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Immunology and Infection

सेलुलर तनाव का आकलन और असतत ऑक्सीटोसिन में सूजन-स्रावी मस्तिष्क नाभिक नवजात चूहे में पहले और बाद में पहली कोलोस्ट्रम खिला

Published: November 14, 2018 doi: 10.3791/58341
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1, 1, 1, 4, 1,2
1Department of Psychiatry, Columbia University, 2Department of Pathology & Cell Biology, Columbia University Medical Center, 3Department of Psychiatry, Division of Molecular Imaging and Neuropathology, New York State Psychiatric Institute, 4EB Sciences

Summary

यहाँ, हम पहली कोलोस्ट्रम खिला के साथ संयोजन के रूप में नवजात चूहे मस्तिष्क में मस्तिष्क नाभिक को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद. इस तकनीक मस्तिष्क में पोषक तत्वों की कमी तनाव के अध्ययन के रूप में enterocyte संकेत द्वारा संग्राहक की अनुमति देता है ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य नवजात मस्तिष्क में ऑक्सीटोसिन रिसेप्टर रिच ब्रेन नाभिक को अलग करने से पहले और पहले कोलोस्ट्रम खिलाने के बाद है । चयापचय तनाव का जवाब करने के लिए जाना जाता प्रोटीन की अभिव्यक्ति मस्तिष्क में मापा गया था-नाभिक पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर अलग. यह आकलन करने के लिए किया गया था कि चयापचय तनाव प्रेरित शरीर में पोषक तत्व कमी न्यूरॉन तनाव ट्रिगर. हम पहले दिखा दिया है कि नवजात शिशुओं में पोषक तत्वों की कमी आंत में चयापचय तनाव में लाना । इसके अलावा, कोलोस्ट्रम ऑक्सीटोसिन सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया, सूजन, और autophagy मार्कर नवजात चूहे आंत में विल्ली से पहले और पहले फ़ीड के बाद संग्राहक । संकेत प्रोटीन मार्करों endoplasmic जालिका तनाव के साथ जुड़े [एर निगरानी बाध्यकारी immunoglobulin प्रोटीन (बिप), eukaryotic अनुवाद दीक्षा फैक्टर 2a (eIF2a), और eIF2a कळेनासे प्रोटीन कळेनासे आर (पी-PKR)], के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दो सूजन-संकेतन प्रोटीन [नाभिकीय कारक-κB (NF-kB) और अवरोध करनेवाला κB (IkB)], नवजात मस्तिष्क नाभिक में मापा गया [एकांत पथ के नाभिक (एनटीएस), paraventricular नाभिक (PVN), ऊपर अर्थ का उपसर्ग (बेटा) नाभिक, प्रांतस्था (CX), striatum नाभिक (STR), और औसत दर्जे का ऑप्टिक नाभिक (MPO)] पहले फ़ीड से पहले (कोलोस्ट्रम द्वारा प्रधानमंत्री) और नर्सिंग की शुरुआत के बाद (कोलोस्ट्रम द्वारा प्रधानमंत्री) । बिप/GRP78 और पी-eIF2a की अभिव्यक्ति प्रधानमंत्री एनटीएस ऊतक में और downregulated में अनियमित थे । nf-kb (उच्च) CX, STR, और MPO कोशिका द्रव्य में रखा गया था, जबकि nf-kb था कम और अपरिवर्तित में एनटीएस, PVN, और बेटा दोनों स्थितियों में । सामूहिक बिप और पी-eIF2 निष्कर्षों एक तनाव की प्रतिक्रिया के अनुरूप हैं । eIf2a पुत्र, CX, STR, और MPO में dsRNA आश्रित कळेनासे (पी-PKR) द्वारा phosphorylated था । हालांकि, एनटीएस में (और PVN में एक हद तक कम करने के लिए), eIf2a एक और कळेनासे, जनरल नियंत्रण nonderepressible-2 कळेनासे (GCN2) द्वारा phosphorylated था । तनाव संग्राहक पहले नवजात आंत enterocytes में मनाया तंत्र कुछ ओटीआर संपंन मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रतिबिंबित होना दिखाई देते हैं । एनटीएस और PVN अंय क्षेत्रों से (पोषक तत्वों की कमी के तहत) एक अलग फास्फारिलीकरण तंत्र का उपयोग कर सकते है और पोषक तत्वों की कमी के प्रभाव को दुर्दम्य । सामूहिक रूप से, इस डेटा पता चलता है कि पोषक तत्वों की कमी तनाव को मस्तिष्क प्रतिक्रियाओं कोलोस्ट्रम-प्रधानमंत्री enterocytes से संकेत द्वारा ऑफसेट हैं ।

