Summary
Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Evaluierung der proteolytischen Aktivität eine intrinsisch Niedrige Aktivität, einzelne Umsatz Protease in einem zellulären Kontext. Insbesondere wird diese Methode angewendet, um die proteolytische Aktivität des PCSK9, ein wesentlicher Bestandteil des Fettstoffwechsels zu bewerten, deren proteolytische Aktivität für ihre ultimative normalem Funktion erforderlich ist.
Abstract
Proprotein Konvertase Subtilisin/Kexin Typ 9 (PCSK9) ist ein Single-Umsatz-Protease die Serumspiegel Low density Lipoprotein (LDL) regelt und damit Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Obwohl PCSK9 Proteolyse für seine volle normalem Wirkung erforderlich ist, die Bewertung ihrer proteolytischen Funktion ist anspruchsvoll: PCSK9 ist nur bekannt, sich Spalten, erfährt nur einen einzigen Umsatz und nach Proteolyse, behält seine Substrat in seiner aktiven Seite als ein Auto-Inhibitor. Die hier vorgestellten Methoden beschreiben eine Probe, die diese Herausforderungen überwindet. Der Test konzentriert sich auf intermolekularen Proteolyse in einem Zell-basierte Kontext und Links erfolgreiche Spaltung die sekretierten Luciferase-Aktivität, die leicht im konditionierten Medium gelesen werden können. Über aufeinander folgenden Schritten Mutagenese, Transiente Transfektion und eine Luciferase auslesen, kann der Test PCSK9 Proteolyse unter Bedingungen von genetischen oder Molekulare Störung in gewissem Sinne Hochdurchsatz-Sonde. Dieses System eignet sich gut für beide die biochemische Auswertung der klinisch entdeckte Missense Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), als auch für das Screening von kleinen Molekül-Inhibitoren des PCSK9 Proteolyse.
Introduction
PCSK9 richtet den LDL-Rezeptor (LDL-R) für den Abbau, Erhöhung von LDL-Cholesterin (LDL-C) und fahren atherosklerotische Herzkrankheit1,2. Therapeutika targeting PCSK9 robust niedrigere LDL-C und Verbesserung der Herz-Kreislauf-Ergebnisse für Patienten, auch wenn eine aggressive lipidsenkenden Therapie mit Statinen3,4hinzugefügt. Derzeit zugelassene Therapien beschränken sich auf Antikörper-basierte Ansätze, und leiden unter mangelnder Wirtschaftlichkeit5,6. Um dieses Problem zu lösen, sind weniger kostspielig therapeutischen Alternativen, ein Mittel zur Identifizierung von Patienten wahrscheinlich größere Vorteile zu erlangen oder beides erforderlich.
Klein-Molekül Ansätze könnten gezielt intrazellulären PCSK9, bieten eine verbesserte Art der Verabreichung und Kosten reduzieren, so dass sie den "Heiligen Gral" in diesem Bereich7. Allerdings ist durch kleine Moleküle PCSK9 schwierig, Drogen nachgewiesen. Als eine Protease ist Ausrichtung PCSK9s proteolytischen Funktion eine attraktive Strategie, wie selbst-Proteolyse der Rate-Begrenzung von PCSK9 Reifung8 ist und für seine maximale Wirkung auf LDL-R9erforderlich ist. Bislang jedoch diese Strategie hat nicht erfolgreich gewesen, wahrscheinlich aufgrund PCSK9s einzigartige Biochemie: PCSK9 spaltet nur selbst10, Durchführung einer Einzel-Umsatz-Reaktion und nach selbst-Spaltung, die PCSK9 prodomain bleibt im aktiven Zentrum als eine Auto-Inhibitor11, verhindert das Auslesen der jede weitere Protease-Aktivität.
Dieser Artikel stellt eine Methode zur Evaluierung PCSK9 proteolytischen Funktion im Hochdurchsatz-Mode8. Durch Site-verwiesene Mutagenese können Ermittler dieser Assay untersuchen die Auswirkungen der Codierung SNPs gefunden in der Klinik, um sie für Auswirkungen auf Proteolyse, die Bandbreitenbegrenzung Schritt des PCSK9 Reifung zu bewerten. Darüber hinaus werden diese Methode nützlich bei der Gestaltung von Hochdurchsatz-Bildschirmen Modulatoren des PCSK9 Proteolyse zu identifizieren, die voraussichtlich letzten Endes stören die Präsentation des PCSK9 auf die LDL-R (und modulieren PCSK9s normalem Effekt) . Zu guter Letzt kann dieses Protokoll andere Proteasen mit intrinsisch geringer Aktivität angepasst werden, vorausgesetzt, dass (i) ein paar spezifische Substrat-Protease gefunden werden kann, und (Ii) ein geeigneter intrazellulärer Anker für das Substrat hergestellt werden kann.
