Summary
このプロトコルは、携帯電話のコンテキストで本質的に低活動、シングル売り上げ高プロテアーゼの活性を評価する方法を示します。具体的には、このメソッドは、PCSK9 のプロテアーゼ活性はその究極の高コレステロール血症の機能に必要な脂質代謝の主要ドライバーのプロテアーゼ活性の評価に適用されます。
Abstract
プロタンパク質転換酵素サチライシン/kexin タイプ 9 (PCSK9) は血清低密度リポタンパク質 (LDL) を調節するシングル売り上げ高プロテアーゼとその結果、心血管疾患。PCSK9 分解は完全高コレステロール血症効果に必須ですが、蛋白機能の評価は挑戦: PCSK9 自体を切断にのみ知られている、単一回転率だけを受けるし、タンパク質分解の後で、基板を保持自動-阻害剤として活性部位。ここで紹介する方法は、これらの課題を克服するアッセイをについて説明します。試金はセル ベースのコンテキストとリンク馴化培地で簡単に読み取ることができます分泌ルシフェラーゼの活動に成功した胸の谷間に分子分解について説明します。経由で突然変異誘発、トランスフェクション、ルシフェラーゼの読み出しのシーケンシャル手順アッセイは、高スループット方法で PCSK9 蛋白酵素の遺伝学的または分子の摂動の条件を調べることができます。このシステムは、臨床的に検出されたミスセンス単一ヌクレオチドの多形 (SNPs) 同様 PCSK9 タンパク質分解の小分子阻害剤のスクリーニングの両方生化学的評価に適しています。
Introduction
LDL コレステロール (LDL-C) を上げると動脈硬化性心臓病1,2を運転、PCSK9 は劣化の LDL 受容体 (LDL-R) を対象します。治療ターゲット PCSK9 はしっかり LDL-C を下げるし、スタチン3,4積極的脂質低下療法に追加される場合でも患者は、心血管アウトカムを改善します。ただし、現在承認された治療法抗体ベースのアプローチに限定され、費用対効果5,6の不足に苦しみます。この問題を解決するためにより少なく高価な治療選択肢、大きなメリットを得るために可能性が高い患者を識別する手段またはその両方が必要です。
小分子アプローチが細胞内 PCSK9 をターゲットの管理、改善されたルートを提供し、このエリア7で、「聖杯」を作るコストを削減します。ただし、PCSK9 は小分子による薬物に困難証明しています。、プロテアーゼとして PCSK9 の蛋白分解機能のターゲット、魅力的な戦略と自己タンパク質分解 PCSK9 成熟8の率制限ステップは、LDL R9その最大効果のため必要です。日には、ただし、この戦略は成功していない、PCSK9 のユニークな生化学による可能性が高い: PCSK9 裂くだけ10、シングル売り上げ高反応を実行する、自己-胸の谷間後、PCSK9 prodomain ままとしてアクティブ サイトでバインドされている、自動阻害剤11、任意のさらなるプロテアーゼ活性の読み出しを防止します。
高スループット方法8PCSK9 蛋白分解機能を評価する手法を提案します。サイト指示された突然変異誘発、を通じて捜査官は、PCSK9 成熟の率制限ステップ、タンパク質分解に及ぼす影響を評価するのに診療所は、SNPs を符号化の効果を調査するのにこのアッセイを使用できます。さらに、このメソッドは、LDL r PCSK9 のプレゼンテーションを妨害 (、PCSK9 の高コレステロール血症効果を調節する) 最終的に期待されている、PCSK9 のタンパク質分解の変調器を識別するために高速画面の設計に役に立つでしょう.最後に、このプロトコルは i) 特定の基板プロテアーゼのペアを見つけることができます、ため基板 ii) 適切な細胞内アンカーを確立する、本質的に低活動で、他のプロテアーゼに適応することができます。
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Protocol
1 プロテアーゼ ベクトルのサイト指示された突然変異誘発
- 設計し、標準サイト指示された突然変異誘発のプロトコルの12の修正を使用して興味の突然変異をインストールするカスタム合成オリゴヌクレオチドを発注します。(追加精製) することがなく標準脱塩プライマーは、完全に許容されます。
注: プライマー設計に一般的なアプローチは、テーブル 1、溶融温度 (Tm) 計算機の関心のポリメラーゼに固有を使用して示されているように、部分的に重複するプライマーを作成する含まれます。 - ポリメラーゼ連鎖反応 (Pcr) に設定サイト指示された突然変異誘発氷上では、表 2に示されているように。
- 表 3に示されているように、PCRs をサイクルします。
- 1% の agarose のゲルの各 PCR の 2-5 μ L を実行し、成功の増幅を確認する製品を視覚化します。
