Summary
Detta protokoll presenterar en metod för att utvärdera den proteolytiska aktiviteten av en inneboende lågaktivt, enda omsättning proteashämmare i cellulära sammanhang. Specifikt, används denna metod för att utvärdera den proteolytiska aktiviteten av PCSK9, en viktig drivkraft i lipidmetabolismen vars proteolytiska verksamhet krävs för dess ultimata hypercholesterolemic funktion.
Abstract
Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) är en singel-omsättning proteas som reglerar low-density lipoprotein (LDL) serumnivåer och därmed hjärt-kärlsjukdom. Även om PCSK9 proteolys krävs för dess full hypercholesterolemic effekt, utvärdering av dess proteolytiska funktion är utmanande: PCSK9 är endast känt att klyva sig genomgår bara en enda omsättning och efter proteolys, behåller dess substrat i dess aktiva platsen som en auto-hämmare. De metoder som presenteras här beskriva en analysmetod som övervinner dessa utmaningar. Analysen fokuserar på intermolekylära proteolys i en cell-baserade sammanhang och länkar framgångsrika klyvning till aktiviteten utsöndrade luciferas, som enkelt kan läsas i konditionerat medium. Via sekventiella steg mutagenes, övergående transfection och en luciferas avläsning, analysen kan probe PCSK9 proteolys under förhållanden av antingen genetisk eller molekylär störning på ett sätt som hög genomströmning. Detta system är väl lämpad för såväl biokemiska utvärdering av kliniskt identifierade missense singel-nukleotid polymorfismer (SNP), samt för när det gäller screening av småmolekylär hämmare av PCSK9 proteolys.
Introduction
PCSK9 riktar den LDL-receptorn (LDL-R) för nedbrytning, höja LDL-kolesterol (LDL-C) och körning aterosklerotisk hjärtsjukdom1,2. Therapeutics inriktning PCSK9 kraftfullt sänka LDL-C och förbättra kardiovaskulärt utfall för patienter, även när de läggs till en aggressiv lipidsänkande behandling med statiner3,4. För närvarande godkända behandlingar är begränsad till antikroppsbaserade metoder, dock och lider av bristande kostnadseffektivitet5,6. För att lösa problemet, behövs billigare behandlingsalternativ, ett sätt att identifiera patienter sannolikt att vinna större fördelar, eller båda.
Småmolekylär metoder kunde rikta intracellulära PCSK9, ger en förbättrad administreringsväg och minska kostnaderna, vilket gör dem till den ”heliga Graalen” i detta område7. Dock PCSK9 har visat sig svårt att drogen av små molekyler. Som ett proteas är inriktning PCSK9's proteolytiska funktion en attraktiv strategi, som själv-proteolys är det hastighetsbegränsande steget i PCSK9 mognad8 som krävs för dess maximal effekt på LDL-R9. Hittills har dock denna strategi har inte varit framgångsrika, sannolikt på grund av PCSK9's unika biokemi: PCSK9 klyver endast själv10, utför en enda-omsättning reaktion, och efter self-klyvning, PCSK9 prodomain förblir bundna i den aktiva platsen som en Auto-hämmare11, förhindra avläsningen av någon ytterligare proteas aktivitet.
Denna artikel presenterar en metod för att utvärdera PCSK9 proteolytiska funktionen i hög genomströmning mode8. Via webbplats riktad mutagenes, kan utredare använda denna analys för att undersöka effekterna av kodning SNPs hittades i kliniken för att bedöma dem för effekter på proteolys, det hastighetsbegränsande steget i PCSK9 mognad. Dessutom, kommer att denna metod vara användbart i utformningen av hög genomströmning skärmar att identifiera modulatorer av PCSK9 proteolys, som förväntas i slutändan störa presentationen av PCSK9 till LDL-R (och modulera PCSK9's hypercholesterolemic effekt) . Avslutningsvis kan detta protokoll anpassas till andra proteaser med egensäkra låg aktivitet, förutsatt att i) ett visst substrat-proteas par kan hittas, och ii) en lämplig intracellulära ankare kan fastställas för substratet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. webbplats riktad mutagenes av proteashämmare vektor
- Designa och Beställ custom-synthesized oligonukleotider att installera en mutation av intresse med hjälp av en ändring av standard webbplats riktad mutagenes protokoll12. Standard desalted grundfärger (utan ytterligare rening) är helt acceptabel.
