Summary
Ce protocole présente une méthode pour évaluer l’activité protéolytique d’une protéase intrinsèquement peu fréquentés, seul chiffre d’affaires dans un contexte cellulaire. Plus précisément, cette méthode est appliquée pour évaluer l’activité protéolytique de PCSK9, un facteur clé du métabolisme lipidique, dont l’activité protéolytique est requise pour sa fonction ultime hypercholestérolémique.
Abstract
Proprotéine convertase subtilisine/kexin type 9 (PCSK9) est une protéase de simple-chiffre d’affaires qui régule le taux de lipoprotéines de basse densité (LDL) de sérum et, par conséquent, les maladies cardiovasculaires. Bien que PCSK9 protéolyse est nécessaire pour son effet hypercholestérolémique complet, l’évaluation de sa fonction protéolytique est difficile : PCSK9 est connue uniquement en conjonction avec elle-même, subit une seul un chiffre d’affaires unique et après protéolyse, conserve son substrat dans son site actif comme auto-inhibiteur. Les méthodes présentées ici décrivent un test qui permet de surmonter ces défis. Le test se concentre sur la protéolyse intermoléculaire dans un contexte de base de cellules et clivage réussie de liens à l’activité de la luciférase sécrétées, qui peut être lues facilement dans le milieu conditionné. Via les étapes séquentielles de la mutagenèse, transfection transitoire et une lecture de la luciférase, le dosage peut sonder PCSK9 protéolyse dans des conditions d’une perturbation soit génétique ou moléculaire de manière haut débit. Ce système est bien adapté pour les deux l’évaluation biochimique des faux-sens cliniquement découverte single-nucléotides simples (SNP), ainsi que pour le dépistage des inhibiteurs de petites molécules de PCSK9 protéolyse.
Introduction
PCSK9 cible le récepteur des LDL (LDL-R) pour la dégradation, élever le taux de cholestérol LDL (LDL-C) et la conduite de maladie cardiaque athéroscléreuse1,2. PCSK9 ciblage thérapeutique solidement abaisser le LDL-C et améliorer les effets cardiovasculaires des patients, même quand on ajoute un traitement hypolipidémiant agressif avec statines3,4. Cependant, thérapies actuellement approuvées se limitent aux approches axées sur les anticorps et souffrent d’un manque de rentabilité de5,6. Pour résoudre ce problème, les alternatives thérapeutiques moins coûteux, un moyen d’identifier les patients susceptibles de gagner le plus d’avantages, ou les deux, sont nécessaires.
Approches de petit-molécule pourraient cibler PCSK9 intracellulaire, fournir une meilleure voie d’administration et réduire les coûts, rendant le « Saint Graal » dans cette zone7. Cependant, PCSK9 s’avère difficile à drogue de petites molécules. Comme une protéase, ciblant la fonction protéolytique de PCSK9 est une stratégie séduisante, comme self-protéolyse est l’étape cinétiquement limitante de PCSK9 maturation8 et est requise pour son effet maximal sur le LDL-R9. A ce jour, cependant, cette stratégie n’a pas été couronnée de succès, probablement en raison de la biochimie unique de PCSK9 : PCSK9 seulement se fend10, effectuant une réaction de simple-chiffre d’affaires, et après soi-clivage, la PCSK9 prodomain demeure lié au site actif comme une auto-inhibiteur11, empêchant l’affichage de toute autre activité de la protéase.
Cet article présente une méthode pour évaluer la fonction protéolytique PCSK9 en mode haut débit8. Par le biais de mutagenèse dirigée, enquêteurs peuvent utiliser ce test pour sonder les effets du codage SNP dans la clinique afin d’évaluer les effets sur la protéolyse, l’étape cinétiquement limitante de PCSK9 maturation. En outre, cette méthode sera utile dans la conception d’écrans de haut débit afin d’identifier des modulateurs de la protéolyse de PCSK9, qui devraient finalement perturbent la présentation de PCSK9 du LDL-r (et moduler l’effet hypercholestérolémiant de PCSK9) . Enfin, ce protocole peut être adapté aux autres protéases avec intrinsèquement faible activité, pourvu que i) une paire de substrat-protéase spécifique se retrouve, et ii) un point d’ancrage intracellulaire approprié peut être établi pour le substrat.