Introduction

जल्दी मस्तिष्क दिनों के पाठ्यक्रम पर होने वाली विकास की हमारी समझ के विपरीत करने के लिए सप्ताह प्रसवोत्तर, अपेक्षाकृत कम गतिशील चूहों में जीवन के पहले घंटे में होने वाली परिवर्तन के असंख्य के बारे में जाना जाता है । एक प्रमुख चुनौती नवजात चूहे मस्तिष्क के छोटे आकार और उच्च तकनीक उपकरणों के लिए एक आवश्यकता असतत मस्तिष्क क्षेत्रों या एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया गया है । अध्ययन अक्सर जीन प्रतिलेखन का आकलन नहीं है और1,2अनुवाद नहीं है, जो सक्रिय संकेतन अणुओं के कार्यात्मक स्तर की एक फर्म समझ नहीं देता है । अंय अभिव्यक्ति की जांच immunohistochemistry का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क क्षेत्र है, जो अभिव्यक्ति3स्तर के ठहराव के लिए अनुमति नहीं है । तारीख करने के लिए कोई अध्ययन असतत मस्तिष्क क्षेत्रों में चूहों पहले कोलोस्ट्रम फ़ीड के साथ जुड़े संकेत रास्ते के सक्रियकरण की जांच की है, जो तेजी से अलगाव और बलिदान और प्रोटीन की अभिव्यक्ति और प्रोटीन की माप की आवश्यकता है फास्फारिलीकरण पश्चिमी का उपयोग सोख्ता. जबकि मस्तिष्क microdissection पुराने और बड़े दिमाग पर किया जाता है, हम एक P0 मस्तिष्क में एक गैर एकल सेल मस्तिष्क पंच प्रदर्शन एक संदर्भ की पहचान नहीं है । इस कागज नवजात मस्तिष्क के प्रतिबंधित क्षेत्रों को अलग एक अपेक्षाकृत कम तकनीक पंच तकनीक और एक पश्चिमी सोख्ता प्रक्रिया का उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत छोटे नमूनों में प्रोटीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है । यह प्रोटोकॉल अनुसंधान प्रश्नों के लिए उपयुक्त हो सकता है कि प्रोटीन की अभिव्यक्ति और बाद के मूल्यांकन की आवश्यकता होती है अनुवादात्मक संशोधनों (जैसे, फास्फारिलीकरण) किसी भी प्रजाति के छोटे दिमाग के अपेक्षाकृत प्रतिबंधित क्षेत्रों में, बशर्ते कि उपयोगकर्ता नेत्रहीन एक एटलस और पहचाने स्थलों के साथ ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र की पहचान कर सकते हैं ।

इस तकनीक को नवजात चूहों की पहली कोलोस्ट्रम फ़ीड, जो ऑक्सीटोसिन (OT) में समृद्ध है का एक परिणाम के रूप में मस्तिष्क में होने वाले परिवर्तन को समझने के लिए विकसित किया गया था । OT गया है लंबे समय से अपने दूध चलो-नीचे और गर्भाशय संकुचन को उत्तेजित करने की क्षमता के लिए जाना जाता है । हालांकि, अब ओटी कई शारीरिक कार्यों और व्यवहार4के विनियमन में भूमिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला खेलने के लिए जाना जाता है । उदाहरण के लिए, OT तनाव और अनुकूली affiliative व्यवहार5, देरी गैस्ट्रिक खाली करने के साथ संयोजन के रूप में सूजन का विरोध करता है, और आंत्र पारगमन धीमा कर देती है । ओटी रिसेप्टर्स (ओटीआर) दर्जी न्यूरॉन्स और आंतों उपकला में पहचान की गई है6,7,8. OT के गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल प्रभाव प्रारंभिक जन्मोत्तर अवधि के दौरान विशेष रूप से शिशु के लिए महत्वपूर्ण हैं । उदाहरण के लिए, स्तनपान नवजात पेट9,10के लिए ओटी की महत्वपूर्ण मात्रा के वितरण के साथ जुड़ा हुआ है, और डेटा शो है कि ओटीआर भारी ग्रहणी विल्ली में दूध पिलाती अवधि8के दौरान व्यक्त की जाती है ।

