Summary
ويقدم هذا البروتوكول وسيلة لتقييم نشاط proteolytic حوزتي دوران جوهريا منخفضة النشاط، وواحدة في سياق خلوية. على وجه التحديد، يتم تطبيق هذا الأسلوب لتقييم نشاط بروتيوليتيك PCSK9، محرك رئيسي استقلاب الدهن نشاطها proteolytic مطلوب لوظيفتها هايبرتشوليستيروليميك في نهاية المطاف.
Abstract
كونفيرتاسي بروبروتين سوبتيليسين/كيكسن نوع 9 (PCSK9) هو حوزتي واحدة--دوران الذي ينظم مستويات المصل low-density lipoprotein (LDL)، ومن ثم أمراض القلب والأوعية الدموية. على الرغم من أن بروتيوليسيس PCSK9 مطلوب لأثره الكامل hypercholesterolemic، تقييم وظيفتها proteolytic التحدي: PCSK9 المعروف فقط تهزم نفسها، ويخضع لدوران واحد فقط، وبعد بروتيوليسيس، يحتفظ به الركيزة في موقعها النشط كسيارات-المانع. تصف الأساليب المعروضة هنا تحليل الذي يتغلب على هذه التحديات. التحليل يركز على proteolysis الجزيئات في إطار يستند إلى الخلية والانقسام الروابط الناجحة للنشاط يفرز لوسيفراس، والتي يمكن قراءتها بسهولة على المديين المتوسط ومكيفة. عبر خطوات متسلسلة من الطفرات وتعداء عابرة، وقراءات لوسيفراس، يمكن التحقيق المقايسة بروتيوليسيس PCSK9 تحت ظروف من اضطراب أو الوراثية الجزيئية في طريقة الفائق. هذا النظام أيضا مناسبة لكل تقييم البيوكيميائية مغلطه سريرياً اكتشفت واحد-النوكليوتيدات مجمع الأشكال المتعددة (بطانات)، كذلك فيما يتعلق بفحص مثبطات جزيء صغير من بروتيوليسيس PCSK9.
Introduction
PCSK9 يستهدف مستقبلات LDL (LDL-R) لتدهور، ورفع مستوى الكولسترول الضار (LDL-C) والقيادة أمراض القلب تصلب الشرايين1،2. قوة PCSK9 علاجية تستهدف خفض LDL-C وتحسين نتائج القلب والأوعية الدموية للمرضى، حتى عند إضافة علاج خفض الدهن عدوانية مع statins3،4. بيد أن العلاجات المعتمدة حاليا تقتصر على النهج القائم على الأجسام المضادة، وتعاني من نقص في الفعالية من حيث التكلفة5،6. لحل هذه المشكلة، هناك حاجة إلى بدائل علاجية أقل تكلفة، ووسيلة لتحديد المرضى الذين يحتمل أن الحصول على قدر أكبر من الفوائد، أو كليهما،.
النهج جزيء صغير يمكن أن تستهدف PCSK9 داخل الخلايا وتقدم عن طريق تحسين الإدارة وتخفيض التكاليف، وجعلها "الكأس المقدسة" في هذا المجال7. ومع ذلك، أثبت PCSK9 صعبة للمخدرات بالجزيئات الصغيرة. كما حوزتي، استهداف الدالة بروتيوليتيك PCSK9 لاستراتيجية جذابة، كما proteolysis المتمتعة بالحكم الذاتي هي الخطوة الحد من معدل نضج PCSK98 ومطلوب لأثره القصوى على LDL-ص9. حتى الآن، إلا أن هذه الاستراتيجية لم تكن ناجحة، يرجح أن سبب الكيمياء الحيوية الفريدة في PCSK9: PCSK9 كليفس سوى نفسه10، القيام بفعل واحد--دوران، وبعد المتمتعة بالحكم الذاتي-الانقسام، PCSK9 برودومين تظل ملزمة في الموقع النشط مثبط للسيارات11، منع قراءات من أي نشاط آخر في حوزتي.
تقدم هذه المقالة طريقة لتقييم دالة PCSK9 proteolytic في أزياء الفائق8. من خلال موقع الموجه الطفرات، يمكن استخدام المحققين هذا الفحص للتحقيق في آثار الترميز بطانات وجدت في العيادة تقييم هذه الآثار في بروتيوليسيس، هذه الخطوة الحد من معدل نضج PCSK9. بالإضافة إلى ذلك، سوف تكون هذه الطريقة مفيدة في تصميم شاشات الفائق لتحديد المغيرون بروتيوليسيس PCSK9، التي يتوقع أن في نهاية المطاف تعطيل عرض PCSK9 إلى LDL-R (وتعدل تأثير hypercholesterolemic PCSK9 's) . وأخيراً، هذا البروتوكول يمكن تكييفه البروتياز الأخرى مع جوهرها قلة النشاط، شريطة أن ط) زوج حوزتي الركازة محددة ويمكن الاطلاع على، والثاني) رابط داخل الخلايا مناسبة يمكن أن تنشأ للركيزة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-موقع الموجه الطفرات حوزتي المتجهات
- تصميم وترتيب النوكليوتيد تجميع مخصص لتثبيت طفرة الاهتمام باستخدام تعديل البروتوكولات القياسية الطفرات الموجهة الموقع12. كبسولة تفجير ديسالتيد القياسية (بدون تنقية إضافية) مقبولة تماما.