Obs: En generell strategi för primer design handlar om att skapa delvis överlappande primers som anges i tabell 1, med en smältande temperatur (Tm) kalkylator specifikt för polymerasen sevärdheter. - Ställ in polymeras kedjereaktioner (primärvården) för det webbplats riktad mutagenicitet på isen, som anges i tabell 2.
- Cykla i primärvården som anges i tabell 3.
- Kör 2-5 µL av varje PCR på en 1% agarosgel och visualisera produkterna för att bekräfta en framgångsrik förstärkning.
Obs: En framgångsrik PCR visas en enda, framstående DNA band vid ungefärliga storleken markör av mallen (~7.8 kB). - Tillsätt 0,5 µL (per 25-µL reaktion) av DpnI och inkubera proverna vid 37 ° C i 1 h.
- Omvandla 2 µL av reaktionen i kemiskt behöriga Escherichia coli.
Obs: En snabbt växande E. coli -stam kommer att minska inkubationstider, men någon kloning stam kommer att vara acceptabelt. - Tallrik omformningarna på Luria-Bertani (LB) agar som innehåller 50-100 µg/mL carbenicillin. Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C.
- Välj 2-4 kolonier att växa i en småskalig kultur (2-5 mL LB medium med 50-100 µg/mL carbenicillin). Inkubera kulturen vid 37 ° C 220 rpm tills det är grumligt.
- Isolera plasmiden DNA från cellerna med en plasmid DNA rening (dvs, ”miniprep”) enligt tillverkarens anvisningar. Kvantifiera koncentration av eluerade DNA med en microvolume spektrofotometer.
- Sekvens av plasmid DNA i stor utsträckning använder en Sanger sekvensering tjänst (t.ex. en kärna eller kommersiell anläggning). Förbereda de DNA-proverna enligt tjänstens specifikationer. Primers används framgångsrikt i föregående sekvensering reaktioner anges i tabell 4.
Obs: På grund av den PCR-amplifiering av hela plasmiden, sekvensering av hela PCSK9 kodande regionen rekommenderas för varje mutant.
2. high-throughput luciferas-baserade proteolys Assay
-
Cell plätering (dag 0)
- Använd låg-passage HEK293T celler för experiment och en kultur i Dulbeccos modifierad Eagle medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS). Utföra alla cell arbete under sterila förhållanden i vävnadsodling huva tills till assay aktiviteten luciferas. Uppskatta antalet brunnar och plattor behövs för experimentet, förutse att transfections kommer att utföras i tre exemplar för varje villkor som testas.
- Separera HEK293T celler från en förälder mätkolv genom att behandla dem med en minimal mängd 0,05% trypsin-etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) att täcka cellerna. Inaktivera den trypsin-EDTA med 2 volymdelar DMEM kompletteras med 10% FBS och överföra celler till ett sterilt rör. Räkna cellerna använder en automatiserad cell räknare (och färgning med trypan blå). Centrifugera röret vid 500 x g i 5 min att återställa celler.
- Aspirera trypsin-innehållande medium och rekonstruera cellerna i odlingsmediet till en koncentration på 2 x 105 celler/mL. Med hjälp av en flerkanalspipett, överföra 100 µL av cellerna till varje brunn av en vit (ogenomskinlig-botten) plattan med 96 brunnar, vilket ger en sådd slutkoncentration på 2 x 104 celler per brunn.