इन विट्रो प्रयोगों में एक आंत सेल लाइन का उपयोग सेलुलर स्तर है कि ऑक्सीटोसिन मार्ग11,12 सिग्नलिंग तनाव में महत्वपूर्ण अणुओं संग्राहक और प्रोटीन के अनुवाद में एक विनियामक भूमिका निभाता है पर प्रदर्शन किया है 12. इन अध्ययनों से सुझाव है कि दूध के अवयव, माता से exogenous ऑक्सीटोसिन सहित, नवजात शिशुओं में सामने आया प्रोटीन प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण है सेलुलर तनाव13कम ।

vivo में और ex vivo अध्ययनों से पता चला है कि कोलोस्ट्रम ओटी में सेलुलर तनाव की प्रतिक्रिया, सूजन, और नवजात चूहे आंत विल्ली में autophagy मार्कर ढा देती है । नवजात enterocytes उनके चमकदार पक्ष पर पर्याप्त सेलुलर तनाव पीड़ित जब आंत एक साथ कोलोस्ट्रम14में मां से microbiota को उजागर है,15 और ऐसे9 OT के रूप में हार्मोन सहित कई प्रोटीन, , 10 , 16.

मस्तिष्क पर ओटी के प्रभाव से17अध्ययन किए गए हैं । हालांकि, ओटी संकेतन तंत्र प्रारंभिक जन्मोत्तर अवधि के दौरान पेट में प्रदर्शित मस्तिष्क में अध्ययन नहीं किया गया है. इस पत्र में, नवजात चूहे brainstem और hypothalamus में असतत मस्तिष्क नाभिक अलग करने के लिए एक विधि ट्रो का उपयोग कर प्रोफ़ाइल अलग मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए प्रयोग किया जाता है । इस विधि के समग्र लक्ष्य को मस्तिष्क के क्षेत्रों में संकेत के रूप में जन्म के लिए संभव के रूप में बंद सेल की स्थिति पर कब्जा है, पहले और उसके बाद पहले दूध पिलाती, मस्तिष्क ऊतक में सबसे कम glial/ इस तकनीक के विकास के लिए तर्क है कि यह एक स्वचालित पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर पूर्व vivo अध्ययनों के लिए न्यूरॉन्स की एक अधिक समरूप संग्रह के साथ नवजात पिल्ले में प्रतिबंधित, सूक्ष्म मस्तिष्क क्षेत्रों के तेजी से अलगाव के लिए अनुमति देता है कार्यप्रणाली, अपेक्षाकृत छोटे विच्छेदित नमूनों पर अत्यधिक सुसंगत परिणाम प्रदान करना । पहले काम की कमी और अधिक सकल विच्छेदन (मस्तिष्क स्लाइसें या पूरे मस्तिष्क) और पुराने जानवरों18,19शामिल हैं । युवा पिल्ले के दिमाग अविश्वसनीय रूप से गतिशील हैं, जन्म के बाद glial भेदभाव की लहरों की विशेषता । आदेश में मस्तिष्क ' पिल्ले पहले खिला से प्रभावित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए, reproducible विच्छेदन के साथ प्रतिबंधित ंयूरॉन नाभिक अध्ययन आवश्यक है ।

दूध फ़ीड आमतौर पर अपने प्रतिरक्षा और स्वास्थ्य या जीन अभिव्यक्ति पर पोषण के प्रभाव के लिए विश्लेषण किया जाता है (उदाहरण के लिए, enterocytes20,21में), जबकि मस्तिष्क के विकास के दौरान मस्तिष्क के क्षेत्रों पर इसका प्रभाव शायद ही कभी अध्ययन किया जाता है । मस्तिष्क समारोह पर आंत में दूध पारगमन के प्रभाव आंत cholecystokinin रिसेप्टर्स वागल रिले करने के लिए संदर्भ में विश्लेषण किया गया था मस्तिष्क स्टेम नाभिक करने के लिए, लेकिन संकेतन रास्ते22intracellular करने के लिए नहीं. 23गर्भावस्था के दौरान माताओं के कुपोषण के लिए विकासशील neonate मस्तिष्क की भेद्यता पर एक विशाल साहित्य है, लेकिन तनाव और सूजन संकेतों को संबोधित नहीं कर रहे हैं । महत्वपूर्ण बात, वर्तमान विधि दिन में एक घटना का लाभ-शूंय चूहे नवजात शिशुओं कि आंत उत्तेजनाओं के वागल रिले से रक्त जनित कोलोस्ट्रम उत्तेजनाओं को अलग लेता है । यह तथाकथित तनाव hypo-जवाबदेही अवधि अपरिपक्व नाभिक tractus solitarius (एनटीएस) द्वारा विशेषता है-हाइपोथैलेमस सर्किट तुरंत जंम के बाद24,25 कि एनटीएस, paraventricular नाभिक (PVN) को प्रतिबंधित करता है, और supraoptic नाभिक (बेटा) रक्त जनित उत्तेजनाओं को संकेत ।