ملاحظة: نهج عام للتصاميم التمهيدي يتضمن إنشاء الإشعال متداخلة جزئيا كما هو مبين في الجدول 1، باستخدام آلة حاسبة درجة حرارة (Tm) ذوبان محددة إلى بوليميريز للفائدة. - إعداد بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (تقارير إتمام المشروعات) للطفرات موقع الموجه على الجليد، كما هو مبين في الجدول 2.
- دورة تقارير إتمام المشروعات كما هو مبين في الجدول 3.
- تشغيل 2-5 ميليلتر من كل بكر على 1% [اغروس] هلام ووضع تصور للمنتجات لتأكيد تضخيم نجاح.
ملاحظة: سوف تظهر PCR ناجح عصابة الحمض النووي واحد، بارزة في العلامة الحجم التقريبي للقالب (~7.8 كيلو بايت). - إضافة 0.5 ميليلتر (لكل رد فعل 25-ميليلتر) من دبني واحتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية ح 1.
- تحويل 2 ميليلتر من رد الفعل إلى كيميائيا المختصة الإشريكيّة القولونية.
ملاحظة: سلالة كولاي تنمو بسرعة سوف يقلل مرات الحضانة، ولكن أي سلالة الاستنساخ يكون مقبولاً. - لوحة التحولات على أجار بيرتاني لوريا (رطل) الذي يحتوي على 50-100 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- حدد المستعمرات 2-4 أن ينمو في ظل ثقافة صغيرة (2-5 مل متوسطة رطل مع 50-100 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين). احتضان ثقافة عند 37 درجة مئوية عند 220 دورة في الدقيقة حتى أنه عكر.
- عزل بلازميد الحمض النووي من الخلايا باستخدام مجموعة أدوات تنقية (أي، "مينيبريب") الحمض النووي بلازميد وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. قياس تركيز الحمض النووي الوتيد استخدام جهاز المطياف الضوئي ميكروفولومي.
- التسلسل بلازميد الحمض النووي على نطاق واسع باستخدام خدمة تسلسل سانجر (مثل الأساسية أو منشأة تجارية). إعداد عينات الحمض النووي طبقاً للمواصفات الخاصة بالخدمة. تتم الإشارة إلى الإشعال المستخدمة بنجاح في ردود الفعل السابقة التسلسل في الجدول 4.
ملاحظة: بسبب التضخيم بكر من بلازميد كامل، ينصح تسلسل المنطقة بأكملها PCSK9 الترميز لكل متحولة.
2-الفائق على أساس لوسيفراس بروتيوليسيس الإنزيم
-
خلية الطلاء (يوم 0)
- استخدام خلايا HEK293T مرور منخفضة لتجارب وثقافة في دولبيكو لتعديل النسر المتوسطة (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS). أداء كل خلية العمل تحت ظروف معقمة في غطاء زراعة الأنسجة حتى جاهزة الاعتداء بنشاط لوسيفراس. ويقدر عدد الآبار والصفائح اللازمة للتجربة، توقع أن ترانسفيكشنز سوف تتم في ثلاث نسخ لكل حالة اختبار.
- ننأى بالخلايا HEK293T من قارورة أصل بمعاملتها مع كمية ضئيلة من 0.05% حمض التربسين-الإيثيلين (يدتا) لتغطية الخلايا. إلغاء تنشيط التربسين-يدتا مع وحدات التخزين 2 من دميم وتستكمل مع 10% FBS ونقل الخلايا إلى أنبوب عقيمة. عد الخلايا باستخدام عداد الآلي خلية (وتلطيخ مع تريبان الأزرق). الطرد المركزي الأنبوب في 500 x ز لمدة 5 دقائق لاستعادة الخلايا.
- نضح المتوسطة المحتوية على التربسين وتشكيل الخلايا في المتوسط الثقافة إلى تركيز من 2 × 105 خلايا/مل. استخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 100 ميليلتر من الخلايا لكل بئر من لوحة 96-بئر الأبيض (كامد-أسفل)، الذي يعطي تركيز بذر نهائي من 2 × 104 خلايا/جيدا.
ملاحظة: لإجراء تجارب أولية، قد يكون من المفيد أن البذور بالإضافة إلى ذلك الأخت، واضحة-أسفل لوحة 96، حسنا، بغية رصد نمو الخلايا وتمسك خلال المراسم ودليل المستقبل استكشاف الأخطاء وإصلاحها. - احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 24 ساعة.