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Protocol
1. Site-verwiesene Mutagenese der Protease-Vektor
- Entwerfen und bestellen Brauch synthetisiert Oligonukleotide, eine Mutation von Interesse, die eine Modifikation der standard Site-verwiesene Mutagenese Protokolle12zu installieren. Standard entsalzten Primer (ohne zusätzliche Reinigung) sind durchaus akzeptabel.
Hinweis: Eine allgemeine Ausrichtung zu Grundierung Designs beinhaltet die Schaffung teilweise überlappender Grundierungen wie in Tabelle 1, unter Verwendung eines schmelzenden Temperatur (Tm) Rechners speziell für die Polymerase von Interesse. - Richten Sie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für die Site-verwiesene Mutagenese auf Eis, wie in Tabelle 2angegeben.
- Die PCRs-Zyklus wie in Tabelle 3angegeben.
- Führen Sie 2 bis 5 µL jeder PCR auf einem 1 % Agarosegel und visualisieren Sie die Produkte, um eine erfolgreiche Verstärkung zu bestätigen.
Hinweis: Eine erfolgreiche PCR zeigen eine einzelne, prominente DNA-Band auf die ungefähre Größe Marker der Vorlage (~7.8 kB). - Fügen Sie DpnI 0,5 µL (pro 25 µL Reaktion) und inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C für 1 h.
- 2 µL der Reaktion in chemisch kompetente Escherichia colizu verwandeln.
Hinweis: Ein schnell wachsenden E. Coli -Stamm verringert die Inkubationszeiten, aber Klonen Dehnung akzeptabel sein wird. - Die Transformationen auf Luria-Bertani (LB) Agar mit 50-100 µg/mL Carbenicillin Platte. Die Platten über Nacht bei 37 ° c inkubieren
- Wählen Sie 2-4 Kolonien wachsen in einer kleinen Kultur (2-5 mL LB-Medium mit 50-100 µg/mL Carbenicillin). Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C bei 220 u/min, bis es trübe ist.
- Isolieren Sie das Plasmid DNA von den Zellen mit einem Plasmid DNA Reinigung (d.h. "Miniprep") Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Konzentration der eluierten DNA mit einem Spektralphotometer Microvolume zu quantifizieren.
- Sequenz das Plasmid DNA ausgiebig mit einem Sanger-Sequenzierung-Service (z. B. ein Kern oder kaufmännischen Facility). Bereiten Sie die DNA-Proben entsprechend dem Leistungsverzeichnis. Primer erfolgreich in vorherige Sequenzierung Reaktionen eingesetzt werden in Tabelle 4aufgeführt.
Hinweis: Durch die PCR Verstärkung des gesamten Plasmids empfiehlt sich die Sequenzierung des gesamten PCSK9 kodierenden Region für jede Mutante.
2. High-Throughput Luciferase-basierte Proteolyse Assay
-
Zelle-Beschichtung (Tag 0)
- Niedrig-Passage HEK293T Zellen für Experimente und eine Kultur in Dulbecco den Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) geändert. Führen Sie alle Zelle arbeiten unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekultur Haube erst unmittelbar vor die Luciferase-Aktivität zu bestimmen. Schätzen Sie die Anzahl von Brunnen und Platten benötigt für das Experiment, davon aus, dass Transfektionen soll, in dreifacher Ausfertigung für jede Bedingung getestet ausgeführt werden.
- Distanzieren Sie HEK293T Zellen aus einem übergeordneten Kolben, indem man sie mit einem minimalen Volumen von 0,05 % Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), um die Zellen zu decken. Inaktivieren die Trypsin-EDTA mit 2 Bände von DMEM mit 10 % FBS und Übertragung ergänzt die Zellen in ein steriles Röhrchen. Zählen der Zellen mit einem automatisierten Zelle Zähler (und Färbung mit Trypan blau). Zentrifugieren Sie das Rohr auf 500 X g für 5 min, um Zellen zu erholen.
- Aspirieren Sie Trypsin-haltigen Medium und rekonstruieren Sie die Zellen in das Kulturmedium zu einer Konzentration von 2 x 105 Zellen/mL. Mit einer Mehrkanal-Pipette übertragen Sie 100 µL der Zellen in jede Vertiefung ein weiß (opak-unten) 96-Well-Platte, verleiht eine Aussaat Endkonzentration von 2 x 104 Zellen/gut.
Hinweis: Für erste Experimente kann es sinnvoll, zusätzlich Saatgut eine Schwester, Clear-unten 96-Well-Platte, um Zellwachstum und Einhaltung während des Protokolls und der Führer zukünftige Fehlerbehebung zu überwachen sein. - Inkubation der Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2 für 24 h.