Obs: För första försök, det kan vara användbar till dessutom frön en syster, clear-botten plattan med 96 brunnar, för att övervaka celltillväxt och följsamhet under protokollet och guide framtida felsökning. - Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 för 24 h.
- Förbereda en tryckplåt av plasmider i 96 brunnar format. Späd varje plasmid i eluering buffert (Tris-HCl, pH 8,5) till 50 ng/µL i en enskild brunn av en plattan med 96 brunnar.
- Förbered 4 brunnar varje för positiv kontroll (WT) plasmid8, negativ kontroll (S386A) plasmid8och plasmid-fri buffert (för håna transfections). Om läkemedel eller andra cellular-baserade behandlingar planeras, sedan förbereda master plattan med positiv kontroll (WT) plasmiden i varje brunn, brunnar tillsammans med 4 varje negativ kontrollplasmid (S386A) och plasmid-fri bufferten.
-
Transfection (dag 1)
- Förbereda transfection blandningen i plattan med 96 brunnar format använder djup-väl 96 brunnar. Utför transfections i tre exemplar, att se till att förbereda tillräckligt reagenser för pipettering och överföra förluster.
Obs: Följande beräkningar förbereda tillräckligt reagens att köra en plattan med 96 brunnar i tre exemplar (uppskattad konservativt för 420 brunnar).- Gör en master mix av utspädda lipid transfection reagens, lägga till 50,4 µL av reagens till 2050 µL av minskad-serum medium. Gör en master mix av DNA precomplexation reagens, lägga till 33,6 µL av reagens in 1730 µL av minskad-serum medium.
- Med hjälp av en flerkanalspipett, alikvotens 16,8 µL utspädda DNA precomplexation reagens blandningen i varje brunn av deep-väl plattan.
- Med hjälp av en flerkanalspipett, alikvotens 3,2 µL (160 ng) av varje plasmid från master plattan i varje brunn av deep-väl plattan.
- Med hjälp av en flerkanalspipett, alikvotens 20 µL utspädda lipid transfection reagens blandningen till var väl av plattan och blanda innehållet i varje brunn med hjälp av en flerkanalspipett. Täck plattorna och låt dem stå i rumstemperatur (RT) för 10-15 min till formuläret lipid: DNA komplex.
Obs: Vid transfection, de sista komponenterna per brunn kommer att vara följande: 40 ng DNA, 0,12 µL transfection reagens och 0,08 µL av DNA pre-komplexering reagens, och innehållet i var väl blir 10 µL i total volym (minskad-serum medium).
- Försiktigt exchange medium på 293T cellerna i 96 brunnar plattorna med hjälp av en flerkanalspipett, noga med att inte störa cellerna. Ersätta det aspirerade mediet med 95 µL av DMEM kompletteras med 10% FBS.
Obs: Detta skulle vara ett lämpligt tillfälle att behandla cellerna med någon drog av intresse. - Tillsätt 10 µL transfection blandningen i varje lämplig väl via en flerkanalspipett. Snurra försiktigt på plattan för att blanda innehållet i brunnarna. Inkubera plattan vid 37 ° C med 5% CO2 för 24 h.
Obs: Sista volymen av brunnarna kommer till 105 µL, att redovisa avdunstning över 24 h.
- Förbereda transfection blandningen i plattan med 96 brunnar format använder djup-väl 96 brunnar. Utför transfections i tre exemplar, att se till att förbereda tillräckligt reagenser för pipettering och överföra förluster.
-
Assay (dag 2)
- Förbereda en stamlösning för coelenterazine reagens: 3 M natriumaskorbat [upplöst i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), beredda färska], 5 M NaCl, 10 mg/mL bovint serumalbumin (BSA; upplöst i PBS, beredda färska) och 2 mM coelenterazine (upplöst i surgjord metanol som innehåller 200 µL 3 N HCl per 10 mL).