- إعداد لوحة رئيسية من البلازميدات في شكل 96-جيدا. تمييع كل بلازميد في شطف المخزن المؤقت (تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 8.5) إلى 50 نانوغرام/ميليلتر في بئر فردية من صفيحة 96-جيدا.
- إعداد كل 4 آبار ل بلازميد السيطرة الإيجابية (WT)8، بلازميد مراقبة سلبية (S386A)8، وخالية من بلازميد المخزن المؤقت (بالنسبة ترانسفيكشنز وهمية). إذا كانت المخدرات أو غيرها من العلاجات المستندة إلى الخلوي ويجري التخطيط، ثم إعداد اللوحة الرئيسية مع بلازميد السيطرة الإيجابية (WT) في كل بئر، جنبا إلى جنب مع 4 آبار كل بلازميد مراقبة سلبية (S386A) وخالية من بلازميد المخزن المؤقت.
-
تعداء (1 يوم)
- إعداد الخليط تعداء في شكل لوحة 96-جيدا باستخدام لوحات 96-بئر من الآبار العميقة. تؤدي ترانسفيكشنز في ثلاث نسخ، ويجري التأكد من إعداد الكواشف ما يكفي لحساب الخسائر بيبيتينج ونقل.
ملاحظة: إعداد الحسابات التالية كاشف ما يكفي لتشغيل لوحة 96-بئر واحدة في ثلاث نسخ (تقدير متحفظ لآبار 420).- جعل مزيج رئيسي من كاشف تعداء الدهون المخفف، إضافة 50.4 ميليلتر من الكاشف إلى 2050 ميليلتر من المصل خفض المتوسطة. جعل مزيج رئيسي من كاشف بريكومبليكسيشن الحمض النووي، مشيراً إلى 33.6 ميليلتر من الكاشف في 1730 ميليلتر من المصل خفض المتوسطة.
- استخدام ماصة متعددة القنوات، الكوة ميليلتر 16.8 من خليط كاشف بريكومبليكسيشن الحمض المخفف في كل بئر من الآبار العميقة لوحة.
- استخدام ماصة متعددة القنوات، اليكووت 3.2 ميليلتر (160 ng) لكل بلازميد من اللوحة الرئيسية إلى كل بئر من الآبار العميقة لوحة.
- استخدام ماصة متعددة القنوات، الكوة ميليلتر 20 من خليط كاشف تعداء الدهون المخفف لكل جيد من اللوحة وتخلط محتويات كل جيدا باستخدام ماصة متعددة القنوات. تغطي اللوحات، والسماح لهم بالجلوس في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10-15 دقيقة لنموذج المجمعات الدهن: الحمض النووي.
ملاحظة: عند تعداء، المكونات النهائية الواحدة وكذلك ستكون على النحو التالي: 40 نانوغرام من الحمض النووي و 0.12 ميليلتر من تعداء كاشف 0.08 ميليلتر من كاشف كومبليكساتيون قبل الحمض النووي، ومحتوى كل منها سيكون جيدا 10 ميليلتر في الحجم الإجمالي (المصل خفض متوسط).
- تبادل بلطف المتوسطة على الخلايا 293T في لوحات 96-كذلك استخدام ماصة متعددة القنوات، مع الحرص على عدم تعطيل الخلايا. استبدال المتوسطة يستنشق مع 95 ميليلتر من دميم وتستكمل مع 10% FBS.
ملاحظة: هذا سيكون وقتاً مناسباً لعلاج الخلايا مع أي مخدر للفائدة. - إضافة 10 ميليلتر من خليط تعداء لكل مناسبة جيدا عن طريق ماصة متعددة القنوات. بلطف دوامة لوحة لخلط المحتويات في الآبار. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ل 24 ساعة.
ملاحظة: وحدة التخزين النهائي من الآبار يأتي إلى 105 ميليلتر، لحساب التبخر أكثر من 24 ساعة.
- إعداد الخليط تعداء في شكل لوحة 96-جيدا باستخدام لوحات 96-بئر من الآبار العميقة. تؤدي ترانسفيكشنز في ثلاث نسخ، ويجري التأكد من إعداد الكواشف ما يكفي لحساب الخسائر بيبيتينج ونقل.
-
الفحص (اليوم 2)
- تعد حلاً أسهم الكاشفات كولينتيرازيني: اسكوربات الصوديوم م 3 [حله في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، أعدت طازجة] وكلوريد الصوديوم م 5، 10 ملغ/مل ألبومين المصل البقري (جيش صرب البوسنة؛ وتم حله في برنامج تلفزيوني، أعدت طازجة) وكولينتيرازيني 2 مم (حله في والميثانول المحمضة تحتوي على 200 ميليلتر من 3 N HCl كل مل 10).