- Bereiten Sie eine master Platte der Plasmide in eine 96-Well-Format. Verdünnen Sie jedes Plasmid im Elution Buffer (Tris-HCl, pH 8,5), 50 ng/µL in einem einzelnen Brunnen einer 96-Well-Platte.
- Vorbereiten der Positivkontrolle (WT) Plasmid8, negativ-Kontrolle (S386A) Plasmid8und Plasmid-freie Puffer (für mock Transfektionen) 4 Brunnen. Wenn Drogen oder andere Mobilfunk-basierten Behandlungen sind geplant, dann bereiten Sie die master Platte mit der Positivkontrolle (WT) Plasmid in jede Vertiefung, zusammen mit 4 Brunnen des Negativs kontrollieren Sie (S386A) Plasmid und Plasmid-freie Puffer.
-
Transfektion (Tag 1)
- Bereiten Sie die Transfektion Mischung in einem 96-Well-Plattenformat mit Tiefbohrungen 96-Well Platten. Führen Sie die Transfektionen in dreifacher Ausfertigung, dass auf jeden Fall genug Reagenzien zu pipettieren und Übertragung Verluste entfallen vorzubereiten.
Hinweis: Die folgenden Berechnungen bereiten Sie genügend Reagenz eine 96-Well-Platte in dreifacher Ausfertigung (konservativ geschätzt für 420 Brunnen) ausgeführt.- Machen Sie einen master-Mix einem verdünnten Lipid Transfection Reagens, 2050 µL Medium reduziert Serum 50.4 µL Reagenz hinzugefügt. Machen Sie einen master-Mix ein DNA Precomplexation Reagenz, Hinzufügen von 33,6 µL Reagenz in 1730 µL Medium reduziert-Serum.
- Mit Hilfe einer Mehrkanal-Pipette, aliquoten 16,8 µL der verdünnten DNA Precomplexation Reagenz Mischung in jede Vertiefung des Deep-Well-Platte.
- Mit einer Mehrkanal-Pipette, aliquoten 3,2 µL (160 ng) der einzelnen Plasmid von der master Platte in jede Vertiefung des Deep-Well-Platte.
- Mit einer Mehrkanal-Pipette, aliquoten 20 µL der verdünnten Lipid Transfection Reagens Mischung zu jedem gut der Platte und den Inhalt des jeweils gut mit der Mehrkanal-Pipette mischen. Deckplatten Sie die ab und lassen Sie sie bei Raumtemperatur (RT) sitzen für 10-15 min zum Form-Lipid: DNA-komplexe.
Hinweis: Bei der Transfektion, die letzten Komponenten pro Bohrloch werden wie folgt: 40 ng von DNA, 0,12 µL Transfection Reagens und 0,08 µL DNA Pre-Komplexierung Reagenz und des Inhalts der einzelnen gut werden 10 µL Gesamtvolumen (reduzierte Serum-Mittel).
- Tauschen Sie sanft das Medium auf die 293T Zellen in der 96-Well-Platten mit einer Mehrkanal-Pipette, kümmert sich nicht um die Zellen zu stören. Ersetzen Sie die angesaugte Medium mit 95 µL DMEM mit 10 % ergänzt FBS.
Hinweis: Dies wäre der richtige Zeitpunkt für die Zellen bei jedem Medikament von Interesse zu behandeln. - Fügen Sie 10 µL der Transfektion Mischung zu jedem entsprechenden gut über einer Mehrkanal-Pipette. Vorsichtig schwenken die Platte, um den Inhalt in den Vertiefungen mischen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 24 h.
Hinweis: Der letzte Band der Brunnen kommt zu 105 µL, um Verdunstung über 24 h zu berücksichtigen.
- Bereiten Sie die Transfektion Mischung in einem 96-Well-Plattenformat mit Tiefbohrungen 96-Well Platten. Führen Sie die Transfektionen in dreifacher Ausfertigung, dass auf jeden Fall genug Reagenzien zu pipettieren und Übertragung Verluste entfallen vorzubereiten.
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Assay (Tag 2)
- Coelenterazine Reagenzien eine Stammlösung vorbereiten: 3 M Natrium Ascorbat [aufgelöst in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), frisch zubereitet] 5 M NaCl, 10 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA, aufgelöst in PBS, frisch zubereitet) und 2 mM Coelenterazine (aufgelöst gesäuerte Methanol mit 200 µL 3 N HCl pro 10 mL).