注: 正常な PCR テンプレート (~7.8 kB) のおおよそのサイズ マーカーで単一、著名な DNA バンドが表示されます。 - DpnI の (25 μ L 反応) あたり 0.5 μ L を追加し、37 ° C 1 時間でサンプルをインキュベートします。
- 化学的に有能な腸管出血性大腸菌に反応の 2 μ L を変換します。
注: 急成長中の大腸菌の菌株培養時間は短縮されますが、任意のクローンのひずみが許容されます。 - 50-100 μ G/ml carbenicillin を含むルリア ベルターニカミラ (LB) 寒天に変換をプレートします。37 ° C で一晩版を孵化させなさい
- 小規模な文化 (50-100 μ G/ml carbenicillin と LB 培地の 2 5 mL) に成長する 2-4 植民地を選択します。濁ったまで 220 rpm で 37 ° C で文化を孵化させなさい。
- 製造元の指示に従ってプラスミド DNA 精製 (すなわち、「miniprep」) キットを使用してセルからの DNA のプラスミッドを分離します。微量分光光度計を使用して溶離された DNA の濃度を定量化します。
- プラスミド DNA (コア、商業施設など) ・ サンガー シーケンス サービスを使用して広範囲をシーケンスします。サービスの仕様によると DNA サンプルを準備します。正常に事前配列の反作用で使用されるプライマーは、表 4に記載されています。
注: 全プラスミドの PCR 増幅による PCSK9 コード領域全体のシーケンスは各変異体をお勧めします。
2. 高スループット ルシフェラーゼを用いたタンパク質アッセイ
-
セルめっき (0 日)
- 実験用低通過 HEK293T 細胞を使用し、ダルベッコの文化が 10% 牛胎児血清 (FBS) でイーグル培地 (DMEM) を変更します。実行すべてのセル ルシフェラーゼ活性を分析する準備が整うまでのティッシュ文化フードの無菌条件下で作業します。ウェルズと transfections が 3 通をテストする各条件に対して実行されることを期待して、実験に必要なプレートの数を推定します。
- 0.05% トリプシン エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) のセルをカバーするための最小限の量とそれらを扱うことによって親のフラスコから HEK293T 細胞を分離します。DMEM 10 %fbs と転送の 2 つの容積でトリプシン-EDTA を不活性化細胞生殖不能の管に。セルをカウント自動化された細胞カウンターを使用して (とトリパン ブルー染色)。500 x g細胞を回復する 5 分間でチューブを遠心します。
- トリプシン含有培地を吸引し、2 x 105セル/mL の濃度に培養細胞を再構成します。マルチ チャンネル ピペットを使用して、最終 2 × 104細胞/ウェル播種濃度を与えるホワイト (不透明下) 96 ウェルのプレートの各ウェルに 100 μ L のセルを転送します。
注: 初期実験のためことができますさらに細胞の成長およびプロトコルおよびガイド今後トラブルシューティング中に遵守を監視するために妹、クリア下 96 ウェル プレートをシードします。 - 24 h の CO2を 37 ° C、5% でセルを孵化させなさい。
- 96 ウェル形式でプラスミドのマスター プレートを準備します。各溶出バッファー (トリス-HCl、pH 8.5) 50 ng/μ L 96 ウェル プレートの各ウェル内にプラスミドを希釈します。
- 肯定的な制御 (WT) プラスミド8、ネガティブ コントロール (S386A) プラスミド8、およびプラスミド無料バッファー (モック transfections) のための 4 の井戸を準備します。薬物または他の細胞ベースの治療が予定されていますし、負の 4 ウェルズと共に、各ウェルに肯定的な制御 (WT) プラスミドとマスターの板を準備する場合は、(S386A) プラスミドとプラスミド フリー バッファーを制御します。
-
トランスフェクション (1 日目)
- ディープ ウェルの 96 ウェル プレートを使用して 96 ウェル プレート形式でトランスフェクション混合物を準備します。3 通、ピペッティング、譲渡損失を考慮して十分な試薬を準備している、transfections を実行します。
注: 次の計算は、3 通 (420 井戸の保守的に推定) で 1 つの 96 ウェル プレートを実行する十分な試薬を準備します。- 2050 μ 減少血清中に試薬の 50.4 μ L を追加する希釈脂質トランスフェクション試薬のマスター ミックスを作る。1730 μ 減少血清中に試薬の 33.6 μ L を追加する DNA precomplexation 試薬のマスター ミックスを作る。
