Summary
Denne protokol udgør en metode til at vurdere de proteolytiske aktivitet af et uløseligt lav-aktivitet, enkelt omsætning protease i cellulære sammenhæng. Specifikt, kan denne metode anvendes til at vurdere de proteolytiske aktivitet af PCSK9, en vigtig drivkraft for lipid metabolisme hvis proteolytiske aktivitet er nødvendig for dens ultimative hypercholesterolemic funktion.
Abstract
Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) er en enkelt-omsætning protease, der regulerer serumniveauer low-density lipoprotein (LDL) og dermed hjerte-kar-sygdom. Selvom PCSK9 proteolyse er nødvendig for dens fulde hypercholesterolemic virkning, evaluering af dens proteolytiske funktion er udfordrende: PCSK9 vides kun at kløve sig, gennemgår kun en enkelt omsætning og efter proteolyse, bevarer sit Bæremateriale i dets aktive site som en auto-hæmmer. De metoder, der præsenteres her beskrive en analyse, som overvinder disse udfordringer. Analysen fokuserer på intermolekylære proteolyse i en celle-baserede baggrunden og links vellykket kavalergang udskilles luciferase aktivitet, som let kan aflæses på mellemlang og aircondition. Via sekventielle trin mutagenese, forbigående Transfektion og en luciferase udlæsning, analysen kan sonden PCSK9 proteolyse betingelser, enten genetiske eller Molekylær undertrykkelse af netbårne på en måde, høj overførselshastighed. Dette system er velegnet til både biokemiske evaluering af klinisk opdagede missense enkelt-nukleotid polymorfier (SNPs), såvel som for screening af små-molekyle hæmmere af PCSK9 proteolyse.
Introduction
PCSK9 mål LDL receptor (LDL-R) for nedbrydning, rejser LDL kolesterol (LDL-C) og køre aterosklerotisk hjertesygdom1,2. Therapeutics målretning PCSK9 håndfast lavere LDL-C og forbedre hjerte-kar-resultater for patienter, selv når føjet til en aggressiv lipid-sænkende behandling med statiner3,4. Allerede godkendte behandlingsformer er begrænset til antistof-baserede tilgange, dog, og lider af en mangel på omkostningseffektivitet5,6. For at løse dette problem, er billigere terapeutiske alternativer, et middel til at identificere patienter forventes at få større fordele, eller begge dele, nødvendige.
Små-molekyle tilgange kunne målrette intracellulære PCSK9, giver en forbedret indgiftsmåde og reducere omkostningerne, hvilket gør dem den "hellige gral" i dette område7. Men PCSK9 har vist sig vanskeligt at stof af små molekyler. Som en protease er rettet mod PCSK9's proteolytiske funktion en attraktiv strategi, som self-proteolyse er det hastighedsbegrænsende trin i PCSK9 modning8 og er nødvendig for dens maksimal effekt på LDL-R9. Til dato, men denne strategi ikke lykkedes, sandsynligvis på grund af PCSK9's unikke biokemi: PCSK9 kløver kun selve10, udfører en enkelt-omsætning reaktion, og efter self-spaltning, PCSK9 prodomain forbliver bundet i det aktive sted som en Auto-inhibitor11, forhindrer udlæsning af enhver yderligere protease aktivitet.
Denne artikel præsenterer en metode til at vurdere PCSK9 proteolytiske funktion i høj overførselshastighed mode8. Gennem site-directed mutagenese, kan Efterforskere bruge denne analyse for at sonde virkningerne af kodning SNPs fundet i klinikken for at vurdere dem for effekter på proteolyse, det hastighedsbegrænsende trin i PCSK9 modning. Derudover, vil denne metode være nyttige for design af høj overførselshastighed skærme til at identificere modulatorer af PCSK9 proteolyse, som forventes at i sidste ende forstyrre præsentationen af PCSK9 til LDL-R (og modulere PCSK9's hypercholesterolemic virkning) . Endelig kan denne protokol tilpasses andre proteaser med uløseligt lav aktivitet, forudsat at i) en specifik substrat-protease par kan findes, og ii) en egnet intracellulære anker kan fastsættes til underlaget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. site-directed mutagenese af Protease vektor
- Design og ordre custom-syntetiseret oligonukleotider at installere en mutation af interesse ved hjælp af en ændring af standard site-directed mutagenese protokoller12. Standard afsaltede primere (uden yderligere rensning) er helt i orden.