Obs: De 2 mM coelenterazine kan lagras i 2 veckor när den förvaras vid-80 ° C och i avsaknad av ljus. - Förbered 2 x coelenterazine reagens för luciferas utläsningen, med en separat reagens varje för celler och medium, enligt tabell 5. Blanda alla reagenser Spara coelenterazine först, filtrera blandningen genom ett filter med 0,22 µm i sprutan och sedan lägga till coelenterazine. Ljuskänsligt reagenserna tills de är redo att läggas till plattorna.
Obs: På grund av förlusten av lösning från filtrering, göra tillräckligt reagens att redovisa både förlusten från filtrering samt från överföringar. Tabell 5 visar den slutliga koncentrationen av 2 x reagenserna (liksom mängden stamlösning lägga till för att läsa ut en plattan med 96 brunnar med en reagens). - Ta bort celler från inkubatorn 24 h efter transfection. Med hjälp av en flerkanalspipett, överföra 50 µL av konditionerat medium från varje brunn till en fräsch, vit botten (ogenomskinlig) plattan med 96 brunnar.
- Etikett plattorna att om de innehåller medium eller celler. Om mer än en plattan med 96 brunnar var transfekterade, märka plattorna för att säkerställa att varje medium-innehållande platta är parkopplad med dess överordnade platta celler.
- Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 50 µL av 2 x icke-lytisk coelenterazine reagens till plattan som innehåller bara luftkonditionerade medium. Försiktigt rock eller skaka plattan i frånvaro av ljus för 5-10 min på RT.
- Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 50 µL av 2 x lytisk coelenterazine reagens till plattan som innehåller celler. Försiktigt rock eller skaka plattan i frånvaro av ljus för 5-10 min på RT.
- Efter inkubering, läste ut luminiscens av medium-bara plattan i en spektrofotometer. Läs sedan ut luminiscens av cell-innehållande plattan i samma tallrik läsaren.
- Kassera plattorna och spara filerna för dataanalys.
- Förbereda en stamlösning för coelenterazine reagens: 3 M natriumaskorbat [upplöst i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), beredda färska], 5 M NaCl, 10 mg/mL bovint serumalbumin (BSA; upplöst i PBS, beredda färska) och 2 mM coelenterazine (upplöst i surgjord metanol som innehåller 200 µL 3 N HCl per 10 mL).
3. dataanalys
- Utföra en inledande dataanalys använder kalkylprogram. Skapa ett kalkylblad som innehåller resultaten från cellen och medelstora plattorna.
- Inspektera manuellt data från cell plattorna att identifiera dåligt transfekterade brunnar. Brunnar som visar < 5% - 10% av avläsningen av negativa kontrollplasmid (S386A) bör betraktas som dåligt transfekterade, vilket gör tolkningen av dessa data misstänkte.
- Beräkna den genomsnittliga bakgrund luminiscens av varje platta från mock-transfekterade brunnarna. Subtrahera bakgrunden av varje platta från värdena för det plätera.
Obs: Detta värde kan vara försumbar beroende på den spektrofotometer som används. - Processen data genom att beräkna andelen luciferas aktivitet på medellång jämfört med den allmänna luciferas aktiviteten för varje brunn. Eftersom cellen plattan innehåller både luftkonditionerade medium förutom celler och medium-bara plattan innehåller samma mängd av konditionerat medium som cell plattan, är det lämpligt att använda följande ekvation:
Här, RLU = relativ luminiscens enheter, bakgrund-subtraheras utslaget från plattan läsaren. - Beräkna den genomsnittliga utsöndrade luciferas av den positiva kontrollen (WT) och de negativa kontrollbrunnarna (S386A).
- Utvärdera den övergripande kvaliteten på experimentet genom att beräkna en Z-faktor13:
Obs: Aktiva värdena kommer från den positiva kontrollen (WT) och inaktiva värden kommer från de negativa kontrollbrunnarna (S386A). Värden närmare 1 indikerar en högre experimentella kvalitet. Överväg att upprepa experimentet eller optimera arbetsflödet om värdet är under 0. - Överföra data från kalkylbladsprogrammet in vetenskapliga data analysprogram.