Hinweis: Die 2 mM Coelenterazine kann für 2 Wochen gespeichert werden, wenn es bei-80 ° C und in der Abwesenheit von Licht gehalten wird. - Das Luciferase auslesen, mit einem separaten Reagenz für die Zellen und Medium, 2 X coelenterazine Reagenzien gemäß Tabelle 5vorbereiten. Mischen Sie zuerst alle Reagenzien speichern die Coelenterazine, Filtern Sie das Gemisch durch einen 0,22-µm-Spritze-Filter und fügen Sie dann die Coelenterazine. Schützen Sie die Reagenzien vor Licht, bis sie bereit sind, die Platten hinzugefügt werden soll.
Hinweis: Durch den Verlust der Lösung von Filtration stellen Sie genügend Reagenz, für den Verlust von Filtration sowie Transfers zu berücksichtigen. Tabelle 5 zeigt die Endkonzentration von 2 X Reagenzien (sowie die Menge der Stammlösung hinzufügen, um eine 96-Well-Platte mit einem Reagenz auslesen). - Entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator 24 h nach der Transfektion. Mit einer Mehrkanal-Pipette, 50 µL des konditionierten Mediums aus jedem Brunnen auf einen frischen, weißen Boden (undurchsichtig) 96-Well-Platte übertragen.
- Beschriften Sie die Platten, ob sie Mittel "oder" Zellen enthalten. Wenn mehr als eine 96-Well-Platte transfiziert war, beschriften Sie die Platten um sicherzustellen, dass jedes Medium-haltigen Platte mit seiner übergeordneten Platte von Zellen verbunden ist.
- Fügen Sie mithilfe einer Mehrkanal-Pipette 50 µL 2 x nicht-lytische Coelenterazine Reagenz auf die Platte, die nur bedingt Medium enthält. Sanft Schaukeln Sie oder schütteln Sie die Platte in die Abwesenheit von Licht für 5-10 min bei RT
- Fügen Sie mithilfe einer Mehrkanal-Pipette 50 µL 2 X lytische Coelenterazine Reagenz auf die Platte, die die Zellen enthalten. Sanft Schaukeln Sie oder schütteln Sie die Platte in die Abwesenheit von Licht für 5-10 min bei RT
- Nach der Inkubation der Lumineszenz der Medium nur Platte in einem Teller Reader ausgelesen. Dann lesen Sie die Lumineszenz der Zelle-haltigen Platte in der gleichen Platte Leser.
- Entsorgen Sie die Platten und speichern Sie die Dateien für die Datenanalyse.
- Coelenterazine Reagenzien eine Stammlösung vorbereiten: 3 M Natrium Ascorbat [aufgelöst in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), frisch zubereitet] 5 M NaCl, 10 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA, aufgelöst in PBS, frisch zubereitet) und 2 mM Coelenterazine (aufgelöst gesäuerte Methanol mit 200 µL 3 N HCl pro 10 mL).
(3) Datenanalyse
- Eine erste Datenanalyse mit Tabellenkalkulations-Software. Erstellen Sie eine Tabelle mit den Ergebnissen aus der Zelle und die mittlere Platten.
- Manuell überprüfen Sie die Daten aus den Zellplatten, schlecht transfizierte Brunnen zu identifizieren. Wells, die zeigen, < 5 % - 10 % für das Auslesen des Plasmids Negativkontrolle (S386A) betrachtet werden als schlecht transfiziert, wodurch die Interpretation dieser Daten verdächtigen.
- Berechnen Sie die durchschnittliche Hintergrund Lumineszenz von jeder Platte aus den Mock-transfizierten Brunnen. Subtrahieren Sie den Hintergrund jeder Platte von den Werten dieser Platte.
Hinweis: Dieser Wert kann je nach der Platte-Leser verwendet vernachlässigbar. - Die Daten durch die Berechnung des Anteils der Luciferase-Aktivität in das Medium im Vergleich zu der Luciferase Gesamtaktivität für jedes gut verarbeiten. Da der Zellplatte sowohl konditionierten Medium neben Zellen enthält und die Medium nur Platte die gleiche Menge an konditionierten Medium als Zellplatte enthält, empfiehlt es sich, verwenden Sie die folgende Gleichung:
Hier, RLU = relative Lumineszenz Einheiten, das Hintergrund subtrahiert Auslesen aus dem Teller-Leser. - Berechnen Sie die mittlere sekretierten Luciferase der Positivkontrolle (WT) und die negativ-Kontrolle (S386A) Brunnen.
- Bewerten Sie die Gesamtqualität des Experiments durch die Berechnung einer Z-Faktor13:
Hinweis: Die aktiven Werte stammen aus der Positivkontrolle (WT) und die inaktive Werte stammen aus der negativ-Kontrolle (S386A) Brunnen. Werte näher zu 1 zeigen eine höhere Qualität der experimentellen. Betrachten Sie das Experiment zu wiederholen oder den Workflow zu optimieren, wenn der Wert kleiner als 0 ist. - Übertragen Sie die Daten aus der Tabellenkalkulation in wissenschaftliche Datenanalyse-Software.