Bemærk: En generel tilgang til primer design indebærer oprettelse delvist overlappende primere, som angivet i tabel 1, ved hjælp af en smeltende temperatur (Tm) Lommeregner specifikke for polymerase af interesse. - Opsætning af polymerase kædereaktion (PCR'er) for site-directed mutagenese på isen, som angivet i tabel 2.
- Cyklus PCR'er, som angivet i tabel 3.
- Kør 2-5 µL af hver PCR på en 1%-agarosegel og visualisere produkter for at bekræfte en vellykket forstærkning.
Bemærk: En vellykket PCR vil vise en enkelt, fremtrædende DNA band pæl omtrentlige størrelse af skabelon (~7.8 kB). - Tilsæt 0,5 µL (pr. 25 µL reaktion) af DpnI og inkuberes prøver ved 37 ° C i 1 time.
- Omdanne 2 µL af reaktion i kemisk kompetente Escherichia coli.
Bemærk: En hurtigt voksende E. coli -stamme vil reducere inkuberingstider, men enhver kloning stamme vil være acceptabel. - Plade transformationer på Luria-Bertani (LB) agar indeholdende 50-100 µg/mL carbenicillin. Inkuber plader natten over ved 37 ° C.
- Vælg 2-4 kolonier til at vokse i en mindre kultur (2-5 mL af LB medium med 50-100 µg/mL carbenicillin). Inkuber kultur ved 37 ° C ved 220 rpm, indtil det er uklare.
- Isolere plasmid DNA fra celler ved hjælp af en plasmid DNA oprensning (dvs., "miniprep") kit ifølge producentens anvisninger. Kvantificere koncentrationen af elueret DNA ved hjælp af et microvolume Spektrofotometer.
- Sekvens plasmid DNA flittigt benytter en Sanger sekventering service (f.eks. en kerne eller kommercielle anlæg). Forberede DNA-prøver efter tjenestens specifikationer. Primere anvendt med succes i forudgående sekventering reaktioner er angivet i tabel 4.
Bemærk: På grund af PCR-amplifikation af den hele plasmid, sekventering af hele PCSK9 kodning regionen anbefales for hver mutant.
2. høj overførselshastighed Luciferase-baserede proteolyse Assay
-
Celle plating (dag 0)
- Bruge lav-passage HEK293T celler for eksperimenter og en kultur i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med 10% føtal bovint serum (FBS). Udføre alle cellens arbejde under sterile forhold i en vævskultur hood indtil klar til assay luciferase aktivitet. Estimere antallet af brønde og plader til eksperimentet, foregribe, at transfections vil blive udført i tre eksemplarer for hver betingelse testet.
- Adskille HEK293T celler fra en moder kolbe ved at behandle dem med en minimal mængde af 0,05% trypsin-ethylendiamintetra syre (EDTA) til at dække cellerne. Inaktivere trypsin-EDTA med 2 bind af DMEM suppleret med 10% FBS og overførsel celler til en steril tube. Tælle cellerne ved hjælp af en automatiseret celle counter (og farvning med trypan blå). Der centrifugeres tube på 500 x g for 5 min at inddrive celler.
- Opsug trypsin-holdige medium og rekonstruere cellerne i dyrkningsmediet til en koncentration på 2 x 105 celler/mL. Ved hjælp af en multikanalpipette, overføre 100 µL af celler til hver brønd med en hvid (uigennemsigtig-bund) 96-brønd plade, som giver en seeding slutkoncentration på 2 x 104 celler/brønd.