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Protocol
1. mutagenèse du vecteur de la protéase
- Conception et commande personnalisée-synthétisés oligonucléotides d’installer une mutation d’intérêt à l’aide d’une modification des protocoles de mutagenèse standard12. Des amorces de morue dessalées standards (sans purification supplémentaire) sont parfaitement acceptables.
Remarque : Une approche générale aux conceptions de l’apprêt consiste à créer des amorces partiellement superposés comme indiqué au tableau 1, à l’aide d’une calculatrice de température (Tm) fusion spécifique à la polymérase d’intérêt. - Mettre en place des réactions en chaîne par polymérase (PCR) pour la mutagénèse dirigée sur la glace, comme il est indiqué dans le tableau 2.
- Comme il est indiqué dans le tableau 3du cycle des RFT.
- Exécuter 2 à 5 µL de chaque PCR sur un gel d’agarose à 1 % et de visualiser les produits pour confirmer une amplification réussie.
Remarque : Un ACP réussi indique une bande d’ADN unique, éminente dans le marqueur de taille approximative du gabarit (~7.8 Ko). - Ajouter 0,5 µL (par réaction de 25 µL) du DpnI et incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 h.
- Transformer 2 µL de la réaction en chimiquement compétent Escherichia coli.
Remarque : Une souche d’e. coli en pleine croissance réduira les temps d’incubation, mais toute souche clonage sera acceptable. - Plaque des transformations sur une gélose Luria-Bertani (LB) contenant la carbénicilline de 50 à 100 µg/mL. Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C.
- Sélectionnez 2-4 colonies à grandir dans une culture à petite échelle (2 à 5 mL de milieu LB avec carbénicilline de 50 à 100 µg/mL). Incuber la culture à 37 ° C à 220 tr/mn jusqu'à ce qu’il est trouble.
- Isoler l’ADN des cellules à l’aide d’un kit de purification (c.-à-d., « miniprep ») ADN de plasmide selon les instructions du fabricant de plasmide. Quantifier la concentration d’ADN éluée à l’aide d’un spectrophotomètre microvolume.
- Séquencer l’ADN intensivement à l’aide d’un service de séquençage Sanger (par exemple un core ou l’installation commerciale) de plasmide. Préparer les échantillons d’ADN selon les spécifications du service. Amorces utilisées avec succès dans les réactions de séquençage préalable sont indiqués dans le tableau 4.
Remarque : En raison de l’amplification par PCR du plasmide entier, le séquençage de toute la région codante de PCSK9 est recommandé pour chaque mutant.
2. high-throughput axée sur la luciférase protéolyse Assay
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Placage de cellules (jour 0)
- Utiliser des cellules HEK293T basse-passage pour des expériences et une culture de Dulbecco modifiés milieu Eagle (DMEM) avec 10 % sérum fœtal (SVF). Effectuer tous travail dans des conditions stériles sous une hotte de vitroplants de cellules jusqu’au moment d’analyser l’activité de la luciférase. Estimer le nombre de puits et de plaques nécessaires pour l’expérience, anticipant que transfections seront dérouleront en trois exemplaires pour chaque condition testée.
- Dissocier les cellules HEK293T d’une fiole de parent en les traitant avec un volume minimal de 0,05 % acide de trypsine-tétraacétique (EDTA) pour couvrir les cellules. Inactiver la trypsine-EDTA et 2 volumes de DMEM additionné de 10 % FBS et transfert les cellules dans un tube stérile. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées (et coloration au trypan blue). Centrifuger le tube à 500 g pendant 5 min récupérer des cellules.
- Aspirer le milieu contenant la trypsine et reconstituer les cellules dans le milieu de culture à une concentration de 2 x 105 cellules/mL. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférer 100 µL de cellules dans chaque puits d’une plaque de 96 puits blanc (opaque bas), qui donne une concentration finale de semis de 2 x 104 cellules/puits.