- Normalisieren Sie die sekretierten Luciferase Aktivität auf die Mittelwerte der Positivkontrolle (WT) und der negativen Kontrolle (S386A), die positive Kontrolle als 1 und der negativen Kontrolle als 0 festlegen.
- Bereinigen Sie die Daten für Ausreißer mit der Regression und Ausreißer entfernen (Flucht)-Methode, wenn die maximale false Discovery Rate auf 1 %.
- Bewertung für statistisch signifikante Unterschiede durch Vergleich der Daten für jeden mutierten Zustand (oder Mutant) zum Mittelwert der WT-Aktivität (normiert auf den Wert 1). Führen Sie mehrere ungepaarte t-Tests, Korrektur für multiple Vergleiche mit dem Holm-Sidak Methode und α = 0,05.
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Representative Results
Hochdurchsatz-Proteolyse Assay stützt sich auf drei große Herausforderungen zu überwinden. Erstens ist zur Überwindung der intrinsisch geringen Leistung eines Single-Umsatz PCSK9 Protease, ein PCSK9 Protease fehlt die hemmenden prodomain mit der Spaltung Sequenz am Ende der prodomain verwendet, verbunden mit einer Luciferase, die sekretierten14sein können. Zweitens coexpressed zu der Notwendigkeit der Protease zu Falten Komplex mit seinen hemmenden prodomain, zwei Polypeptide sind in Trans in einem zellulären Kontext15,16, über ein Bicistronic-Vektor. Drittens wird zur Unterscheidung von dem uncleaved Substrat der gespalten, PCSK9 Protease an C678, abgeschnitten, die verhindert, dass der Ausgang des komplexen PCSK9 aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) hat aber keine Auswirkung auf die proteolytischen Funktion17,18 . Zusammengenommen, ermöglicht dies eine Bewertung der sekretierten Luciferase als Proxy für die Präsenz und den Grad des PCSK9 Proteolyse (Abbildung 1A). Die allgemeinen Zeitrahmen des Assays ist kurz, mit den Schritten des Site-verwiesene Mutagenese der Assay-Vektor (Tage 1 - 2) gefolgt von der Transiente Transfektion (Tag 3) und Luciferase auslesen (Tag 4) alle so schnell wie 4 Tage, mit "Hands-on" Mindestzeit (fertiggestellt Abbildung 1 b).
Insgesamt ermöglicht dieses Assay für die simultane Auswertung des PCSK9 Proteolyse unter verschiedensten Bedingungen, mit der Anzeige durch eine Luciferase Assay durchgeführt. Nach der Erfassung und Verarbeitung können die Daten in tabellarischer Form oder Heatmap visualisiert werden. Mutationszucht Analysen der Codierung SNPs eignen sich insbesondere für diesen Ansatz. Abbildung 2 zeigt eine Heatmap einer Sättigung Mutagenese Bibliothek bewerten die Spaltung Sequenz Besonderheit des PCSK9 Protease am Substrat Standorten P6, P6'. Die Ergebnisse zeigen, dass die optimale Dekolleté-Sequenz im Wesentlichen identisch mit der WT-Sequenz (SSVFAQ | SIPWNL). Vor allem die Mutation des P6 oder P4 durch P1 "Rückstände von Protease, Einklang mit der flachen, hydrophobe Bindung Nut schlecht toleriert wird, für diese Positionen in der Kristallstruktur von den Reifen, PCSK9 gespalten. Aus der Sicht der Inhibitor Entwicklung ist dieses schmale Sequenz Spezifität Profil eine nützliche Erkenntnis, wie es schon vermuten lässt, dass keine idealisierten Substrat mimetischen die endogenen Spaltung Sequenz verdrängen könnte. Abbildung 3 zeigt die relative Spaltung (verglichen mit WT) aus einer Bibliothek von Missense SNPs beschrieben in der Klinik auf die Primärstruktur PCSK9 vorgezeichnet. 84 SNPs ausgewertet zeigte die Hälfte über eine wesentliche Änderung in Aktivität im Vergleich zu den WT-Protease. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Änderungen in der PCSK9 proteolytische Aktivität in der Tat recht häufig in der klinischen Bevölkerung sind, und solche Veränderungen helfen können, um zu erklären, die Variabilität der LDL-Cholesterinspiegel in der Klinik gesehen.