- マルチ チャンネル ピペット、ディープウェル プレートの各ウェルに、希薄化後の DNA precomplexation 試薬混合物の 16.8 μ L 分注を使用しています。
- マルチ チャンネル ピペット、分注 3.2 μ L を使用して (160 ng) ディープ ウェル プレートの各ウェルにマスター プレートからそれぞれのプラスミッドの。
- マルチ チャンネル ピペットを使用して、各希釈脂質トランスフェクション試薬の混合物の 20 μ L 分注はプレートのよく、よくマルチ チャンネル ピペットを使用してそれぞれの内容をミックスします。カバー、プレート、およびフォーム脂質: DNA 複合体に 10-15 分の室温 (RT) で座らせてください。
注: トランスフェクション、ウェルあたりの最後のコンポーネントになります次のように: 40 ng の DNA、トランスフェクション試薬の 0.12 μ L および DNA 前錯形成試薬の 0.08 μ L のとそれぞれの内容も 10 μ L になります合計ボリューム (減少血清中)。
- 優しく世話を細胞を破壊すること、マルチ チャンネル ピペットを使用して 96 ウェル プレートで 293 t 細胞の培地を交換します。10 %dmem の 95 μ L で交換して吸気中短期国債。
注: これは興味の任意の薬剤とセルを扱う適切な時間になります。 - それぞれ適切な井戸経由でマルチ チャンネル ピペットにトランスフェクション混合物の 10 μ L を追加します。そっと井戸の内容をミックス プレートを旋回します。24 時間 5% CO2と 37 ° C でプレートを孵化させなさい。
注: 井戸の最終巻は、蒸発 24 h 以上を考慮して 105 μ L になります。
- ディープ ウェルの 96 ウェル プレートを使用して 96 ウェル プレート形式でトランスフェクション混合物を準備します。3 通、ピペッティング、譲渡損失を考慮して十分な試薬を準備している、transfections を実行します。
-
試金 (2 日目)
- 在庫ソリューション セレンテラジン試薬の準備: 3 M アスコルビン酸ナトリウム [リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、新鮮な準備に溶解]、5 M NaCl、10 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA; ので新鮮で溶存の PBS)、(に溶解した 2 mM セレンテラジン酸性メタノール 10 ml の 3 N HCl の 200 μ L を含む)。
注: 2 mM セレンテラジンは-80 ° c とライトの不在のそれを飼っていると 2 週間保存できます。 - ルシフェラーゼ読み出し、独立した試薬と各細胞の培地、表 5によると 2 x coelenterazine 試薬を準備します。最初、セレンテラジンを保存すべての試薬を混合する、0.22 μ m のシリンジ フィルターを通して混合物をフィルターし、セレンテラジンを追加します。プレートに追加する準備ができるまで、試薬を光から保護します。
メモ: ろ過からソリューションの損失のため、ろ過、および転送から両方の損失を考慮して十分な試薬をください。表 5は、最終濃度 2 倍試薬 (と同様 1 つの試薬の 1 つの 96 ウェル プレートを読むに追加する原液の量) を示します。 - インキュベーター 24 h から、トランスフェクション後のセルを削除します。マルチ チャンネル ピペットを使用して、新鮮な白底 (不透明) 96 ウェル プレートに各ウェルから馴化培地の 50 μ L を転送します。
- 媒体またはセル含まれているかどうか、板にラベルを付けます。1 つ以上の 96 ウェル プレートが transfected でラベル セルの親板各媒体を含むプレートがペアリングされていることを確認するためにプレートを付けます。
- マルチ チャンネル ピペットを使用して、非溶解セレンテラジン試薬 x 2 の 50 μ L を馴化培地のみを含むプレートに加えます。優しくロックやルートで 5-10 分のためのライトの不在のプレートを振る
- マルチ チャンネル ピペットを使用して、セルを含むプレートに 2 x 溶解セレンテラジン試薬 50 μ L を追加します。優しくロックやルートで 5-10 分のためのライトの不在のプレートを振る
- 、孵化後プレート リーダーで媒体専用プレートの発光を読み上げます。その後、同じプレート リーダーでセルを含むプレートの発光を読みます。