Bemærk: Til indledende forsøg, kan det være nyttigt at desuden frø en søster, clear-bundplade-96-brønd, således at overvåge cellevækst og overholdelse i løbet af protokollen og guide fremtidige fejlfinding. - Inkuber cellerne ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer.
- Forberede en master plade af plasmider i 96-brønds format. Fortynd hver plasmid i eluering buffer (Tris-HCl, pH 8,5) til 50 ng/µL i en individuel godt af en 96-brønd plade.
- Forbered 4 brønde til positiv kontrol (WT) plasmid8, negativ kontrol (S386A) plasmid8og plasmid-fri buffer (for mock transfections). Hvis stoffet eller andre cellulære-baserede behandlinger er planlagt, så Forbered dig master pladen med positive kontrol (WT) plasmidet i hver brønd, brønde sammen med 4 hver af negative kontrol (S386A) plasmidet og plasmid-fri buffer.
-
Transfektion (dag 1)
- Forberede Transfektion blandingen i en 96-brønd plade format ved hjælp af deep-godt 96-brønd plader. Udføre transfections i tre eksemplarer, Sørg for at forberede nok reagenser for at tage højde for tab pipettering og overførsel.
Bemærk: Følgende beregninger forberede nok reagens til at køre en 96-brønd plade i tre eksemplarer (anslået konservativt for 420 wells).- Gøre en master mix af en fortyndet lipid Transfektion reagens, tilføje 50,4 µL af reagens til 2050 µL af nedsat serum medium. Gøre en master mix af et DNA precomplexation reagens, tilføjer 33,6 µL af reagens i 1730 µL af nedsat serum medium.
- Ved hjælp af en multikanalpipette, alikvot 16,8 µL af de fortyndede DNA precomplexation reagens blandingen i hver brønd af dyb-godt plade.
- Ved hjælp af en multikanalpipette, alikvot 3,2 µL (160 ng) af hver plasmid fra den master plade i hver brønd af dyb-godt plade.
- Ved hjælp af en multikanalpipette alikvot 20 µL af de fortyndede lipid Transfektion reagens blanding til hver godt af pladen og blande indholdet af hver brønd med en multikanalpipette. Dække pladerne og lad dem sidde ved stuetemperatur (RT) for 10-15 min til form lipid: DNA komplekser.
Bemærk: Efter Transfektion, de endelige komponenter pr. brønd vil være som følger: 40 ng af DNA, 0,12 µL Transfektion reagens og 0,08 µL DNA pre-kompleks reagens, og indholdet af hver godt vil være 10 µL i samlede volumen (nedsat serum medium).
- Forsigtigt udveksling medium på 293T cellerne i 96-brønd plader ved hjælp af en multikanalpipette, pas på ikke at cellerne sprænges. Erstatte den indsugning medium med 95 µL af DMEM suppleret med 10% FBS.
Bemærk: Dette ville være en passende tid til behandling af celler med noget stof af interesse. - Tilføje 10 µL af Transfektion blandingen til hvert fald godt via en multikanalpipette. Forsigtigt swirl plade for at blande indholdet i brøndene. Inkuber plade ved 37 ° C med 5% CO2 i 24 timer.
Note: Den endelige mængden af brøndene kommer til 105 µL, at tage højde for fordampning over 24 h.
- Forberede Transfektion blandingen i en 96-brønd plade format ved hjælp af deep-godt 96-brønd plader. Udføre transfections i tre eksemplarer, Sørg for at forberede nok reagenser for at tage højde for tab pipettering og overførsel.
-
Assay (dag 2)
- Forberede coelenterazine reagenser en stamopløsning: 3 M natrium Ascorbat [opløst i fosfatbufferet saltopløsning (PBS), forberedt friske], 5 M NaCl, 10 mg/mL bovint serumalbumin (BSA, opløst i PBS, tilberedt frisk) og 2 mM coelenterazine (opløst i sur methanol indeholdende 200 µL af 3 N HCl pr. 10 mL).