Abbildung 1: Insgesamt Schaltplan des Hochdurchsatz- Trans PCSK9 Spaltung Assays. (A) dieses Panel zeigt einen biochemische Schaltplan des hier vorgestellten Tests. Das Substrat besteht aus PCSK9 Signalsequenz (dunkelgrau) und die prodomain (rot) mit der Luciferase, die sein können (NLuc, grüne) sezerniert PCSK9 Spaltung Sequenz (gelb). Die Protease besteht aus der Signalsequenz (dunkelgrau), die katalytische Domäne (hellgrau) und Cystein-Histidin reichen (CHR) Domain mit den C679X abschneiden. Das Substrat-Protease-Paar ist bei stöchiometrischen Mengen in einem 2A-basierte Bicistronic Vektor, genetische Manipulationen zugänglich coexpressed. Auf Coexpression die Protease und Substrat zusammen Falten und abgesonderten in das endoplasmatische Retikulum (ER). Mit Dekolleté Aktivität ist die Luciferase befreit vom Komplex und sezerniert, wo es durch die Luciferase Assay des konditionierten Mediums erkannt werden kann. Mögliche Störungen der Spaltung Aktivität beinhalten, aber beschränken sich nicht auf genetische Manipulation (Störung A) oder das Vorhandensein von kleinen Molekülen (Störung B). (B) dieses Panel zeigt die Zeitachse für die gesamte Assay. Site-verwiesene Mutagenese auf dem WT-Plasmid wird an den Tagen-1 und 0, gefolgt von der Transfektion am 1. Tag und die Luciferase Assay an Tag 2, für eine gesamte Timeline von 4 Tagen durchgeführt. Diese Zahl wurde angepasst von Chorba Et al. 8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Sequenz Spezifität der PCSK9 Protease. (A) diese Heatmap zeigt die proteolytische Aktivität, normiert auf Hintergrund und WT, für jede einzelne Aminosäure-Mutante von einer Sättigung Mutagenese Bibliothek von P6 durch P6 "Spaltung Sequenz. Die WT-Sequenz-Identität ist an der Unterseite, mit den Werten für die WT-Sequenz jeweils oben angezeigt und hervorgehoben durch weiße Rechtecke angezeigt. Ein Wert von 0 (schwarz) zeigt Hintergrundaktivitäten und einem Wert von + 1 (grün) zeigt den WT-Wert. (B) diese Wärme Karte zeigt die Standardabweichung der Proteolyse Werte aus der gleichen Sättigung Mutagenese-Bibliothek, mit niedrigeren Werten in schwarz und höhere Werte in rot. Werte in weiße gestrichelte Rechtecke darstellen Mutanten, die deutlich unterschiedliche Proteolyse Werte von derjenigen der WT-Protease, zeigte nach Holm-Sidak korrigiert, ungepaarten t-Tests mit α < 0,05. Die angezeigten Daten sind aus 3 unabhängigen Experimenten, jeweils 3 Wiederholungen. Diese Zahl wurde angepasst von Chorba Et al. 8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Auswirkungen der PCSK9 SNPs auf proteolytischen Funktion. (A) dieses Panel zeigt die Primärstruktur des PCSK9, enthält die Signalsequenz (SS, schwarzer Umrandung), der prodomain (rote Umriss) und die katalytische Domäne (graue Umriss) Cystein-Histidin reiche Domäne (CHR; blau umrandet). (B) dieses Panel zeigt die Lage von 84 klinische SNPs (gelbe Rechtecke mit schwarzen Konturen) platziert in der Proteolyse-Assay, auf die primäre Struktur abgebildet. (C) dieses Panel zeigt die Werte 47 SNPs mit signifikant veränderten proteolytische Aktivität im Vergleich zu der WT-Protease bestimmt Holm Sidak korrigiert ungepaarten t-Tests mit α < 0,05. Die Werte werden auf der PCSK9 Primärstruktur, mit einem Wert von-1 (rot) zeigt keine proteolytische Aktivität und ein Wert von + 1 (Cyan), eine Verbesserung der 2-fold über die WT-Protease abgebildet. Diese Zahl wurde angepasst von Chorba Et al. 8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Tabelle 1: Site-verwiesene Mutagene PCR besser gekleideteres Design. PCR-Primer haben teilweise überlappende Sequenzen, nach dem Entwurf angezeigt. Ein Beispiel für eine erfolgreiche Primerpaar wird unterhalb der Tabelle angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
| Komponente | Lager | Volumen (µL) | Endgültige |
| Hochreine H2O | 17.5 | 25 µL Gesamtvolumen | |
| Polymerase-Reaktion-Puffer | 5 X | 5 | 1 X |
| Deoxynucleotides (dNTPs) | 200 ΜM | 0,5 | 4 ΜM |
| Vorlage (Wildtyp (WT)) | 2 ng/µL | 0,5 | 1 ng (Gesamt) |
| Grundierung (Fwd) | 20 ΜM | 0,625 | 500 nM |
| Grundierung (Rev.) | 20 ΜM | 0,625 | 500 nM |
| High-Fidelity-DNA-Polymerase | 2 U/ΜL | 0,25 | 0,5 U (Gesamt) |
Tabelle 2: Komponenten eines PCR für Site-verwiesene Mutagenese. Die Komponenten sollten in der Reihenfolge hinzugefügt werden, in denen sie, mit der Mischung auf Eis gehalten aufgeführt sind, bis die Reaktion beginnt.