- Normalisera aktiviteten utsöndrade luciferas att medelvärdena för den positiva kontrollen (WT) och den negativa kontrollen (S386A), ange den positiva kontrollen som 1 och den negativa kontrollen som 0.
- Rensa data för extremvärden metoden regression och avvikare borttagning (ROUT), ställa in den maximala falska upptäckten hastigheten till 1%.
- Utvärdera för statistiskt signifikanta skillnader genom att jämföra data för varje mutant skick (eller mutant) till medelvärdet för aktiviteten WT (normaliserad till värdet 1). Utföra flera oparat t-test, korrigera för multipla jämförelser med hjälp av Holm-Sidak metod och α = 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hög genomströmning proteolys analysen bygger på att övervinna tre stora utmaningar. Först, för att övervinna egensäkra låg produktionen av ett singel-omsättning PCSK9 proteas, en PCSK9 proteashämmare saknar den hämmande prodomain används med klyvning sekvens på svansen av den prodomain kopplade till ett luciferas som kan utsöndras14. För det andra för att tillfredsställa behovet av proteashämmare att vika i komplex med dess hämmande prodomain, de två polypeptiderna är coexpressed i trans i en cellulär sammanhang15,16, via en bicistronic vektor. För det tredje för att skilja den klyvs från uncleaved underlaget, trunkeras den PCSK9 proteasen vid C678, som förhindrar avfarten på den komplexa PCSK9 från endoplasmatiska retiklet (ER) men har ingen effekt på proteolytiska funktion17,18 . Sammantaget kan en utvärdering av den utsöndrade luciferas som en proxy för förekomst och grad av PCSK9 proteolys (figur 1A). Den allmänna tidsramen analysens är kort, med steg av webbplats riktad mutagenes vektorns assay (dagar 1 - 2) följt av den övergående transfection (dag 3) och luciferas avläsning (dag 4) alla färdigställdes så snabbt som 4 dagar, med minimal ”hands-on” tid () Figur 1B).
Sammantaget möjliggör denna analys samtidig utvärdering av PCSK9 proteolys under olika förhållanden, med avläsningen görs av ett luciferas assay. Efter förvärvet och bearbetning, kan data visualiseras i antingen värmekarta eller tabellformat. Mutationsanalys analyser av kodning SNP är särskilt väl lämpade för detta tillvägagångssätt. Figur 2 visar en intensitetskarta av mättnad mutagenes bibliotek utvärdera klyvning sekvens specificitet i PCSK9 proteas på substrat webbplatser P6 genom P6'. Resultaten visar att den optimala klyvning sekvensen är väsentligen samma som sekvensen WT (SSVFAQ | SIPWNL). I synnerhet, mutationen av P6 eller P4 genom P1' rester tolereras dåligt av proteasen, konsekvent med grunt, hydrofoba bindande spåret för dessa positioner i kristallstrukturen i de mogna, klyvs PCSK9. Med utgångspunkt från inhibitorutveckling är denna smala sekvens specificitet profil en användbar slutsats, eftersom det antyder att ingen idealiserade substrat mimetiska kunde konkurrera ut sekvensen endogena klyvning. Figur 3 visar den relativa klyvning aktivitet (jämfört med WT) av ett bibliotek av missense SNP beskrivs i kliniken, kartlagt på PCSK9 primära strukturen. För 84 SNP utvärderas, över hälften visade en betydande förändring i aktivitet jämfört med de WT proteashämmaren. Dessa resultat tyder på att förändringar i PCSK9 proteolytiska aktiviteten är faktiskt ganska vanligt i kliniska befolkningen, och sådana ändringar kan hjälpa till att förklara variationerna i LDL-kolesterolnivåer som sett i kliniken.