ملاحظة: يمكن تخزين كولينتيرازيني 2 مم لمدة أسبوعين عندما يتم الاحتفاظ في-80 درجة مئوية، وفي غياب الضوء. - إعداد 2 x coelenterazine الكواشف لقراءات لوسيفراس، مع كاشف منفصلة كل الخلايا والمتوسطة، وفقا الجدول 5. تخلط جميع الكواشف احفظ كولينتيرازيني أولاً، تصفية الخليط من خلال عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر ثم قم بإضافة كولينتيرازيني. حماية الكواشف من الضوء حتى أنهم على استعداد لإضافة إلى اللوحات.
ملاحظة: بسبب فقدان الحل من الترشيح، جعل كاشف ما يكفي لحساب الخسائر في كلا من الترشيح، وكذلك من عمليات النقل. ويبين الجدول 5 تركيز النهائي من الكواشف 2 x (فضلا عن مقدار حل الأسهم إضافة إلى تلا لوح واحد 96-جيدا مع كاشف واحد). - إزالة الخلايا من الحاضنة 24 ساعة بعد تعداء. استخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 50 ميليلتر من المتوسطة مكيفة من كل بئر لصفيحة 96-جيدا (معتم) الطازجة والقاع الأبيض.
- قم بتسمية لوحات فيما يتعلق بما إذا كانت تحتوي على المتوسط أو الخلايا. إذا كان ترانسفيكتيد أكثر من 96-جيدا لوحة، تسمية لوحات لضمان أن كل لوحة تحتوي على المتوسط هو يقترن به طبق الأصل من الخلايا.
- استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 50 ميليلتر من 2 × كاشف كولينتيرازيني غير الحال إلى اللوحة التي تحتوي على فقط مكيفة المتوسطة. روك بلطف أو اهتزاز اللوحة في غياب الضوء لمدة 5-10 دقيقة في الرايت
- استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 50 ميليلتر من كاشف كولينتيرازيني الحال x 2 إلى اللوحة التي تحتوي على الخلايا. روك بلطف أو اهتزاز اللوحة في غياب الضوء لمدة 5-10 دقيقة في الرايت
- بعد الحضانة، وقرأ التﻷلؤ لصفيحة متوسطة فقط في قارئ لوحة. بعد ذلك، تلا التﻷلؤ اللوحة التي تحتوي على خلايا في نفس القارئ لوحة.
- تجاهل اللوحات وحفظ الملفات لتحليل البيانات.
- تعد حلاً أسهم الكاشفات كولينتيرازيني: اسكوربات الصوديوم م 3 [حله في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، أعدت طازجة] وكلوريد الصوديوم م 5، 10 ملغ/مل ألبومين المصل البقري (جيش صرب البوسنة؛ وتم حله في برنامج تلفزيوني، أعدت طازجة) وكولينتيرازيني 2 مم (حله في والميثانول المحمضة تحتوي على 200 ميليلتر من 3 N HCl كل مل 10).
3-بيانات التحليل
- القيام بتحليل بيانات أولية استخدام برامج جداول البيانات. إنشاء جدول يحتوي على النتائج من الخلية ولوحات متوسطة الحجم.
- يدوياً فحص البيانات من لوحات الخلية لتحديد آبار transfected سيئة. الآبار التي تظهر < 5%-10% من قراءات بلازميد مراقبة سلبية (S386A) ينبغي النظر سيئة كما ترانسفيكتيد، مما يجعل تفسير تلك البيانات المشتبه فيه.
- حساب التﻷلؤ متوسط الخلفية لكل لوحة من آبار transfected وهمية. قم بطرح الخلفية لكل لوحة من قيم تلك اللوحة.
ملاحظة: قد تكون هذه القيمة لا يعتد بها تبعاً للقارئ لوحة المستخدمة. - عملية البيانات عن طريق حساب نسبة النشاط لوسيفراس في المتوسط مقارنة بالنشاط لوسيفراس الشاملة لكل بئر. لوحة الخلية يحتوي على كلا المتوسطة مكيفة بالإضافة إلى الخلايا، ولوحة المتوسطة فقط يحتوي على نفس الكمية من المتوسطة المكيفة كلوحة الخلية، فمن المناسب استخدام المعادلة التالية:
هنا، رلو = وحدات التﻷلؤ النسبي، وقراءات مطروحاً على خلفية من قارئ لوحة. - حساب لوسيفراس يفرز يعني سيطرة إيجابية (وزن)، وآبار مراقبة سلبية (S386A).
- تقييم الجودة الشاملة للتجربة عن طريق حساب معامل Z13:
ملاحظة: القيم النشطة التي تأتي من عنصر التحكم الإيجابي (WT) والقيم غير النشطة التي تأتي من آبار المراقبة السلبية (S386A). تشير القيم أقرب إلى 1 إلى أعلى جودة تجريبية. النظر في تكرار التجربة أو تحسين سير العمل إذا كانت القيمة أقل من 0. - نقل البيانات من برنامج جداول البيانات إلى برمجيات تحليل البيانات العلمية.