- プレートを破棄し、データ分析用のファイルを保存します。
- 在庫ソリューション セレンテラジン試薬の準備: 3 M アスコルビン酸ナトリウム [リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、新鮮な準備に溶解]、5 M NaCl、10 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA; ので新鮮で溶存の PBS)、(に溶解した 2 mM セレンテラジン酸性メタノール 10 ml の 3 N HCl の 200 μ L を含む)。
3. データ分析
- 表計算ソフトを使用して初期データ解析を行います。セルと中板からの結果を含むスプレッドシートを作成します。
- 悪い transfected 井戸を識別するためにセル版からデータを手動で検査します。井戸を表示する < 5% - 10% ネガティブ コントロール (S386A) プラスミドの読み出しの考慮すべき悪い transfected でそれらの疑わしいデータの解釈を行います。
- モック transfected 井戸から各板の平均バック グラウンド発光を計算します。そのプレートの値から各板の背景を減算します。
注: この値は使用するプレート リーダーによって無視できます。 - 各ウェルの全体的なルシフェラーゼ活性に比べて中ルシフェラーゼ活性の割合を計算することによってデータを処理します。細胞板細胞に加えて両方の馴化培地を含む媒体専用のプレートに細胞板として同じ馴化培地量が含まれていますので、次の方程式を使用する適切です。
ここでは、RLU 相対発光ユニット、プレート リーダーからバック グラウンド減算読み出しを =。 - 肯定的な制御 (WT) のネガティブ コントロール (S386A) 井戸平均分泌ルシフェラーゼを計算します。
- 13Z 係数を計算することによって実験の全体的な品質を評価します。
注: 肯定的な制御 (WT) は値がアクティブと非アクティブ値がネガティブ コントロール (S386A) 井戸から来る。1 に近い値を示す実験的良質。実験を繰り返し、または値が 0 以下の場合、ワークフローの最適化を検討してください。 - 科学的データ分析ソフトウェアにスプレッドシート プログラムからデータを転送します。
- 0 と 1 と負の制御として肯定的な制御の設定肯定的な制御 (WT) と負の制御 (S386A) の平均値に分泌されたルシフェラーゼ活性を正常化します。
- 外れ値回帰と外れ値除去 (敗走) 法を用いた最大虚偽の発見率を 1% に設定のデータをクリーンアップします。
- (1 の値に正規化) WT 活動の意味に各変異条件 (または変異体) のデータを比較することによって統計的に有意な違いを評価します。複数の対になっていないtを実行-テスト、ホルム Sidak 法と α を用いた多重比較補正 = 0.05。
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Representative Results
高スループット タンパク質アッセイは、3 つの主要な課題を克服するために依存します。まず、シングル売り上げ高 PCSK9 プロテアーゼ抑制に欠けている PCSK9 プロテアーゼの本質的に低い出力を克服するために prodomain は、シーケンスで使用、胸の谷間、prodomain の末尾に分泌された14は、ルシフェラーゼにリンクされています。第二に、プロテアーゼ折ることの必要性を満たすためにその抑制と複雑な prodomain、2 つのポリペプチドが行ったトランスで携帯電話のコンテキスト15,16、経由bicistronic ベクトル。第三に、分解されていない基板からの劈開を区別、PCSK9 プロテアーゼは小胞体 (ER) から複雑な PCSK9 の終了を防ぐことができますが、蛋白分解機能17,18 に影響を与えません C678 に切り詰められます.これで、一緒に取られてに存在し、PCSK9 分解 (図 1 a) のプロキシとして分泌されたルシフェラーゼの評価。アッセイの一般的な期間は短く、アッセイ ベクターのサイト指示された突然変異誘発の手順 (トランスフェクション (3 日目) に続いて日 1-2) およびルシフェラーゼ読み出し (4 日目) すべて最小限の「ハンズオン」時間 (4 日早くに完成図 1 b)。