Remarque : Pour les premières expériences, il peut être utile amorcer en outre une soeur, clear-plaque 96 puits, afin de surveiller la croissance des cellules et l’adhérence au cours du protocole et le guide des pannes futures. - Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 24 h.
- Préparer un plat principal des plasmides dans un format de 96 puits. Diluer chaque plasmide dans la mémoire tampon d’élution (Tris-HCl, pH 8,5) à 50 ng/µL dans un puits individuel d’une plaque de 96 puits.
- Préparer 4 puits de chaque pour le contrôle positif (WT) plasmide8, contrôle négatif (S386A) plasmide8et tampon sans plasmide (pour transfections simulées). Si les médicaments ou autres traitements cellulaires sont prévus, puis préparent le plat principal avec le plasmide contrôle positif (WT) dans chaque puits, ainsi que de 4 puits chacune le plasmide contrôle négatif (S386A) et le tampon sans plasmide.
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Transfection (jour 1)
- Préparer le mélange de transfection dans un format de plaque 96 puits à l’aide de plaques de 96 puits profonds puits. Effectuer les transfections en triple exemplaire, en veillant à préparer suffisamment réactifs pour tenir compte des pertes de pipetage et de transfert.
Remarque : Les calculs suivants préparent suffisamment réactif pour exécuter une plaque à 96 puits en triple exemplaire (estimé prudemment pour 420 puits).- Faire un mélange maître d’un réactif de transfection de lipides dilué, ajoutant 50,4 µL de réactif à 2050 µL de sérum réduit moyen. Faire un mélange maître d’un réactif de precomplexation d’ADN, ajoutant 33,6 µL de réactif en 1730 µL de sérum réduit moyen.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, aliquote 16,8 µL du mélange réactif de precomplexation d’ADN dilué dans chaque puits de la plaque de fond de puits.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, aliquote µL de 3,2 (160 ng) de chaque plasmide de la plaque maître dans chaque puits de la plaque de fond de puits.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, aliquote 20 µL du mélange réactif dilué lipides transfection à chaque puits de la plaque et mélanger le contenu de chaque bien à l’aide de la pipette multicanaux. Recouvrir les plaques et les laisser reposer à température ambiante (RT) pendant 10-15 min pour former des complexes lipides : ADN.
Remarque : Après la transfection, les derniers éléments / puits auront lieu comme suit : 40 ng d’ADN, 0,12 µL de réactif de transfection et 0,08 µL de réactif de pre-complexation de l’ADN et le contenu de chaque bien sera 10 µL volume total (moyenne réduite et le sérum).
- L’échange doucement le support sur les cellules 293 t dans les plaques de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux, prenant soin de ne pas pour perturber les cellules. Remplacer le milieu atmosphérique avec 95 µL de DMEM supplémenté de 10 % FBS.
Remarque : Ce serait une date appropriée pour traiter les cellules avec n’importe quel médicament d’intérêt. - Ajouter 10 µL du mélange transfection dans chaque cas bien via une pipette multicanaux. Agiter doucement de la plaque pour mélanger le contenu dans les puits. Incuber les plaques à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 24 h.
Remarque : Le volume final des puits vient à µL 105, pour tenir compte de l’évaporation sur 24 heures.
- Préparer le mélange de transfection dans un format de plaque 96 puits à l’aide de plaques de 96 puits profonds puits. Effectuer les transfections en triple exemplaire, en veillant à préparer suffisamment réactifs pour tenir compte des pertes de pipetage et de transfert.
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Dosage (jour 2)
- Préparer une solution de coelenterazine réactifs : ascorbate de sodium 3M [dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), préparée frais] 5 M NaCl, 10 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA, dissous en PBS, préparés frais) et 2 mM coelenterazine (dissous dans méthanol acidifié contenant 200 µL de 3 HCl N / 10 mL).