Bemærk: 2 mM coelenterazine kan opbevares i 2 uger når det opbevares ved-80 ° C og i fravær af lys. - Forberede 2 x coelenterazine reagenser for luciferase udlæsningen, med en separat reagens hver for celler og medium, ifølge tabel 5. Bland alle reagenser Gem coelenterazine først, blandingen filtreres gennem et 0,22 µm sprøjte filter, og derefter tilføje coelenterazine. Beskytte reagenserne fra lys, indtil de er klar til at blive føjet til pladerne.
Bemærk: På grund af tabet af løsning fra filtrering, gør nok reagens for at tage højde for både tab fra filtrering, samt fra overførsler. Tabel 5 viser den endelige koncentration af 2 x reagenser (samt mængden af stamopløsningen tilføje for at oplæse en 96-brønd plade med et reagens). - Fjerne celler fra rugemaskinen 24 h efter Transfektion. Ved hjælp af en multikanalpipette, overføre 50 µL af konditioneret medium fra hver brønd til en frisk, hvid-bund (uigennemsigtig) 96-brønd plade.
- Label plader, om de indeholder medium eller celler. Hvis mere end én 96-brønd plade var transfekteret, label plader for at sikre, at hvert medium-holdige plade er parret med sin overordnede plade af celler.
- Ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 50 µL af 2 x ikke-lytisk coelenterazine reagens til pladen som indeholder kun konditioneret medium. Forsigtigt rock eller ryste pladen i fravær af lys for 5-10 min. ved RT.
- Ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 50 µL af 2 x lytisk coelenterazine reagens til pladen med cellerne. Forsigtigt rock eller ryste pladen i fravær af lys for 5-10 min. ved RT.
- Efter inkubering tilsættes oplæste luminescence af medium-kun plade i en pladelæseren. Derefter oplæste luminescence i den celle, der indeholder plade i den samme pladelæseren.
- Kassér pladerne og gemme filer til dataanalyse.
- Forberede coelenterazine reagenser en stamopløsning: 3 M natrium Ascorbat [opløst i fosfatbufferet saltopløsning (PBS), forberedt friske], 5 M NaCl, 10 mg/mL bovint serumalbumin (BSA, opløst i PBS, tilberedt frisk) og 2 mM coelenterazine (opløst i sur methanol indeholdende 200 µL af 3 N HCl pr. 10 mL).
3. dataanalyse
- Udføre en indledende dataanalyse ved hjælp af regneark software. Oprette et regneark, der indeholder resultater fra cellen og mellemlang plader.
- Manuelt inspicere dataene fra celle plader til at identificere dårligt transfekteret brønde. Brønde, der viser < 5% - 10% af udlæsning af negative kontrol (S386A) plasmidet bør betragtes som dårligt transfekteret, at gøre fortolkningen af disse data mistænkte.
- Beregne de gennemsnitlige baggrundskoncentrationer luminescence af hver plade fra brøndene mock-transfekteret. Trække på baggrund af hver plade fra værdier af denne plade.
Bemærk: Denne værdi kan være ubetydelig afhængigt af pladelæseren bruges. - Proces data ved at beregne andelen af luciferase aktivitet i medium i forhold til den samlede luciferase aktivitet til hver brønd. Fordi celle pladen indeholder både konditioneret medium ud over celler, og medium-kun pladen indeholder den samme mængde konditioneret medium som celle plade, er det hensigtsmæssigt at bruge følgende ligning:
Her, RLU = relativ luminescence enheder, den baggrund-trækkes udlæsning fra i pladelæseren. - Beregn den gennemsnitlige udskilles luciferase af den positive kontrol (WT) og negative kontrolhullerne (S386A).
- Vurdere den samlede kvalitet af eksperimentet ved at beregne en Z-faktor13:
Bemærk: De aktive værdier kommer fra den positive kontrol (WT) og de inaktive værdier kommer fra negative kontrolhullerne (S386A). Værdier tættere til 1 angiver en højere eksperimentelle kvalitet. Overveje at gentage eksperimentet eller optimere arbejdsgangen, hvis værdien er under 0. - Overføre data fra regnearksprogrammet til videnskabelige data analyse software.