Figur 1: Övergripande Schematisk hög genomströmning i trans PCSK9 klyvning analysens. (A) i denna panel visas en biokemisk Schematisk av analysen presenteras här. Underlaget består av PCSK9 signal sekvensen (mörkgrå) och prodomain (red) kopplade till den luciferas som kan utsöndras (NLuc, grön) av PCSK9 klyvning sekvensen (gul). Proteasen består av sekvensen signal (mörkgrå), den katalytiska domänen (ljusgrå) och cystein-histidin rik (CHR) domänen som innehåller C679X trunkering. Paret substrat-proteas är coexpressed på stökiometriska belopp i en 2A-baserade bicistronic vektor, kan bli föremål för genetisk manipulation. Vid coexpression, de proteas och substrat tillsammans vik och förbli beslagtagna i det endoplasmatiska retiklet (ER). Med klyvning aktivitet, är luciferas befriade från anläggningen och utsöndras, där det kan upptäckas av luciferas analysen av konditionerat medium. Potentiella störningar till klyvning aktivitet inkluderar, men är inte begränsade till, genmanipulation (störning A) eller förekomsten av små molekyler (störning B). (B) denna panel visar tidslinjen för övergripande analysen. Webbplats riktad mutagenes på WT plasmiden utförs på dag -1 och 0, följt av transfection på dag 1 och luciferas analysen på dag 2, för en total tidslinje på 4 dagar. Denna siffra har anpassats från Chorba o.a. 8. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: sekvens specificitet i PCSK9-proteas. (A) denna värmekarta visar den proteolytiska aktiviteten, normaliserade till bakgrund och WT, för varje enskild aminosyra mutant av en mättnad mutagenes bibliotek av P6 genom P6' klyvning sekvens. WT sekvens identitet visas längst ned, med värden för WT sekvensen visas både på toppen och belysts av vita rektanglar. Värdet 0 (svart) anger bakgrund aktivitet och ett värde på + 1 (grön) anger värdet WT. (B) denna värme karta visar standardavvikelsen för proteolys värden från samma mättnad mutagenes bibliotek, med lägre värden i svart och högre värden i rött. Värden som beskrivs i vit streckad rektanglar representerar mutanter som visade signifikant proteolys värden från det av den WT-proteasen, som bestäms av Holm-Sidak-korrigerad, oparat t-test med α < 0,05. De data som visas är från 3 oberoende experiment, vardera innehållande 3 replikat. Denna siffra har anpassats från Chorba o.a. 8. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: effekter av PCSK9 SNP på proteolytiska funktion. (A) denna panel visar den primära strukturen av PCSK9, som innehåller sekvensen signal (SS; svart kontur), den prodomain (röd konturen), den katalytiska domänen (grå kontur) och den cystein-histidin rika domän (CHR; blå kontur). (B) i denna panel visas platsen för 84 kliniska SNP (gula rektanglar med svarta konturer) placeras i proteolys analysen, mappas till den primära strukturen. (C) i denna panel visas värdena för 47 SNP med avsevärt förändrad proteolytiska aktivitet jämfört med de WT-proteasen, som bestäms av Holm-Sidak-korrigerade oparat t-test med α < 0,05. Värdena är mappade till PCSK9 primär struktur, med ett värde av -1 (röd) som indikerar ingen proteolytiska aktivitet och ett värde på + 1 (cyan) som anger en 2-faldig förbättring över de WT proteashämmaren. Denna siffra har anpassats från Chorba o.a. 8. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Tabell 1: webbplats-regisserad mutagena PCR primer design. PCR primers har delvis överlappande sekvenser, enligt design visas. Ett exempel på en framgångsrik primer par visas under tabellen. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
| Komponent | Beståndet | Volym (µL) | Slutliga |
| Ultrarena H2O | 17,5 | till 25 µL total volym | |
| Polymeras reaktion buffert | 5 X | 5 | 1 X |
| Deoxinukleotider (dNTP) | 200 ΜM | 0,5 | 4 ΜM |
| Mall (vildtyp (WT)) | 2 ng/µL | 0,5 | 1 ng (totalt) |
| Primer (Fwd) | 20 ΜM | 0,625 | 500 nM |
| Primer (Rev) | 20 ΜM | 0,625 | 500 nM |
| HiFi-DNA-polymeras | 2 U/ΜL | 0,25 | 0,5 U (totalt) |
Tabell 2: komponenter i en PCR för webbplats riktad mutagenes. Komponenter bör läggas i den ordning de är listade, med blandningen förvaras på is tills reaktionen börjar.