| Schritt | Temperatur (° C) | Zeit | |
| Anfängliche Denaturierung | 1 | 98 | 30 s |
| Denaturierung | 2 | 98 | 10 s |
| Glühen | 3 | (T-m-Vorlage) * + 1 | 20 s |
| Erweiterung | 4 | 72 | 30 s/Kilobase (kb) (4 min) |
| Radfahren | 5 (gehen Sie zu Schritt2, 35 Zyklen insgesamt) | ||
| Letzte Erweiterung | 6 | 72 | 5 min |
| Halten | 7 | 12 | Halten |
| * - Wählen Sie die untere Tm Vorlage von Primerpaar | |||
Tabelle 3: Empfohlene Radsport Parameter für die PCR. Die vorgeschlagenen Parameter bilden einen guten Ausgangspunkt aber Optimierung erfordern.
| Grundierung | Lage glühen | Sequenz (5' 3') |
| 1 | CMV-Förderer | CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG |
| 2 | PCSK9 A95 | TCTCGCAGTCAGAGCGCAC |
| 3 | C-Terminus des NLuc | TGTGCGAACGCATTCTGGCG |
| 4 | PCSK9 C301 | GCCAGCGCCTGGCTAGG |
| 5 | PCSK9 E501 | GAGGCCCAAGGGGGCAAG |
Tabelle 4: Primer zur Sequenzierung überprüft. Jede Grundierung wird erfolgreich eingesetzt in der Sequenzierung der kodierenden Region des Plasmide in dieser Methode verwiesen wird.
| Komponente (Bestand) | Nicht-lytische (Medium) | Lytischen (Zellen) | Betrag für 96 Wells (1 Platte) |
| Natrium Ascorbat (3 M) | 300 mM | 300 mM | 700 ΜL |
| NaCl (5 M) | 5 mM | 5 mM | 7 ΜL |
| BSA (10 mg/mL, 1 %) | 0,10 % | - | 700 ΜL |
| Triton x-100 | - | 0,10 % | 7 ΜL |
| PBS | Zu 50 µL/well | Zu 50 µL/well | Bis 7000 µL |
| Durch 0,22 µm Membran Filtern und 5880 µL Filtrat in frischen Rohr übertragen | |||
| Coelenterazine (2 mM) | 40 ΜM | 40 ΜM | 120 ΜL |
| Gesamtvolumen: 6000 µL | |||
Tabelle 5: Komponenten von 2 X coelenterazine Reagenzien zur Luciferase auslesen. Nicht-lytische und lytische Reagenzien sind erforderlich für jedes gut, das analysiert wird, um die konditionierten Medium und transfizierten Zellen separat zu bewerten. Die Reagenzien sind gemischt und vor der Zugabe von den Coelenterazine gefiltert. Nach der Zugabe Coelenterazine ist schützen Sie das Reagenz bis einsatzbereit vor Licht.
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Discussion
Die oben beschriebenen Versuchsverfahren präsentieren eine Methode zum überwinden der intrinsisch niedrigen Aktivität der einzelnen Umsatz Protease PCSK9 und seine proteolytische Funktion in einer robusten Weise zu bewerten. Der Schlüsselbegriff des Assays stützt sich auf ein Single-Umsatz-Ereignis in einer enzymatisch verstärkte Auslesen umzuwandeln. Die Stärken des Assays gehören die relativ kurzen Zeitrahmen und Benutzerfreundlichkeit der Luciferase Reporter, als auch die Skalierbarkeit für Hochdurchsatz-Ansätze. Darüber hinaus wertet der Assay Proteolyse in seinem bodenständigen, zellulären Kontext. Darüber hinaus können mit dieser Assay klinisch ermittelten SNPs auf ihre Auswirkungen auf PCSK9 Proteolyse ohne die Notwendigkeit für alle Menschen oder Patienten Gewebe ausgewertet werden; nur sind der Genotyp des Interesses erforderlich.