Remarque : La coelenterazine 2 mM peut être stocké pendant 2 semaines quand il est conservé à-80 ° C et en l’absence de lumière. - Préparer 2 x coelenterazine réactifs pour la lecture de la luciférase, avec un réactif séparé chacun pour les cellules et le milieu, conformément au tableau 5. Mélanger tous les réactifs enregistrer la coelenterazine tout d’abord, filtrer le mélange à travers un filtre de seringue de 0,22 µm et puis ajoutez la coelenterazine. Protéger les réactifs de la lumière, jusqu'à ce qu’ils sont prêts à être ajoutés aux plaques.
Remarque : En raison de la perte de la solution de filtration, faire assez réactif pour tenir compte de la perte de deux de filtration, ainsi que de transferts. Le tableau 5 montre la concentration finale de réactifs 2 x (ainsi que la quantité de solution mère à ajouter pour lire sur une plaque à 96 puits avec un réactif). - Éliminer les cellules de l’incubateur 24h après la transfection. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférer 50 µL de milieu conditionné de chaque puits d’une plaque à 96 puits (opaque) fraîche, à fond blanc.
- Étiqueter les plaques que s’ils contiennent des moyennes ou des cellules. Si plus d’une plaque à 96 puits a été transfectée, étiqueter les plaques afin de garantir que chaque plaque contenant du milieu est jumelée avec sa plaque de parent de cellules.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 50 µL de 2 x non-lytique coelenterazine réactif dans la plaque contenant uniquement le milieu conditionné. Doucement, rock ou secouer la plaque en l’absence de la lumière pendant 5-10 min à température ambiante.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 50 µL de réactif de coelenterazine lytique 2 x la plaque contenant les cellules. Doucement, rock ou secouer la plaque en l’absence de la lumière pendant 5-10 min à température ambiante.
- Après l’incubation, lecture de la luminescence de la plaque support uniquement à l’aide d’un lecteur. Ensuite, lecture de la luminescence de la plaque contenant des cellules dans le même lecteur.
- Jeter les plaques et enregistrez les fichiers d’analyse des données.
- Préparer une solution de coelenterazine réactifs : ascorbate de sodium 3M [dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), préparée frais] 5 M NaCl, 10 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA, dissous en PBS, préparés frais) et 2 mM coelenterazine (dissous dans méthanol acidifié contenant 200 µL de 3 HCl N / 10 mL).
3. analyse des données
- Effectuer une analyse de données initiale à l’aide du tableur. Créer une feuille de calcul contenant les résultats de la cellule et les plaques moyennes.
- Inspecter manuellement les données sur les plaques de la cellule pour identifier des puits mal transfectées. Puits qui montrent < 5 % - 10 % de la lecture du plasmide contrôle négatif (S386A) devrait être considérés comme aussi mal transfectées, rendant l’interprétation de ces données suspect.
- Calculer la luminescence de fond moyenne de chaque plaque provenant des puits transfectées mock. Soustraire le fond de chaque plaque à partir des valeurs de cette plaque.
Remarque : Cette valeur peut être négligeable selon le lecteur utilisé. - Traiter les données en calculant la proportion de l’activité de la luciférase dans le milieu par rapport à l’activité de la luciférase globale pour chaque puits. Parce que la plaque cellulaire contient les deux milieu conditionné en plus de cellules, et la plaque de support seule contienne la même quantité de milieu conditionné comme la plaque cellulaire, il convient d’utiliser l’équation suivante :
Ici, RLU = unités de luminescence relative, l’affichage de la soustrait au fond du lecteur de plaque. - Calculer la moyenne luciférase sécrété du contrôle positif (WT) et les puits de contrôle négatif (S386A).
- Évaluer la qualité globale de l’expérience en calculant un facteur Z13:
Remarque : Les valeurs actives proviennent du contrôle positif (WT) et les valeurs inactives proviennent des puits témoin négatif (S386A). Valeurs plus proches à 1 indiquent une qualité supérieure expérimentale. Envisager la répétition de l’expérience ou en optimisant le flux de travail si la valeur est inférieure à 0. - Transférer les données du programme de feuille de calcul dans le logiciel d’analyse de données scientifiques.