- Normalisere udskilles luciferase aktivitet til de gennemsnitlige værdier for den positive kontrol (WT) og den negative kontrol (S386A), angive den positive kontrol som 1 og den negative kontrol som 0.
- Rense data for outliers ved hjælp af metoden regression og outlier fjernelse (FLUGT) angiver den maksimale falske opdagelse sats til 1%.
- Evalueres for statistisk signifikante forskelle ved at sammenligne data for hver mutant tilstand (eller mutant) til middelværdien af WT aktivitet (normaliseret til en værdi af 1). Udføre flere uparret t-test, korrigere for flere sammenligninger ved hjælp af Holm-Sidak metode og α = 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Høj overførselshastighed proteolyse assay er afhængig af at overvinde tre store udfordringer. Først, for at overvinde den uløseligt lavt output af en enkelt-omsætning PCSK9 protease, en PCSK9 protease mangler den hæmmende prodomain er brugt, kavalergang sekvens på halen af den prodomain knyttet til en luciferase, der kan udskilles14. For det andet for at tilfredsstille behovet for protease at folde komplekse med dens hæmmende prodomain, de to polypeptider er coexpressed i trans i en cellulær sammenhæng15,16, via en bicistronic vektor. For det tredje for at differentiere de kløvet fra det uncleaved substrat, er PCSK9 protease afkortet på C678, som forhindrer PCSK9 komplekse exit fra det endoplasmatiske reticulum (ER), men har ingen effekt på proteolytiske funktion17,18 . Tilsammen, dette giver mulighed for en evaluering af de udskilles luciferase som en proxy for tilstedeværelse og graden af PCSK9 proteolyse (figur 1A). Den generelle tidsramme for analysen er korte, med trin af site-directed mutagenese af assay vektor (dage 1 - 2) efterfulgt af den forbigående Transfektion (dag 3) og luciferase udlæsning (dag 4) alle udfyldes så hurtigt som 4 dage, med minimal "hands-on" tid ( Figur 1B).
Samlet set denne analyse giver mulighed for samtidig vurdering af PCSK9 proteolyse under en række betingelser, med udlæsning udført af en luciferase assay. Efter erhvervelse og forarbejdning, kan dataene visualiseres i enten varmekort eller tabelformat. Især er mutationsmønstre analyser af kodning SNPs velegnet til denne tilgang. Figur 2 viser en zonekort af mætning mutagenese bibliotek evaluering kavalergang sekvens specificitet af PCSK9 protease på substrat websteder P6 gennem P6'. Resultaterne viser, at optimal kavalergang sekvens er stort set den samme som WT sekvens (SSVFAQ | SIPWNL). I særdeleshed, mutation af P6 og P4 via P1' rester er dårligt tolereret af protease, overensstemmelse med lavvandede, hydrofobe bindende groove for disse positioner i krystalstruktur af den modne, kløvet PCSK9. Fra synspunkt af hæmmer udvikling er denne smalle sekvens specificitet profil et nyttigt resultat, da det tyder på, at ingen idealiseret substrat mimetiske kunne outcompete den endogene kavalergang sekvens. Figur 3 viser den relative kavalergang aktivitet (i forhold til WT) af et bibliotek af missense SNPs beskrevet i klinikken, kortlagt på PCSK9 primære struktur. Af de 84 SNPs evalueret, over halvdelen viste en betydelig ændring i aktiviteten i forhold til WT protease. Disse resultater tyder på, at ændringer i den PCSK9 proteolytiske aktivitet er faktisk ret almindeligt i den kliniske befolkning, og sådanne ændringer kan bidrage til at forklare variationen i LDL kolesterolniveauer set i klinikken.