| Steg | Temp (° C) | Tid | |
| Inledande denaturering | 1 | 98 | 30 s |
| Denaturering | 2 | 98 | 10 s |
| Glödgning | 3 | (Tm mall) * + 1 | 20 s |
| Förlängning | 4 | 72 | 30 s/kilobase (kb) (4 min) |
| Cykling | 5 (gå till steg 2, 35 cykler totalt) | ||
| Slutliga förlängning | 6 | 72 | 5 min |
| Håll | 7 | 12 | Håll |
| * - Välja lägre Tm mall av primer par | |||
Tabell 3: föreslagna cykling parametrar för PCR. De föreslagna parametrarna utgör en bra utgångspunkt men kan kräva optimering.
| Primer | Glödgning läge | Sekvens (5' till 3') |
| 1 | CMV arrangören | CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG |
| 2 | PCSK9 A95 | TCTCGCAGTCAGAGCGCAC |
| 3 | C-terminus av NLuc | TGTGCGAACGCATTCTGGCG |
| 4 | PCSK9 C301 | GCCAGCGCCTGGCTAGG |
| 5 | PCSK9 E501 | GAGGCCCAAGGGGGCAAG |
Tabell 4: validerade primers för sekvensering. Varje primer har använts framgångsrikt i sekvensering kodande regionen av plasmidsna refereras i denna metod.
| Komponent (lager) | Icke-lytisk (Medium) | Lytisk (celler) | Belopp för 96 brunnarna (1 tallrik) |
| Natriumaskorbat (3 M) | 300 mM | 300 mM | 700 ΜL |
| NaCl (5 M) | 5 mM | 5 mM | 7 ΜL |
| BSA (10 mg/mL, 1%) | 0,10% | - | 700 ΜL |
| Triton x-100 | - | 0,10% | 7 ΜL |
| PBS | Till 50 µL per brunn | Till 50 µL per brunn | Till 7000 µL |
| Filtrera genom 0,22 µm membran och överföra 5880 µL av filtratet i färska tube | |||
| Coelenterazine (2 mM) | 40 ΜM | 40 ΜM | 120 ΜL |
| Total volym: 6000 µL | |||
Tabell 5: komponenter i 2 x coelenterazine reagenser för luciferas utläsningar. Både icke-lytisk och lytisk reagenser som krävs för varje brunn som analyseras, så att separat utvärdera betingade medium och de transfekterade cellerna. Reagenserna är blandade och filtreras innan coelenterazine. Efter coelenterazine tillägg, ljuskänsligt reagens tills klar för användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De experimentella procedurer som beskrivs ovan presenterar en metod för att övervinna den egensäkra låg aktiviteten av den enda-omsättning proteasen PCSK9 och utvärdera dess proteolytiska funktion i ett robust sätt. Nyckelbegreppet i analysen bygger på omvandla en singel-omsättning händelse till en enzymatiskt förstärkta avläsning. Styrkan i analysen är relativt kort tid och användarvänlighet av luciferas reportern, liksom dess skalbarhet till hög genomströmning strategier. Dessutom utvärderar analysen proteolys i dess infödda, cellulära sammanhang. Med denna analys, kan dessutom kliniskt identifierade SNP utvärderas för deras effekter på PCSK9 proteolys utan att någon mänsklig eller patientens vävnad; krävs endast kunskap av genotyp av intresse.
