rendimiento. Además, el ensayo evalúa la proteólisis en su contexto nativo, celular. Además, con este análisis, los SNPs identificados clínicamente pueden evaluarse por sus efectos sobre la proteólisis PCSK9 sin necesidad de cualquier tejido humano o paciente; sólo el conocimiento del genotipo de interés es necesario.
Existen varias limitaciones técnicas del ensayo. Aunque el ensayo evalúa la proteólisis dentro de la célula, se requiere también una sobreexpresión del vector. Dado que el ensayo requiere los transitorios de la transfección de la línea de células HEK293T, eficiencia de transfección se suma a la variabilidad intrínseca de pozo a pozo. Mientras que la proteasa muertos S386A PCSK9 sirve como control negativo para la proteólisis, también sirve como control positivo para la transfección, ya que estas células producen funcional, aunque atrapada intracelularmente, luciferasa. Evaluar los datos crudos de las placas celulares ayuda a identificar esas células con brutas variaciones en la eficiencia de transfección y estos datos pueden ser desechados (y el experimento repetido si lo desea). Además, procesar los datos de la proporción de luciferase secretada de la luciferase total producida ayuda a ajustar las variaciones más pequeñas en entrega de plásmido y producción transcripcional. Tales variaciones se espera afectar las salidas de la luciferasa de las células y el medio condicionado de manera similar. Además, los vectores utilizados para este análisis son susceptibles a la formación de líneas celulares estables inducibles, isogénicas con la línea de Flp-In T-Rex 293 disponible comercialmente, que se ha empleado con éxito como un medio para eludir el requisito de mediada por lípidos transfección. Esto suele ser una característica atractiva al aplicar el análisis a un screening de moléculas pequeñas inhibidores de proteólisis PCSK9. Hasta la fecha, no se han identificado tales inhibidores de seguir subrayando la importancia de este ensayo.
La ingeniería de la proteasa PCSK9 también crea varias limitaciones biológicas. En primer lugar, el ensayo mide intermoleculares PCSK9 proteólisis, en lugar de la proteolisis intramolecular que ocurre con la WT PCSK9. Mientras que estas dos actividades se correlacionan generalmente, es poco probable que tal correlación existe en todas las situaciones biológicas y, así, en algunas situaciones, la verificación de estos efectos en una hendidura en cis PCSK9 ensayo, probablemente por un método alternativo como inmunoblot, puede ser necesaria. Además, el ensayo sólo puede evaluar sin sentido SNPs (y no el efecto de las variaciones no codificante). Por último, aunque PCSK9 proteólisis es el paso tarifa-limitador de PCSK9 secreción, y se espera que la reducción de la proteólisis PCSK9 causa una variante de PCSK9 de pérdida de función (relación con el fenotipo clínico de colesterol), esto no es cierto para todos los SNPs, indicando que por lo menos para algunas mutaciones, biología adicional es en el juego8.
La utilidad de este ensayo radica en su capacidad para evaluar la función proteolítica de una proteasa intrínsecamente baja producción. Estos conceptos de diseño deben traducir a proteasas distintas PCSK9 que sufren problemas similares. Para realizar esta modificación, es necesario mantener la relación entre la secreción de escote y luciferasa. Una estrategia donde el sustrato es reemplazado con un tipo y anclaje de membrana vinculadas a la luciferasa, a través de una secuencia de escote específica de la proteasa de interés debe cumplir con este requisito.
En Resumen, este protocolo describe un método para evaluar PCSK9 proteólisis de un modo de alto rendimiento. Este método será útil tanto para evaluar el efecto de clínicas SNPs en PCSK9 proteólisis, así como para la detección de moléculas pequeñas inhibidores de PCSK9.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen el apoyo financiero generoso del NHLBI/NIH (HL124068 K08 y LRP HMOT1243), NCATS/NIH a través de la UCSF clínica y traslacional Instituto catalizador programa de ciencia (UL1 TR000004), el Senado académico de la UCSF, la Fundación Hellman, un Gilead Sciences Research Scholar Award, un premio Cardiovascular Pfizer ASPIRE (todos John S. Chorba) y el Howard Hughes Medical Institute (a Adri M. Galván y Kevan M. Shokat).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
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