- تطبيع بالنشاط لوسيفراس يفرز القيم الوسطية في مراقبة إيجابية (WT) ومراقبة سلبية (S386A)، وضع عنصر التحكم الإيجابي 1 ومراقبة سلبية ك 0.
- تنظيف البيانات للقيم المتطرفة باستخدام الأسلوب إزالة (هزيمة) الانحدار والخارجة، تحديد معدل اكتشاف كاذبة كحد أقصى إلى 1%.
- تقييم لفروق معتد بها إحصائيا بمقارنة البيانات الخاصة بكل حالة المسخ (أو متحولة) يعني النشاط WT (تطبيع إلى قيمة 1). أداء متعددة مزاوج تي-الاختبارات، تصحيح لمقارنات متعددة باستخدام أسلوب هولم-سيداك و α = 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
والرزن proteolysis الفائق يعتمد على التغلب على التحديات الرئيسية الثلاثة. أولاً، للتغلب على إخراج متدنية ارتباطاً وثيقا حوزتي PCSK9 واحد--دوران، حوزتي PCSK9 تفتقر المثبطة برودوماين يستخدم، مع تسلسل الانقسام في ذيل برودوماين ترتبط لوسيفراس يمكن أن يفرز14. ثانيا، لتلبية الحاجة إلى حوزتي أمثال المعقدة مع به المثبطة برودومين، البروتينية اثنين كويكسبريسيد في ترانس في سياق خلوية15،16، عن طريق ناقل بيسيسترونيك. ثالثا، التفريق في ملصوق من الركازة أونكليفيد، يتم اقتطاع البروتياز PCSK9 في C678، الذي يمنع خروج PCSK9 معقدة من هيولى (ER) ولكن ليس له تأثير على وظيفة بروتيوليتيك17،18 . أخذت معا، وهذا يسمح لتقييم لوسيفراس يفرزها كوكيل للوجود ودرجة من PCSK9 بروتيوليسيس (الشكل 1A). الإطار الزمني العام للمقايسة قصيرة، مع خطوات الطفرات موقع توجيه ناقل المقايسة (الأيام 1-2) تليها تعداء عابرة (اليوم الثالث) ولوسيفراس قراءات (يوم 4) جميع الانتهاء في أسرع وقت 4 أيام، مع الحد الأدنى من الوقت "العملي" ( الشكل 1B).
عموما، يسمح هذا الفحص لتقييم المتزامن بروتيوليسيس PCSK9 تحت مجموعة متنوعة من الظروف، مع قراءات به الإنزيم لوسيفراس. بعد اقتناء وتجهيز، يمكن تصور البيانات في تنسيق جدولي أو خريطة الحرارة. على وجه الخصوص، حيث تحليلات للترميز بطانات مناسبة تماما لهذا النهج. ويبين الشكل 2 خريطة حرارة لمكتبة الطفرات تشبع تقييم خصوصية حوزتي PCSK9 في مواقع الركازة P6 P6 عبر تسلسل الانقسام '. وتبين النتائج أن تسلسل الانقسام والأمثل هو أساسا نفس تسلسل WT (سففاق | سيبونل). أن الطفرة P6 أو P4 خلال P1 وخاصة ' مخلفات سيئة يتسامح بحوزتي، متسقة مع الاخدود ملزمة ضحلة، مسعور لهذه المواقف في هيكل الكريستال ناضجة، المشقوق PCSK9. من وجهة نظر التنمية المانع، الشخصية خصوصية ضيقة تسلسل هذا استنتاج مفيدة، كما أنه يوحي بأن لا الركازة المثالية ميميتيك يمكن أن أووتكومبيتي تسلسل الانقسام والذاتية. ويبين الشكل 3 نشاط الانقسام النسبي (مقارنة WT) مكتبة بطانات مغلطه الموصوفة في العيادة، رسمت على الهيكل الأساسي PCSK9. بطانات 84 تقييمها، ما يزيد على نصف أظهرت تغيرا كبيرا في النشاط مقارنة بحوزتي WT. هذه النتائج تشير إلى أن التعديلات في النشاط PCSK9 proteolytic شائعة جداً في الواقع في السكان السريرية، وهذه التعديلات قد تساعد على تفسير التغير في مستويات الكولسترول LDL ينظر في العيادة.