- Normaliser l’activité de la luciférase sécrétée pour les valeurs moyennes du contrôle positif (WT) et le contrôle négatif (S386A), définissant le contrôle positif comme le 1 et le contrôle négatif comme 0.
- Nettoyer les données pour les valeurs aberrantes en utilisant la méthode de régression et aberrantes enlèvement (déroute), fixant le taux de découverte de faux maximum à 1 %.
- Évaluer les différences statistiquement significatives en comparant les données pour chaque condition de mutant (ou mutant) à la moyenne de l’activité WT (normalisée à une valeur de 1). Effectuer plusieurs non-appariés t-tests, correction des comparaisons multiples à l’aide de la méthode Holm-Sidak et α = 0,05.
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Representative Results
Le dosage de la protéolyse du haut débit dépend de surmonter trois défis majeurs. Tout d’abord, pour pallier la sortie intrinsèquement faible d’une protéase de PCSK9 single-chiffre d’affaires, une protéase de PCSK9 manque l’inhibiteur prodomain sert, avec la séquence de clivage à la queue de le prodomain liée à une luciférase qui peut être sécrétées14. Deuxièmement, pour répondre au besoin de la protéase à plier complexe avec ses inhibiteurs prodomain, que sont les deux polypeptides coexpriment en trans dans un contexte cellulaire15,,16, via un vecteur bicistronique. En troisième lieu, afin de différencier les clivées du substrat clivé, la protéase de PCSK9 est tronquée à C678, qui empêche la sortie de la PCSK9 complexe du réticulum endoplasmique (ER), mais n’a aucun effet sur la fonction protéolytique17,18 . Pris ensemble, cela permet une évaluation de la luciférase sécrétée comme indicateur de la présence et le degré de PCSK9 protéolyse (Figure 1 a). Le calendrier général du dosage est court, avec les étapes de la mutagenèse dirigée du vecteur assay (jours 1 - 2) suivie de la transfection transitoire (jour 3) et luciférase lecture (jour 4) tous les achevé dès que 4 jours, avec un minimum de temps « Hands-on » (en Figure 1 b).
Dans l’ensemble, ce test permet l’évaluation simultanée de PCSK9 protéolyse dans une variété de conditions, avec la lecture faite par un dosage de la luciférase. Après l’acquisition et de traitement, les données peuvent être visualisées en format tabulaire ou carte thermique. En particulier, les analyses mutationnelles du codage SNP conviennent bien à cette approche. La figure 2 montre une carte thermique d’une bibliothèque de mutagenèse saturation évaluer la spécificité de séquence de clivage de la protéase de PCSK9 au sites de substrat P6 par P6'. Les résultats montrent que la séquence optimale de clivage est essentiellement identique à la séquence WT (SSVFAQ | SIPWNL). En particulier, la mutation du P6 ou P4 par P1' résidus est mal tolérée par la protéase, compatible avec la rainure de fixation peu profonds, hydrophobe pour ces postes dans la structure cristalline de la mature, clivé PCSK9. Du point de vue du développement de l’inhibiteur, ce profil de spécificité de séquence étroit est une conclusion utile, car elle suggère qu’aucun substrat idéalisé mimétique ne pouvait supplanter la séquence endogène de clivage. La figure 3 montre l’activité de clivage relative (par rapport au WT) d’une bibliothèque de faux-sens SNP décrit dans la clinique, tracée sur la structure primaire de PCSK9. Des 84 SNP évaluées, plus la moitié ont montré un changement significatif en activité par rapport à la protéase WT. Ces résultats suggèrent que les altérations de l’activité protéolytique de PCSK9 sont en effet assez fréquent dans la population clinique, et ces modifications peuvent aider à expliquer la variabilité des taux de cholestérol LDL à la clinique.