全体的にみて、この試金はルシフェラーゼ アッセイによって読み出しと PCSK9 分解さまざまな条件下での同時評価できます。集録、処理後、ヒート マップまたは表形式のいずれかでデータを視覚化できます。特に、SNPs のコーディングの遺伝子変異解析は、この方法に適しています。図 2は、PCSK9 プロテアーゼ P6 を介して基板サイト P6 で胸の谷間の配列特異性を評価飽和突然変異誘発ライブラリのヒート マップを示しています '。最適な胸の谷間シーケンスが本質的に重量の順序と同じであることを示した (SSVFAQ |SIPWNL)。特に、P6 や P1 から P4 の突然変異」残基は不十分なプロテアーゼ、浅い、疎水性結合溝と一貫性のある忍容性成熟した、結晶構造のこれらの位置は、PCSK9 を裂かれるため。阻害剤開発の観点からこの狭いシーケンス特異性プロファイルです役に立つ見つける模倣理想化された基板が内因性胸の谷間シーケンスを害さないない通り図 3は、相対的な胸の谷間活動ミスセンス Snp は、診療所で説明 PCSK9 の一次構造にマッピングのライブラリ (重量比) を示しています。以上評価 84 SNPs の半分は WT プロテアーゼ活性に重要な変更を示した。これらの結果は、PCSK9 のプロテアーゼ活性の変化が臨床人口で実際にかなり共通、このような変化はクリニックで見られる LDL コレステロール値の変動を説明するために役立つことがありますをお勧めします。
図 1: 高スループットトランスのPCSK9 胸の谷間アッセイの全体の回路図。(A) このパネル紹介アッセイの生化学的な概略を示しています。基板は、PCSK9 信号シーケンス (ダークグレー) で構成され、prodomain (赤) にリンクできるルシフェラーゼ PCSK9 胸の谷間シーケンス (イエロー) によって (NLuc グリーン) を分泌します。プロテアーゼは、信号シーケンス (ダークグレー)、触媒ドメイン (ライトグレー) C679X 切り捨てを含むシステイン ヒスチジン豊富な (CHR) ドメインで構成されます。基板プロテアーゼのペアは、遺伝子操作を受けやすい 2 a ベースの bicistronic のベクトルの化学量論的量の内です。共発現、プロテアーゼと基板共同を折る、小胞体 (ER) の人里離れたまま。胸の谷間の活動とルシフェラーゼはコンプレックスから解放され、分泌され、それが馴化培地のルシフェラーゼ アッセイによって検出することができます。胸の谷間の活動に潜在的な摂動などが遺伝子操作 (摂動 A) または小さい分子 (摂動 B) の存在に限定されません。(B) このパネルは、全体的な試金のためのタイムラインを示しています。WT プラスミッドのサイト指示された突然変異誘発は、-1、0、トランスフェクション 1 日目と 2 日目で 4 日間の合計タイムラインのルシフェラーゼ アッセイによってその後の日に実行されます。この図は Chorbaらから適応されています。8.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: PCSK9 プロテアーゼの特異性をシーケンスします。(A) 熱のこの図には、プロテアーゼ活性 P6 を P6 の飽和突然変異誘発ライブラリの各単一のアミノ酸変異の背景と、WT に正規化 ' 胸の谷間シーケンス。WT シーケンス id は、上部に両方を示し、白い四角形で強調表示された WT のシーケンスの値で、下部に表示されます。0 (黒) の値は、バック グラウンドのアクティビティと値が +1 (緑) の WT 値を示しますを示します。(B) この熱マップは、赤黒と高い値で値が低い同じ飽和突然変異誘発ライブラリから蛋白値の標準偏差を示しています。白の破線の四角形で記載されている値を表す WT プロテアーゼの大幅に異なる蛋白値を示したホルム Sidak 修正、対になっていないtによって決定される突然変異体-α < 0.05 でテスト。表示されるデータは 3 の独立した実験からそれぞれ 3 の複製を含みます。この図は Chorbaらから適応されています。8.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: タンパク質機能に及ぼす PCSK9 SNPs 。(A) このパネルを示しています、PCSK9 の一次構造信号シーケンス (SS; 黒のアウトライン)、prodomain (赤色のアウトライン)、触媒ドメイン (外枠がグレー)、およびシステイン ヒスチジンを含む豊富なドメイン (CHR; 青のアウトライン)。(B) このパネルには、一次構造にマップされるタンパク質アッセイは、84 臨床 SNPs (黒で縁取られた黄色の長方形) の場所が表示されます。(C) このパネルは、ホルム Sidak 修正対になっていないtによって決定される WT プロテアーゼと比較して大幅に変更されたプロテアーゼ活性と 47 の SNPs の値を示しています-α < 0.05 でテスト。値は、プロテアーゼ活性がないことを示す-1 (赤) の値と値が +1 (シアン) の WT プロテアーゼを 2 倍の改善を示す、PCSK9 の一次構造にマップされます。この図は Chorbaらから適応されています。8.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