Figur 1: Samlede skematisk af høj overførselshastighed i trans PCSK9 kavalergang assay. (A) dette panel viser en biokemiske skematisk af analysen præsenteres her. Substratet består af PCSK9 signal sekvensen (mørk grå) og prodomain (red) knyttet til den luciferase, der kan udskilles (NLuc, grønne) af PCSK9 kavalergang sekvens (gul). Protease består af signal sekvensen (mørk grå), den katalytiske domæne (lys grå) og cystein-histidin rige (CHR) domæne indeholdende C679X afkortes. Substrat-protease par er coexpressed på støkiometriske beløb i en 2A-baserede bicistronic vektor, imødekommenhed over for genmanipulation. Over coexpression, protease og substrat Co fold og fortsat være afsondret i det endoplasmatiske reticulum (ER). Med kavalergang aktivitet, er luciferase befriet fra komplekset og udskilles, hvor det kan påvises ved luciferase analysen af konditioneret medium. Potentielle perturbationer til kavalergang aktivitet omfatter, men er ikke begrænset til, genmanipulation (undertrykkelse af netbårne A) eller tilstedeværelsen af små molekyler (undertrykkelse af netbårne B). (B) dette panel viser tidslinjen for den samlede analyse. Site-directed mutagenese på WT plasmid udføres på dage -1 og 0, efterfulgt af Transfektion på dag 1 og luciferase analysen på dag 2, for en total tidslinje over 4 dage. Dette tal er blevet tilpasset fra Chorba et al. 8. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: sekvens, der kendetegner PCSK9 protease. (A) denne varmekort viser de proteolytiske aktivitet, normaliseret til baggrunden og WT, for hver enkelt aminosyre mutant på P6 gennem P6 en mætning mutagenese bibliotek ' kavalergang sekvens. WT sekvens identitet er vist nederst med værdier for WT sekvensen vist både på toppen og fremhævet af hvidt rektangler. En værdi på 0 (sort) angiver baggrund aktivitet, og en værdi på + 1 (grøn) angiver værdien WT. (B) denne varme kort viser standardafvigelsen af proteolyse værdier fra den samme mætning mutagenese bibliotek, med lavere værdier i sort og højere værdier i rød. Værdier, der er skitseret i hvide stiplede rektangler repræsenterer mutanter, som viste signifikant forskellig proteolyse værdier fra de WT protease, som bestemmes af Holm-Sidak-korrigeret, uparret t-test med α < 0,05. De viste data er fra 3 uafhængige eksperimenter, hver indeholder 3 replikater. Dette tal er blevet tilpasset fra Chorba et al. 8. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: virkningerne af PCSK9 SNPs på proteolytiske funktion. (A) dette panel viser den primære struktur af PCSK9, der indeholder signal sekvensen (SS, sort kontur), prodomain (rød kontur), den katalytiske domæne (grå kontur) og cystein-histidin rig domæne (CHR; blå kontur). (B) dette panel viser placeringen af 84 kliniske SNPs (gul rektangler med sorte konturer) placeret i proteolyse assay, kortlagt på den primære struktur. (C) dette panel viser værdierne af de 47 SNPs med betydeligt ændrede proteolytiske aktivitet i forhold til WT protease, som bestemmes af Holm-Sidak-korrigeret uparret t-test med α < 0,05. Værdierne, der er kortlagt på PCSK9 primære struktur, med en værdi på -1 (rød), der angiver ingen proteolytiske aktivitet og en værdi på + 1 (cyan), der angiver en 2-fold forbedring over WT protease. Dette tal er blevet tilpasset fra Chorba et al. 8. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Site-directed mutagene PCR primer design. PCR-primere har delvist overlappende sekvenser, ifølge design vist. Er vist et eksempel på et vellykket primer par under tabellen. Venligst klik her for at downloade denne fil.