Figure 1 : Schéma d’ensemble du test haut débit en trans PCSK9 clivage. (A) ce panneau montre un schéma biochimique de l’analyse présentée ici. Le substrat est constitué de la séquence de signaux de PCSK9 (gris foncé) et le prodomain (rouge) lié à la luciférase qui peut être sécrétées (NLuc, vert) de la séquence de clivage de PCSK9 (jaune). La protéase est constitué de la séquence signal (gris foncé), le domaine catalytique (gris clair) et le domaine (CHR) riche en cystéine-histidine contenant la troncature de C679X. La paire de substrat-protéase est coexpriment à quantités stoechiométriques dans un vecteur bicistronique axée sur les 2 a, se prêtent à des manipulations génétiques. Coexpression, la protéase et le substrat a plier et restent piégées dans le réticulum endoplasmique (ER). Avec activité de clivage, la luciférase est libérée du complexe et sécrétée, où il peut être détecté par l’analyse de luciferase de milieu conditionné. Des perturbations potentielles à l’activité de clivage incluent, mais ne se limitent pas aux manipulations génétiques (perturbation A) ou la présence de petites molécules (perturbation B). (B), ce panneau affiche la chronologie pour l’analyse globale. Mutagenèse dirigée sur le plasmide WT est effectuée sur jours -1 et 0, suivie de la transfection le jour 1 et jour 2, pour qu’une chronologie totale de 4 jours de la Luciferase. Ce chiffre a été adapté de Chorba et al. 8. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : séquence de spécificité de la protéase de PCSK9. (A) cette carte de chaleur montre l’activité protéolytique, normalisée à fond et WT, pour chaque mutant seul acide aminé d’une bibliothèque de mutagénèse de saturation de la P6 à travers P6 "séquence de clivage. L’identité de séquence WT est affichée dans le bas, avec les valeurs de la séquence WT montré tous les deux en haut et a mis en évidence par les rectangles blancs. Une valeur de 0 (noir) indique l’activité de fond et d’une valeur de + 1 (vert) indique la valeur WT. (B), cette chaleur carte montre l’écart type des valeurs protéolyse de la même bibliothèque de mutagénèse de saturation, avec des valeurs plus faibles dans les valeurs de noirs et supérieurs en rouge. Valeurs indiquées dans les rectangles en pointillés blancs représentent des mutants qui présentaient des valeurs de protéolyse significativement différente de celle de la protéase WT, tel que déterminé par Holm-Sidak-corrigé, non apparié t-tests avec α < 0,05. Les données présentées proviennent de 3 expériences indépendantes, chacune contenant 3 répétitions. Ce chiffre a été adapté de Chorba et al. 8. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : effets de PCSK9 SNP sur la fonction protéolytique. (A), ce panneau affiche la structure primaire de PCSK9, contenant la séquence signal (SS ; contour noir), le prodomain (contour rouge), le domaine catalytique (contour gris) et la cystéine-histidine riche domaine (CHR ; contour bleu). (B) ce panneau indique l’emplacement de 84 SNP clinique (rectangles jaunes avec contours noirs) placé dans le dosage de la protéolyse, mappé sur la structure primaire. (C) ce panneau montre les valeurs des 47 SNP avec une activité protéolytique sensiblement modifiée par rapport à la protéase WT, tel que déterminé par Holm-Sidak-corrigé non apparié t-tests avec α < 0,05. Les valeurs sont mappées sur la structure primaire de PCSK9, avec une valeur de -1 (rouge) n’indiquant aucune activité protéolytique et une valeur de + 1 (cyan) indiquant une amélioration de 2 fois sur la protéase WT. Ce chiffre a été adapté de Chorba et al. 8. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : dirigée mutagène conception d’amorces PCR. Des amorces PCR ont partiellement chevauchement des séquences, selon la conception présentée. Le tableau ci-dessous un exemple d’une paire d’amorces réussie. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
| Composant | Stock | Volume (µL) | Finale |
| Ultrapure H2O | 17.5 | au volume total de 25 µL | |
| Tampon de réaction de polymérase | 5 X | 5 | 1 X |
| Désoxynucléotides (dNTPs) | 200 ΜM | 0,5 | 4 ΜM |
| Modèle (type sauvage (WT)) | 2 ng/µL | 0,5 | 1 ng (total) |
| Apprêt (Fwd) | 20 ΜM | 0,625 | 500 nM |
| Apprêt (Rev) | 20 ΜM | 0,625 | 500 nM |
| ADN polymérase de haute fidélité | 2 U/ΜL | 0.25 | 0,5 U (total) |
Tableau 2 : composants d’une PCR de mutagenèse. Les composants doivent être ajoutés dans l’ordre dans lequel ils sont répertoriés, avec le mélange gardé sur la glace jusqu'à ce que la réaction commence.