Mehrere technische Einschränkungen des Assays vorhanden sein. Obwohl der Test Proteolyse innerhalb der Zelle auswertet, bedarf es auch einer Überexpression des Vektors. Da der Test die Transiente Transfektion der Zelllinie HEK293T erforderlich ist, fügt Transfektion Effizienz auf die inneren Brunnen-Brunnen-Variabilität. Während die Protease-Toten S386A PCSK9 als Negativkontrolle für Proteolyse dient, dient es auch als Positivkontrolle für die Transfektion selbst, da diese Zellen produzieren funktionelle, wenn auch intrazellulär gefangen, Luciferase. Auswertung der Rohdaten der zellulären Platten hilft, um diese Zellen mit grober Variationen in Transfection Leistungsfähigkeit, zu identifizieren und diese Daten verworfen werden können (und das Experiment wiederholen, falls gewünscht). Darüber hinaus produziert die Verarbeitung der Daten für den Anteil der sekretierten Luciferase aus der gesamten Luciferase hilft, für kleinere Variationen in Plasmid Lieferung und transkriptionelle Ausgabe anzupassen. Solche Variationen dürften die Luciferase-Ausgänge der Zellen und der konditionierten Medium ähnlich beeinflussen. Darüber hinaus sind die Vektoren für diese Assay verwendet zur Bildung von induzierbaren, isogenen stabilen Zelllinien mit der im Handel erhältlichen Flp-In T-Rex 293-Linie, die als ein Mittel, um die Anforderung für umgehen mit Erfolg beschäftigt zugänglich Lipid-vermittelten Transfektion. Dies wird voraussichtlich ein attraktives Feature sein, wenn den Test auf eine kleine Molekül-Screening für PCSK9 Proteolyse Inhibitoren anwenden. Bisher wurden keine solchen Inhibitoren identifiziert weiter unterstreicht die Bedeutung des Assays.
Das Engineering der PCSK9 Protease schafft auch mehrere biologische Einschränkungen. Zuerst misst der Test intermolekulare PCSK9 Proteolyse, anstatt die Intramolekulare Proteolyse, die mit WT PCSK9 auftritt. Während diese beiden Tätigkeiten im allgemeinen korrelieren, ist es unwahrscheinlich, dass solch ein Zusammenhang in allen biologischen Situationen besteht, und somit in einigen Situationen die Überprüfung dieser Effekte in einer Spaltung in GUS PCSK9 assay, wahrscheinlich durch eine alternative Methode z. B. Immunoblot kann erforderlich sein. Darüber hinaus kann der Test nur Missense SNPs (und nicht die Wirkung der nicht-codierenden Varianten) ausgewertet werden. Schließlich, obwohl PCSK9 Proteolyse die Bandbreitenbegrenzung Schritt des PCSK9-Sekretion ist, und die Reduzierung des PCSK9 Proteolyse dazu führen, dass eine Verlust der Funktion PCSK9-Variante voraussichtlich wird (in Bezug auf die klinische Cholesterin-Phänotyp), dies gilt nicht für alle SNPs, unter Angabe zumindest für einige Mutationen, zusätzliche Biologie spielen8steht.
Das Dienstprogramm des Assays liegt in seiner Fähigkeit, die proteolytische Funktion eine intrinsisch Low-Output-Protease zu bewerten. Diese Konzepte sollten Proteasen als PCSK9 übersetzen, die unter ähnlichen Problemen leiden. Um diese Änderung durchzuführen, ist es notwendig, die Verbindung zwischen Spaltung und Luciferase Sekretion aufrechtzuerhalten. Eine Strategie, wo das Substrat wird, mit einer Art Membran Anker habe ich ersetzt verbunden mit der Luciferase über eine Spaltung Sequenz spezifisch für die Protease von Interesse sollte diese Anforderung erfüllen.
Zusammenfassend lässt sich sagen beschreibt dieses Protokoll eine Methode für die Bewertung der PCSK9 Proteolyse in einer Hochdurchsatz-Mode. Diese Methode wird sowohl für die Bewertung der Wirkung von klinischen SNPs auf PCSK9 Proteolyse, als auch für das Screening von kleinen Molekül-Inhibitoren des PCSK9 nützlich.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken die großzügige finanzielle Unterstützung vom NHLBI/NIH (K08 HL124068 und LRP HMOT1243), NCATS/NIH durch die UCSF klinische und Translationale Wissenschaft Institut Catalyst-Programm (UL1 TR000004), des akademischen Senats von UCSF Hellman-Stiftung, eine Gilead Sciences Research Scholar Award, dem ASPIRE Pfizer Herz-Kreislauf-Award (alle John S. Chorba) und dem Howard Hughes Medical Institute (zum Adri M. Galvan und Kevan M. Shokat).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
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