| Komponent | Stock | Volumen (µL) | Endelige |
| Laves H2O | 17,5 | til 25 µL samlede volumen | |
| Polymerase reaktion Buffer | 5 X | 5 | 1 X |
| Deoxynucleotides (dNTP'er) | 200 ΜM | 0,5 | 4 ΜM |
| Skabelon (wild-type (WT)) | 2 ng/µL | 0,5 | 1 ng (i alt) |
| Primer (Fwd) | 20 ΜM | 0,625 | 500 nM |
| Primer (Rev) | 20 ΜM | 0,625 | 500 nM |
| High-Fidelity DNA Polymerase | 2 U/ΜL | 0,25 | 0,5 U (i alt) |
Tabel 2: komponenter af en PCR for site-directed mutagenese. Komponenterne skal tilføjes i den rækkefølge, de er angivet, med blandingen opbevares på is, indtil reaktionen begynder.
| Trin | Temp (° C) | Tid | |
| Indledende denaturering | 1 | 98 | 30 s |
| Denaturering | 2 | 98 | 10 s |
| Udglødning | 3 | (Tm skabelon) * + 1 | 20 s |
| Udvidelse | 4 | 72 | 30 s/kilobase (kb) (4 min) |
| Cykling | 5 (gå til trin 2, 35 cykler i alt) | ||
| Endelige udvidelse | 6 | 72 | 5 min |
| Hold | 7 | 12 | Hold |
| * - Vælg den lavere Tm skabelon af primer par | |||
Tabel 3: foreslåede cykling parametre for PCR. De foreslåede parametre repræsenterer et godt udgangspunkt, men kan kræve optimering.
| Primer | Udglødning placering | Rækkefølge (5' til 3') |
| 1 | CMV promotor | CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG |
| 2 | PCSK9 A95 | TCTCGCAGTCAGAGCGCAC |
| 3 | C-terminus af NLuc | TGTGCGAACGCATTCTGGCG |
| 4 | PCSK9 C301 | GCCAGCGCCTGGCTAGG |
| 5 | PCSK9 E501 | GAGGCCCAAGGGGGCAAG |
Tabel 4: valideret primere til sekvensering. Hver primer har været anvendt med succes i sekventering regionen kodning af plasmider, der refereres til i denne metode.
| Komponent (lager) | Ikke-lytisk (Medium) | Lytisk (celler) | Beløb for 96 brønde (1 plade) |
| Natrium Ascorbat (3 M) | 300 mM | 300 mM | 700 ΜL |
| NaCl (5 M) | 5 mM | 5 mM | 7 ΜL |
| BSA (10 mg/mL, 1%) | 0,10% | - | 700 ΜL |
| Triton X-100 | - | 0,10% | 7 ΜL |
| PBS | Til 50 µL/brønd | Til 50 µL/brønd | Til 7000 µL |
| Der filtreres gennem 0,22 µm membran og overføre 5880 µL af filtratet i frisk tube | |||
| Coelenterazine (2 mM) | 40 ΜM | 40 ΜM | 120 ΜL |
| Total mængde: 6000 µL | |||
Tabel 5: komponenter af 2 x coelenterazine reagenser til luciferase udlæsninger. Både ikke-lytisk og lytisk reagenser er påkrævet for hver brønd, som er analyseret, for at vurdere særskilt konditioneret medium og de transfected celler. Reagenserne blandes og filtreres inden tilsætning af coelenterazine. Efter tilsætning coelenterazine beskytte reagenset fra lys indtil klar til brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eksperimentelle procedurer beskrevet ovenfor præsentere en metode til at overvinde den uløseligt lav aktivitet af single-omsætning protease PCSK9 og evaluere sin proteolytiske funktion på en robust måde. Nøglebegrebet i analysen er afhængig af konvertere en enkelt-omsætning event til en enzymatisk forstærket udlæsning. Styrkerne ved analysen omfatter relativt kort tid-rammen og brugervenligheden af luciferase reporter, såvel som dens skalerbarhed til høj overførselshastighed tilgange. Derudover evaluerer analysen proteolyse i sin oprindelige, cellulære sammenhæng. Desuden, med denne analyse, klinisk identificerede SNPs kan evalueres for deres effekter på PCSK9 proteolyse uden behov for enhver menneskelig eller patient væv; kun kendskab til genotype af interesse er nødvendigt.