الشكل 1: عموما التخطيطي للمقايسة الانقسام الفائق في ترانس PCSK9. (أ) يظهر هذا الفريق تخطيطي بيوكيميائية للمقايسة المقدمة هنا. الركيزة يتكون من تسلسل إشارة PCSK9 (رمادي داكن) وتتصل برودومين (الأحمر) لوسيفراس التي يمكن أن تكون (نلوك، الأخضر) يفرزها تسلسل الانقسام PCSK9 (أصفر). حوزتي يتكون من تسلسل إشارة (رمادي داكن) والمجال حفاز (رمادي فاتح) والمجال (لجنة حقوق الإنسان) الحامض الأميني سيستين الغنية التي تتضمن اقتطاع C679X. هو كويكسبريسيد زوج حوزتي الركيزة في مبالغ المقايسة في ناقل على أساس 2A بيسيسترونيك، قابلة للتلاعب بالجينات. عند كوكسبريشن، بحوزتي والركيزة أمثال المشترك ويظل معزولاً في هيولى (ER). مع نشاط الانقسام، وتحررت من المجمع لوسيفراس ويفرز، حيث أنه يمكن الكشف عنها بواسطة الإنزيم لوسيفراس المتوسطة مكيفة. تشمل الاضطرابات المحتملة للنشاط الانقسام، ولكن لا تقتصر على، التلاعب بالجينات (اضطراب A) أو وجود جزيئات صغيرة (اضطراب ب). (ب) هذا الفريق يظهر المخطط الزمني للفحص الشامل. يتم تنفيذ موقع الموجه الطفرات في بلازميد WT الأيام-1 و 0، تليها تعداء يوم 1 والتحليل لوسيفراس في اليوم الثاني، لوضع جدول زمني إجمالي 4 أيام. وهذا الرقم قد تم تكييفه من تشوربا et al. 8- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تسلسل خصوصية حوزتي PCSK9. (أ) تظهر هذه الخريطة الحرارة النشاط بروتيوليتيك، وتطبيع للخلفية ووزن، لكل واحد من الأحماض الأمينية متحولة من مكتبة الطفرات تشبع P6 من خلال P6 ' تسلسل الانقسام. ويرد في الجزء السفلي، مع القيم للتسلسل WT سيظهر سواء في الجزء العلوي، وأبرزها مستطيلات بيضاء هوية تسلسل WT. قيمة بين 0 (أسود) يشير إلى نشاط الخلفية، وقيمة + 1 (الأخضر) يشير إلى قيمة WT. (ب) هذه الحرارة خريطة تبين الانحراف المعياري للقيم بروتيوليسيس من الطفرات تشبع نفس المكتبة، مع انخفاض القيم في قيم الأسود وما فوقها باللون الأحمر. تمثل القيم المبينة في مستطيلات بيضاء متقطع طفرات التي أظهرت القيم proteolysis تختلف اختلافاً كبيرا عن حوزتي WT، حسبما يقرره هولم-صداق-تصحيح، مزاوج تي-الاختبارات مع α < 0.05. البيانات المعروضة من 3 تجارب مستقلة، كل منها يحتوي على 3 replicates. وهذا الرقم قد تم تكييفه من كوربا et al. 8- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: آثار بطانات PCSK9 على وظيفة بروتيوليتيك- (أ) هذا الفريق يظهر الهيكل الأساسي من PCSK9، التي تحتوي على تسلسل إشارة (SS؛ الخطوط العريضة السوداء)، برودومين (الإطار الأحمر) والمجال حفاز (مخطط رمادي) والسيستين-الحامض الأميني الغنية المجال (مركز حقوق الإنسان؛ والمخطط الأزرق). (ب) تبين هذا الفريق موقع بطانات السريرية 84 (المستطيلات الصفراء مع الخطوط العريضة السوداء) توضع في مقايسة proteolysis، تعيينها إلى الهيكل الأساسي. (ج) يظهر هذا الفريق قيم بطانات 47 مع النشاط proteolytic تغيير كبير مقارنة بحوزتي WT، حسبما يقرره هولم-صداق-تصحيح مزاوج تي-الاختبارات مع α < 0.05. يتم تعيين القيم إلى الهيكل الأساسي PCSK9، مع قيمة-1 (أحمر) تشير إلى أي نشاط بروتيوليتيك وقيمة + 1 (سماوي) مما يشير إلى حدوث تحسن إضعاف أكثر حوزتي WT. وهذا الرقم قد تم تكييفه من كوربا et al. 8- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: توجيه موقع التصميم التمهيدي PCR مطفرة. [بكر] كبسولة تفجير لها جزئيا متداخلة متواليات، طبقاً للتصميم هو مبين. ويرد مثال لزوج ناجح التمهيدي أسفل الجدول. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
| المكون | الأوراق المالية | وحدة التخزين (ميليلتر) | النهائي |
| عالي النقاوة ح2س | 17.5 | إلى 25 ميليلتر الحجم الإجمالي | |
| المخزن المؤقت لرد الفعل بوليميريز | 5 X | 5 | 1 X |
| Deoxynucleotides (دنتبس) | 200 ميكرومتر | 0.5 | 4 ميكرومتر |
| قالب (البرية من نوع (WT)) | 2 نانوغرام/ميليلتر | 0.5 | 1 نانوغرام (المجموع) |
| التمهيدي (إعادة توجيه) | 20 ميكرومتر | 0.625 | 500 نانومتر |
| التمهيدي (Rev) | 20 ميكرومتر | 0.625 | 500 نانومتر |
| بوليميراز الدنا عالية الدقة | يو 2/ميليلتر | 0.25 | 0.5 يو (المجموع) |
الجدول 2: مكونات بكر للطفرات توجه الموقع. ينبغي إضافة المكونات بالترتيب الذي تم سردها، مع خليط أبقى على الجليد حتى يبدأ رد الفعل.