| Étape | Température (° C) | Temps | |
| Dénaturation initiale | 1 | 98 | 30 s |
| Dénaturation | 2 | 98 | 10 s |
| Recuit | 3 | (Tm modèle) * + 1 | 20 s |
| Extension | 4 | 72 | 30 s/kilobases (kb) (4 min) |
| Vélos de route | 5 (passez à l’étape 2, au total 35 cycles) | ||
| Extension finale | 6 | 72 | 5 min |
| Maintenez | 7 | 12 | Maintenez |
| * - Choisissez le plus faible de Tm modèle de paire d’amorces | |||
Tableau 3 : Paramètres suggérés de cyclisme pour les RP. Les paramètres suggérés représentent un bon point de départ, mais peuvent nécessiter optimisation.
| Apprêt | Emplacement de recuit | Séquence (5'-3') |
| 1 | Promoteur de CMV | CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG |
| 2 | PCSK9 A95 | TCTCGCAGTCAGAGCGCAC |
| 3 | Partie C-terminale de la NLuc | TGTGCGAACGCATTCTGGCG |
| 4 | PCSK9 C301 | GCCAGCGCCTGGCTAGG |
| 5 | PCSK9 E501 | GAGGCCCAAGGGGGCAAG |
Tableau 4 : validé amorces pour l’ordonnancement de. Chaque amorce a été utilisée avec succès dans le séquençage de la région codante des plasmides référencé dans cette méthode.
| Composant (stock) | Non-lytique (moyen) | Lytiques (cellules) | Montant pour 96 puits (1 assiette) |
| Ascorbate de sodium (3 M) | 300 mM | 300 mM | 700 ΜL |
| NaCl (5 M) | 5 mM | 5 mM | 7 ΜL |
| BSA (10 mg/mL, 1 %) | 0,10 % | - | 700 ΜL |
| Triton X-100 | - | 0,10 % | 7 ΜL |
| PBS | À 50 µL/puits | À 50 µL/puits | À 7000 µL |
| Filtrer par le biais de 0,22 µm membrane et transférer 5880 µL de filtrat dans nouveau tube | |||
| Coelenterazine (2 mM) | 40 ΜM | 40 ΜM | 120 ΜL |
| Volume total : 6000 µL | |||
Tableau 5 : éléments de 2 x coelenterazine réactifs pour les lectures de la luciférase. Tant non-lytique et lytiques de réactifs sont nécessaires pour chaque puits qui est analysée, afin d’évaluer séparément le milieu conditionné et les cellules transfectées. Les réactifs sont mélangés et filtrés avant l’ajout de la coelenterazine. Après l’ajout de la coelenterazine, protéger le réactif de lumière jusqu’au prêt à l’emploi.
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Discussion
Les procédures expérimentales décrites ci-dessus présentent une méthode pour surmonter l’intrinsèquement faible activité de la protéase de simple-chiffre d’affaires PCSK9 et évaluer sa fonction protéolytique de manière robuste. Le concept clé de l’analyse repose sur la conversion d’un événement unique-chiffre d’affaires en un affichage amplifié enzymatiquement. Les points forts de l’analyse sont relativement court délai et facilité d’utilisation de la luciférase journaliste, ainsi que son évolutivité à haut débit des approches. En outre, l’essai évalue protéolyse dans son contexte natif, cellulaire. En outre, avec ce dosage, SNP cliniquement identifiés peut être évaluées pour leurs effets sur la protéolyse de PCSK9 sans besoin de n’importe quel tissu humain ou patient ; seule la connaissance du génotype d’intérêt est nécessaire.