Flera tekniska begränsningar i analysen finns. Även om analysen utvärderar proteolys i cellen, kräver det också ett överuttryck av vektorn. Eftersom analysen kräver den övergående transfection av raden HEK293T cell, lägger transfection effektivitet till inneboende väl-att-väl variabiliteten. Medan den proteas-döda S386A PCSK9 fungerar som den negativa kontrollen för proteolys, tjänar också som positiv kontroll för transfection själv, eftersom dessa celler producerar funktionella, om än intracellulärt instängd, luciferas. Utvärdering av raw data av cellulära pläterar hjälper till att identifiera de cellerna med brutto variationer i transfection effektivitet, och dessa data kan kastas (och experimentet upprepas om önskas). Dessutom producerade behandling av uppgifterna för andelen av utsöndrade luciferas ur den totala luciferas hjälper till att justera för mindre variationer i både plasmid leverans och transkriptionell utdata. Sådana variationer kan förväntas påverka luciferas utgångarna av cellerna och det luftkonditionerade mediet likaså. Dessutom vektorer används för denna analys är mottagliga för bildandet av inducerbara, syngena stabil cellinjer med kommersiellt tillgängliga Flp-In T-Rex 293-linjen, som har använts med framgång som ett sätt att kringgå krav för lipid-medierad transfection. Detta är sannolikt att vara en attraktiv funktion när du tillämpar analysen på en småmolekylär screening för PCSK9 proteolys hämmare. Hittills har har inga sådana hämmare identifierats, vilket ytterligare understryker vikten av denna analys.
Konstruktion av den PCSK9 proteasen skapar också flera biologiska begränsningar. Första analysen mäter intermolekylära PCSK9 proteolys, snarare än de intramolekylära proteolys som uppstår med WT PCSK9. Medan dessa två verksamheter generellt korrelerar, är det osannolikt att sådana en korrelation finns i alla biologiska situationer och, således, i vissa situationer, kontrollen av dessa effekter i en i cis PCSK9-klyvning analys, troligen genom en alternativ metod såsom immunoblot, kan behövas. Analysen kan dessutom bara utvärdera missense SNP (och inte verkan av icke-kodande variationer). Slutligen, om PCSK9 proteolys är det hastighetsbegränsande steget av PCSK9 sekretion och minskning av PCSK9 proteolys förväntas orsaka en förlust-av-funktion PCSK9 variant (avseende den kliniska kolesterol fenotypen), detta är inte sant för alla SNP, som anger att åtminstone för vissa mutationer, ytterligare biologi är på spela8.
Nyttan av denna analys ligger i dess förmåga att utvärdera ett intimt låg-output proteas proteolytiska funktion. Dessa designkoncept bör översätta till proteaser än PCSK9 som lider av liknande utmaningar. För att utföra denna ändring, är det nödvändigt att upprätthålla länken mellan klyvning och luciferas sekretion. En strategi där underlaget är ersatt med en typ jag membran ankare kopplat till luciferas via en klyvning-sekvens som är specifika för proteasen av intresse bör uppfylla detta krav.
Sammanfattningsvis beskriver det här protokollet en metod för utvärdering PCSK9 proteolys i en hög genomströmning mode. Denna metod kommer att vara användbart både för att utvärdera effekten av kliniska SNP på PCSK9 proteolys, liksom för screening av småmolekylär hämmare av PCSK9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar generöst finansiering stöd från NHLBI/NIH (K08 HL124068 och LRP HMOT1243), NCATS/NIH genom UCSF klinisk och translationell Science Institute katalysator Program (UL1 TR000004), UCSF akademiska senaten, Stiftelsen Hellman, en Gilead Sciences Research Scholar Award, en Pfizer ASPIRE hjärt-Award (alla John S. Chorba) och Howard Hughes Medical Institute (till Adri M. Galvan och Kevan M. Shokat).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
- Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
- Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
- Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
- Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
- Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
- Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
- Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
- Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
- Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
- Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
- Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).