| الخطوة | درجة الحرارة (درجة مئوية) | الوقت | |
| تمسخ الأولى | 1 | 98 | 30 s |
| تمسخ | 2 | 98 | 10 s |
| الصلب | 3 | (رم قالب) * + 1 | 20 s |
| ملحق | 4 | 72 | 30 s/كيلوبس (kb) (4 دقيقة) |
| ركوب الدراجات الهوائية | 5 (اذهب إلى الخطوة 2، مجموعة دورات 35) | ||
| التمديد النهائي | 6 | 72 | 5 دقيقة |
| عقد | 7 | 12 | عقد |
| *-اختر تي أقلم قالب من زوج التمهيدي | |||
الجدول 3: اقترح معلمات ركوب الدراجات لبكر. المعلمات المقترحة تمثل نقطة بداية جيدة ولكن قد تتطلب التحسين.
| التمهيدي | موقع انلينغ | تسلسل (5 'إلى 3') |
| 1 | مروج CMV | كجكااتججكجتاجكجتج |
| 2 | PCSK9 A95 | تكتكجكاجتكاجاجكجكاك |
| 3 | ج-محطة نلوك | تجتجكجاكجكاتكتجكج |
| 4 | PCSK9 C301 | جككاجكجككتجكتاج |
| 5 | PCSK9 E501 | جاجكككاججججكاج |
الجدول 4: التحقق من صحة كبسولة تفجير لتسلسلها. كل التمهيدي استخدمت بنجاح في تسلسل منطقة الترميز والبلازميدات المشار إليها في هذا الأسلوب.
| مكون (الأوراق المالية) | غير-الحال (متوسطة) | الحال (الخلايا) | المبلغ للآبار 96 (لوحة 1) |
| اسكوربات الصوديوم (م 3) | 300 ملم | 300 ملم | ميليلتر 700 |
| كلوريد الصوديوم (م 5) | 5 مم | 5 مم | 7 ميليلتر |
| جيش صرب البوسنة (10 ملغ/مل، 1%) | 0.10 في المائة | - | ميليلتر 700 |
| Triton X-100 | - | 0.10 في المائة | 7 ميليلتر |
| برنامج تلفزيوني | إلى 50 ميليلتر/جيد | إلى 50 ميليلتر/جيد | إلى 7000 ميليلتر |
| التصفية من خلال 0.22 ميكرومتر الغشاء ونقل 5880 ميليلتر من فيلتراتي في أنبوب جديد | |||
| كولينتيرازيني (2 مم) | 40 ميكرومتر | 40 ميكرومتر | ميليلتر 120 |
| الحجم الإجمالي: 6000 ميليلتر | |||
الجدول 5: مكونات الكواشف x coelenterazine 2 لقراءات لوسيفراس. كواشف غير الحال والحال على حد سواء المطلوبة لكل بئر التي يتم تحليلها، بغية تقييم على حدة متوسطة مكيفة والخلايا ترانسفيكتيد. تمتزج الكواشف وتصفيتها قبل إضافة كولينتيرازيني. بعد إضافة كويلينتيرازيني، حماية الكاشف من الضوء حتى جاهزة للاستخدام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الإجراءات التجريبية المذكورة أعلاه يقدم طريقة للتغلب على نشاط متدنية ارتباطاً وثيقا حوزتي واحدة--دوران PCSK9 وتقييم وظيفتها بروتيوليتيك بطريقة قوية. والمفهوم الرئيسي للمقايسة يعتمد على تحويل حدث واحد--دوران قراءات تضخيم انزيماتيكالي. وتشمل مواطن القوة المقايسة زمني قصير نسبيا وسهولة الاستخدام لمراسل لوسيفراس، فضلا عن قابلية للنهج الفائق. وبالإضافة إلى ذلك، يقيم المقايسة proteolysis في سياقها الأصلي، والهاتف الخلوي. وعلاوة على ذلك، مع هذا التحليل، يمكن تقييم بطانات سريرياً المحددة لآثارها على بروتيوليسيس PCSK9 دون الحاجة إلى أي من الأنسجة البشرية أو المريض؛ من الضروري فقط المعرفة بالنمط الوراثي للفائدة.