表 1: 変異原性 PCR のプライマー デザインのサイト指示します。PCR のプライマーがある示された設計に従ってシーケンス、部分的に重なります。テーブルの下、成功したプライマーの例です。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
| コンポーネント | 株式 | (Μ l) | 最終的な |
| 超純水の H2O | 17.5 | 25 μ L の総ボリュームに | |
| ポリメラーゼ反応バッファー | 5 X | 5 | 1 X |
| 弱まり (dNTPs) | 200 Μ M | 0.5 | 4 Μ M |
| テンプレート (野生型 (WT)) | 2 ng/μ l | 0.5 | 1 ng (合計) |
| プライマー (Fwd) | 20 Μ M | 0.625 | 500 nM |
| プライマー (Rev) | 20 Μ M | 0.625 | 500 nM |
| 忠実度の高い DNA ポリメラーゼ | 2 U/Μ L | 0.25 | 0.5 U (合計) |
表 2: コンポーネントのサイト指示された突然変異誘発 PCR の。コンポーネントは、彼らは反応を開始するまで氷で保たれる混合物と表示が順に追加する必要があります。
| ステップ | 臨時雇用者 (° C) | 時間 | |
| 初期変性 | 1 | 98 | 30 s |
| 変性 | 2 | 98 | 10 s |
| アニール | 3 | (Tm テンプレート) * + 1 | 20 s |
| 拡張機能 | 4 | 72 | 30 s/プラスミド (kb) (4 分) |
| サイクリング | 5 (合計 35 サイクルのステップ 2 に進む) | ||
| 最終的な拡張 | 6 | 72 | 5 分 |
| ホールド | 7 | 12 | ホールド |
| * - プライマーの低い Tm テンプレートを選択 | |||
テーブル 3: PCR のための提案されたサイクリング パラメーター 。推奨パラメーターは、良い出発点を表しますが、最適化が必要な場合があります。
| プライマー | アニーリングの場所 | シーケンス (5' 3') |
| 1 | CMV プロモーター | CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG |
| 2 | PCSK9 A95 | TCTCGCAGTCAGAGCGCAC |
| 3 | NLuc の C 末端 | TGTGCGAACGCATTCTGGCG |
| 4 | PCSK9 C301 | GCCAGCGCCTGGCTAGG |
| 5 | PCSK9 E501 | GAGGCCCAAGGGGGCAAG |
表 4: シーケンス用プライマーを検証します。各プライマーはこのメソッドで参照されているプラスミドのコーディング領域をシーケンス処理で正常に使用されています。
| コンポーネント (株) | 溶菌 (中) | 溶菌 (セル) | 96 ウェル (1 皿) の金額 |
| アスコルビン酸ナトリウム (3 M) | 300 mM | 300 mM | 700 Μ L |
| 塩化ナトリウム (5 M) | 5 mM | 5 mM | 7 Μ L |
| BSA (10 mg/mL, 1%) | 0.10% | - | 700 Μ L |
| トリトン X-100 | - | 0.10% | 7 Μ L |
| PBS | 50 μ L/ウェルに | 50 μ L/ウェルに | 7000 μ L に |
| 0.22 μ m 膜フィルターし、新鮮なチューブに 5880 μ 濾液を移す | |||
| セレンテラジン (2 mM) | 40 Μ M | 40 Μ M | 120 Μ L |
| 容量: 6000 μ | |||
表 5: ルシフェラーゼ読み出し用 2 x coelenterazine 試薬のコンポーネント。非溶解溶解の試薬が馴化培地と transfected セルを別々 に評価するために、分析も必要です。試薬を混合、セレンテラジンを追加する前にフィルタ リングします。セレンテラジン添加後は試薬を光から保護して使用する準備ができるまで。
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Discussion