Flere tekniske begrænsninger af analysen findes. Selvom analysen evaluerer proteolyse inden for cellen, kræver det også en overekspression af vektoren. Fordi analysen kræver den forbigående Transfektion af HEK293T-cellelinie, tilføjer Transfektion effektivitet til den iboende godt at nå variabilitet. Mens protease-døde S386A PCSK9 fungerer som den negative kontrol for proteolyse, fungerer det også som den positive kontrol for Transfektion selv, da disse celler producerer funktionelle, omend intracellulært fanget luciferase. Vurdering af de rå data af de cellulære plader hjælper med at identificere disse celler med grov variationer i Transfektion effektivitet, og disse data kan blive kasseret (og forsøget gentages hvis ønsket). Desuden, behandling af data for andelen af udskilles luciferase ud af den samlede luciferase produceret hjælper med at justere for mindre variationer i både plasmid levering og transcriptional output. Sådanne variationer ville forventes at påvirke luciferase udgange af cellerne og konditioneret medium på samme måde. Derudover vektorer bruges til dette assay er indstillet til dannelsen af inducerbar, isogene stabil cellelinjer med kommercielt tilgængelige Flp-In T-Rex 293 linje, som har været anvendt med succes som et middel til at omgå kravet om lipid-medieret Transfektion. Dette er sandsynligvis en attraktiv egenskab ved anvendelse af analysen på en små-molekyle screening for PCSK9 proteolyse hæmmere. Til dato, er ingen sådanne hæmmere blevet identificeret, hvilket yderligere understreger betydningen af denne analyse.
Konstruktion af PCSK9 protease skaber også flere biologiske begrænsninger. For det første analysen måler intermolekylære PCSK9 proteolyse, snarere end den intramolekylære proteolyse, der opstår med WT PCSK9. Mens disse to aktiviteter generelt korrelere, er det usandsynligt, at sådan en korrelation i alle biologiske situationer, og således i nogle situationer, kontrol af disse virkninger i en i cis PCSK9 kavalergang assay, sandsynligvis af en alternativ metode såsom immunblot, kan være nødvendig. Analysen kan desuden kun vurdere missense SNPs (og ikke effekten af ikke-kodende variationer). Endelig, selvom PCSK9 proteolyse er det hastighedsbegrænsende trin af PCSK9 sekretion, og reduktion af PCSK9 proteolyse forventes at medføre et tab af funktion PCSK9 variant (vedrørende kliniske kolesterol fænotype), dette er ikke tilfældet for alle SNPs, der angiver at i det mindste for nogle mutationer, ekstra biologi er på play8.
Nytten af denne analyse ligger i dens evne til at evaluere et uløseligt lav-output protease proteolytiske funktion. Disse designkoncepter skal oversættes til proteaser end PCSK9, der lider af lignende udfordringer. For at udføre denne ændring, er det nødvendigt at opretholde forbindelsen mellem kavalergang og luciferase sekretion. En strategi, hvor underlaget er erstattet med en type membran anker knyttet til luciferase via en spaltning sekvens specifikke protease interesse bør opfylde dette krav.
I Resumé beskriver denne protokol en metode til at vurdere PCSK9 proteolyse i en høj overførselshastighed mode. Denne metode vil være nyttigt både for at vurdere effekten af klinisk SNPs på PCSK9 proteolyse, såvel som for screening af små-molekyle hæmmere af PCSK9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke den gavmilde finansiering støtte fra NHLBI/NIH (K08 HL124068 og LRP HMOT1243), NCATS/NIH gennem UCSF klinisk og translationel Science Institute katalysator Program (UL1 TR000004), UCSF akademiske senat, Hellman Foundation, en Gilead Sciences Research Scholar Award, en Pfizer ASPIRE hjerte-kar-Award, (alle til John S. Chorba) og Howard Hughes Medical Institute (at Adri M. Galvan og Kevan M. Shokat).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
- Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
- Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
- Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
- Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
- Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
- Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
- Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
- Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
- Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
- Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
- Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).