توجد عدة قيود التقنية من المقايسة. على الرغم من أن يقيم المقايسة proteolysis داخل الخلية، كما أنه يتطلب overexpression ناقل. نظراً للفحص يتطلب تعداء عابر خط الخلية HEK293T، يضيف الكفاءة تعداء إلى التقلب بئر الجوهرية. بينما PCSK9 S386A البروتياز-الميت بمثابة مراقبة سلبية بروتيوليسيس، أيضا بمثابة عنصر التحكم الإيجابي تعداء نفسها، حيث تنتج هذه الخلايا الوظيفية، لو إينتراسيلولارلي المحاصرين، لوسيفراس. تقييم البيانات الخام من ألواح الخلايا ويساعد على تحديد تلك الخلايا مع وجود اختلافات جسيمة في كفاءة تعداء، ويمكن أن يتم تجاهل هذه البيانات (والتجربة المتكررة إذا رغبت). تجهيز البيانات الخاصة بنسبة لوسيفراس يفرزها خارج لوسيفراس مجموع إنتاجها وعلاوة على ذلك، يساعد على ضبط اختلافات أصغر في إيصال بلازميد وإخراج النسخي. يمكن توقع مثل هذه الاختلافات تؤثر على نواتج لوسيفراس الخلايا والمتوسطة مكيفة على نحو مماثل. بالإضافة إلى ذلك، ناقلات المستخدمة لهذا التحليل قابلة لتشكيل خطوط الخلايا مستقرة إيندوسيبلي، وأسوي مع خط فلبين تي ركس 293 المتاحة تجارياً، التي استخدمت بنجاح كوسيلة لتجاوز الحاجة إلى وساطة الدهن تعداء. وهذا يحتمل أن تكون سمة جذابة عند تطبيق الفحص لفحص جزيء صغير لمثبطات بروتيوليسيس PCSK9. حتى الآن، تم تحديد لا مثبطات هذه، زيادة التشديد على أهمية هذا الفحص.
هندسة حوزتي PCSK9 أيضا بإنشاء عدة محددات البيولوجية. أولاً، التحليل التدابير الجزيئات PCSK9 بروتيوليسيس، بدلاً من بروتيوليسيس إينتراموليكولار التي تحدث مع WT PCSK9. بينما ربط هذين النشاطين عموما، من المستبعد أن وجود علاقة من هذا القبيل في جميع الحالات البيولوجية، وهكذا، وفي بعض الحالات، التحقق من هذه الآثار في انشقاق في رابطة الدول المستقلة PCSK9 الاعتداء، احتمالاً بأسلوب بديل مثل إيمونوبلوت، قد تكون ضرورية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن فقط لتقييم المقايسة مغلطه بطانات (وليس أثر التغيرات غير الترميز). أخيرا، على الرغم من أن بروتيوليسيس PCSK9 هي الخطوة الحد من معدل إفراز PCSK9، والحد بروتيوليسيس PCSK9 من المتوقع أن يسبب متغير PCSK9 خسارة لدالة (فيما يتعلق بالنمط الظاهري السريرية الكوليسترول)، هذا ليس صحيحاً لجميع البرامج، مما يشير إلى أن على الأقل لبعض الطفرات، البيولوجيا إضافية في اللعب8.
فائدة هذا التحليل يكمن في قدرتها على تقييم الدالة بروتيوليتيك من حوزتي جوهريا المخرجات. ينبغي أن تترجم هذه مفاهيم التصميم إلى البروتياز خلاف PCSK9 التي تعاني من تحديات مماثلة. لإجراء هذا التعديل، من الضروري الحفاظ على الارتباط بين إفراز الانقسام ولوسيفراس. استراتيجية حيث الركيزة استبداله بنوع غشاء مرساة ترتبط لوسيفراس عن طريق انقسام وتسلسل محدد بحوزتي الفائدة ينبغي أن تلبي هذا المطلب.
وباختصار، يصف هذا البروتوكول وسيلة لتقييم بروتيوليسيس PCSK9 بطريقة الفائق. سوف تكون هذه الطريقة مفيدة لتقييم أثر البرامج السريرية على بروتيوليسيس PCSK9، وكذلك لفحص مثبطات جزيء صغير من PCSK9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون دعم التمويل السخي من نهلبي/المعاهد الوطنية للصحة (K08 HL124068 و LRP HMOT1243)، والمعاهد الوطنية للصحة/نكاتس عن طريق UCSF السريرية ومتعدية معهد محفز برنامج العلوم (UL1 TR000004)، UCSF الأكاديمي، مؤسسة هيلمان، جائزة الباحث بحوث العلوم جلعاد وجائزة فايزر اسباير القلب والأوعية الدموية (كل إلى جون س. كوربا) ومعهد هاوارد هيوز الطبي (لادري م. غالبان وكيفان م. شوكت).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
- Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
- Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
- Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
- Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
- Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
- Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
- Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
- Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
- Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
- Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
- Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).