上記実験の手順は、シングル売り上げ高プロテアーゼ PCSK9 の本質的に低活動を克服し、堅牢な方法でそのタンパク質の機能を評価する方法を提示します。アッセイの重要な概念は、酵素によって増幅された読み出しにシングル売り上げ高イベントを変換するのに依存します。アッセイの強みには、比較的短い時間枠と高スループット方法にそのスケーラビリティと同様、ルシフェラーゼ レポーターの使いやすさが含まれます。さらに、アッセイは、そのネイティブな携帯電話のコンテキストでのタンパク質分解を評価します。さらに、このアッセイで臨床的に識別された Snp を評価できます人間や患者組織を必要とせず PCSK9 分解に及ぼす影響興味の遺伝子型の知識だけが必要です。
アッセイのいくつかの技術的な限界が存在します。アッセイは、細胞内のタンパク質分解を評価、それもベクトルの過剰発現が必要です。アッセイは、HEK293T 細胞のトランスフェクションを必要とするので本質的な井戸からも変動する遺伝子導入効率を追加します。プロテアーゼ死者 S386A PCSK9 はタンパク質分解のネガティブ コントロールとして提供しています、またとして機能自体、transfection のため肯定的な制御以来、これらの細胞を生成機能、細胞内に閉じ込め、ルシフェラーゼとはいえ。トランスフェクション効率の総変化とそれらの細胞を識別するのに役立ちます細胞板の raw データの評価これらのデータを破棄することができます (と実験を繰り返して必要)。さらに、プラスミド配信と転写出力の小さい変動を調整するのに役立ちますを生産合計ルシフェラーゼから分泌されたルシフェラーゼの割合のデータの処理します。同様にセルと馴化培地のルシフェラーゼの出力に影響を与えるこのような変化が期待されます。さらに、このアッセイに用いるベクターは成功のための要件をバイパスするための手段として採用されている市販の Flp-In T レックス 293 線誘導性、同質の安定細胞株の形成に適している脂質を介したトランスフェクションします。これは、PCSK9 のタンパク質分解阻害剤の小分子スクリーニング アッセイを適用するときに、魅力的な機能をする可能性が高いです。日には、このような阻害剤は特定されていない、この試金の重要性をさらに強調します。
PCSK9 プロテアーゼのエンジニア リングには、いくつかの生物学的制約も作成します。まず、アッセイは、WT PCSK9 は、分子内のタンパク質分解ではなく、分子間の PCSK9 蛋白を測定します。一方、これらの 2 つの活動を一般的に関連付ける、すべての生物学的状況でそのような相関関係が存在して、したがって、いくつかの状況cis のPCSK9 胸の谷間でこれらの効果の検証アッセイ、可能性が高い別の方法でそうです。イムノブロットなど必要になる場合があります。また、ミスセンス Snp (および非コーディングのバリエーションの効果ではなく)、アッセイのみ評価できます。最後に、PCSK9 の分解は、PCSK9 分泌の率制限ステップ、PCSK9 のタンパク質分解の減少を期待 (コレステロールの臨床表現型に関する) 機能喪失 PCSK9 バリアントをさせるがこれはないを示すすべての SNPs の真少なくともいくつかの変異追加生物プレイ8時。
このアッセイの有用性は、本質的に低出力プロテアーゼの蛋白の機能を評価する能力にあります。これらのデザイン コンセプトは、同様の課題に苦しむ PCSK9 以外のプロテアーゼに変換します。この変更を実行するには、胸の谷間とルシフェラーゼの分泌の間のリンクを維持するために必要です。基板がある戦略膜アンカーと交換によってルシフェラーゼにリンクされている関心のプロテアーゼに固有一連の胸の谷間はこの要件を満たす必要があります。
要約すると、このプロトコルは高スループット方法で PCSK9 のタンパク質分解を評価する方法について説明します。このメソッドは、PCSK9 のタンパク質分解に及ぼす臨床的 Snp を評価するため、PCSK9 の小分子阻害剤のスクリーニングに有用であります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者に感謝 NHLBI/NIH (K08 HL124068 と LRP HMOT1243)、UCSF 臨床と医療科学研究所触媒プログラム (UL1 TR000004)、UCSF 学術上院ヘルマン財団を通じて NCATS/NIH から寛大な資金調達支援、ギリアド サイエンス研究学者賞、(すべてジョン s. Chorba) ファイザーが熱望する心血管賞、ハワード ヒューズ医学研究所 (に Adri 雅・ ガルバン、ケバン M. Shokat)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
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