Il existe plusieurs limitations techniques du dosage. Bien que l’essai évalue la protéolyse dans la cellule, il exige aussi une surexpression du vecteur. Étant donné que le dosage nécessite la transfection transitoire de la lignée de cellules HEK293T, efficacité de transfection ajoute à la variabilité intrinsèque des puits à puits. Tandis que la protéase-morte S386A PCSK9 sert comme contrôle négatif pour la protéolyse, il sert également le contrôle positif pour la transfection lui-même, étant donné que ces cellules produisent fonctionnel, quoique intracellulairement piégé, luciférase. Évaluer les données brutes des plaques cellulaires aide à identifier ces cellules avec des variations brutes dans l’efficacité de la transfection et ces données peuvent être mis au rebut (et l’expérience répétée si vous le souhaitez). De plus, traitement des données pour la proportion de la luciférase sécrété hors de la luciférase total produit aide à régler pour les petites variations en livraison de plasmide et sortie transcriptionnelle. De telles variations devrait affecter les sorties de la luciférase des cellules et le milieu conditionné de la même façon. En outre, les vecteurs utilisés pour cet essai sont prêtent à la formation des lignées stables inductible, isogéniques avec la ligne 293 T-Rex Flp-In disponible dans le commerce, qui a été employé avec succès comme un moyen de contourner l’exigence de médiation lipidique transfection. Cela est susceptible d’être un atout lors de l’application du test à une projection de petites molécules pour PCSK9 inhibiteurs de la protéolyse. A ce jour, aucun ces inhibiteurs n’ont été identifiés, soulignant également l’importance de ce test.
Le génie de la protéase de PCSK9 crée également plusieurs limitations biologiques. Tout d’abord, l’essai mesure intermoléculaire PCSK9 protéolyse, plutôt que de la protéolyse intramoléculaire qui se produit avec la PCSK9 WT. Alors que ces deux activités sont généralement corrèlent, il est peu probable qu’une telle corrélation existe dans toutes les situations biologiques et, ainsi, dans certaines situations, la vérification de ces effets dans un clivage dans CEI PCSK9 assay, probablement par une méthode alternative comme immunoblot, peuvent être nécessaires. En outre, l’essai peut évaluer seulement faux-sens SNP (et pas l’effet des variations non codantes). Enfin, bien que la protéolyse de PCSK9 est l’étape limitante de la sécrétion de PCSK9 et la réduction de la protéolyse de PCSK9 est censée causer une variante de PCSK9 perte de fonction (concernant le phénotype clinique de cholestérol), ce n’est pas vrai pour tous les SNP, indiquant qu’au moins pour certaines mutations, biologie supplémentaire est à jouer8.
L’utilité de ce dosage réside dans sa capacité d’évaluer la fonction protéolytique d’une protéase de sortie faible intrinsèquement. Ces concepts de conception devraient se traduire aux protéases autre que PCSK9 qui souffrent de problèmes similaires. Pour effectuer cette modification, il est nécessaire de maintenir le lien entre la sécrétion de clivage et de la luciférase. Une stratégie où le substrat est remplacé par un type j’ai ancrage membranaire lié à la luciférase via une séquence de clivage spécifique de la protéase d’intérêt doit satisfaire à cette exigence.
En résumé, ce protocole décrit une méthode permettant d’évaluer la PCSK9 protéolyse dans un mode haut-débit. Cette méthode vous sera utile pour évaluer l’effet de SNP clinique sur la PCSK9 protéolyse, ainsi que pour le dépistage des inhibiteurs de petites molécules de PCSK9.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le généreux soutien financier du NHLBI/NIH (K08 HL124068 et LRP HMOT1243), NCATS/NIH par le biais de l’UCSF clinique et translationnelle Science Institute programme catalyseur (UL1 TR000004), le Sénat académique UCSF, la Fondation de Hellman, un Gilead Sciences Research Scholar Award, un prix cardiovasculaire de Pfizer ASPIRE (tout John S. Chorba) et le Howard Hughes Medical Institute (à Adri M. Galvan et Kevan M. Shokat).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
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