यह विधि कई संकेतन रास्ते के विश्लेषण के लिए उपयोगी है और अपेक्षाकृत ंयूरॉंस कोशिकाओं को प्रतिबंधित है, बशर्ते कि मस्तिष्क के ऊतकों जन्मोत्तर दिन में काटा जाता है-0 चूहों में, इसके अलावा कि माताओं को चुनौती दी गई है या नहीं उपचार के किसी भी प्रकार से गर्भावस्था के दौरान । कूड़े कोलोस्ट्रम फ़ीड के प्रभाव के लिए पूर्व बनाम सिग्नलिंग खिला का विश्लेषण किया जा सकता है । गरीब बनाम अमीर प्रोटीन उपज के साथ मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच संकेतों की तुलना करते हैं, इस विधि में सक्षम बनाता है केशिकाओं में पॉलीपेप्टाइड बैंड के कुल प्रोटीन की केशिका दृढ़ संकल्प प्रोटीन एंटीजन के प्रतिरक्षा-quantitation के समानांतर चलाते हैं । इस विधि मात्रात्मक तुलना सक्षम बनाता है, मनमाना इकाइयों का उपयोग, मानक मात्रात्मक घटता के बिना एक ही एंटीबॉडी द्वारा प्राप्त परिणामों की और केशिका प्रति कुल प्रोटीन के संदर्भ में. विभिंन एंटीबॉडी द्वारा प्राप्त परिणामों की तुलना केवल मात्रात्मक मानक curves का उपयोग संभव है ।

इस विधि पेट और मस्तिष्क के बीच होने वाली द्वि-दिशा संकेतन के आकलन के लिए अनुमति दी और है कि दोनों अंगों में समारोह प्रभाव कर सकते हैं26. ऑक्सीटोसिन और भोजन के सेवन, जो बड़े पैमाने पर हाल के वर्षों में अध्ययन किया गया है के बीच संघ27, वृद्धि हुई ऑक्सीटोसिन संकेतन और पोषक तत्वों की उपलब्धता के बीच एक कड़ी का समर्थन करता है । इन अध्ययनों से भी बातचीत की अवधारणा का समर्थन है कि ऊर्जा घाटे हाइपोथैलेमस ऑक्सीटोसिन संकेतन में कटौती के साथ युग्मित कर रहे हैं ।

मस्तिष्क गतिविधि पर ओटी के प्रभाव के पहले अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि प्रेरित आंत सूजन हाइपोथैलेमस PVN, प्रमस्तिष्कखंड में cFos प्रतिलेखन, और piriform प्रांतस्था जो28दुर्दम्य को vagotomy गया था । हालांकि, secretin के साथ ओटी के प्रणालीगत अर्क मस्तिष्क28आंत में उत्तेजक भड़काऊ प्रतिक्रिया के लिए प्रतिक्रिया cFos की कमी हुई । यह सुझाव दिया कि exogenous OT के प्रभाव वागल रिले के अलावा अन्य मार्गों द्वारा किया गया था, संभवतः रक्त जनित संकेतन अणुओं के माध्यम से क्षेत्र postrema6,29के माध्यम से किए गए.

इस अध्ययन में, सेलुलर तनाव संकेत मार्ग है कि पहले पेट में मनाया है मस्तिष्क में मूल्यांकन किया गया । परिकल्पना की थी कि दूध घटकों की रक्षा या माइक्रोबियल और अंय चयापचयों को आंत पारगम्यता पर सूजन के प्रभाव को स्थगित कर सकते हैं, और बदले में, मस्तिष्क समारोह पर प्रभाव । IkB में स्पष्ट विरोधी मतभेद बनाम बिप विल्ली में पाया संकेतन, से पहले और13कोलोस्ट्रम द्वारा भड़काने के बाद, सुझाव दिया है कि नवजात शिशुओं के दिमाग, अभी भी विकसित करने की प्रक्रिया में, इन कोलोस्ट्रम-प्रेरित आंत संकेतों को समझ सकता है ।

संकेत प्रोटीन मार्करों पिछले आंत प्रयोगों कि endoplasmic जालिका तनाव के साथ जुड़े रहे हैं में इस्तेमाल मापा गया. वे एर निगरानी बिप, अनुवाद दीक्षा फैक्टर eIF2a शामिल है (जो एक तनाव प्रतिक्रिया30घालमेल के रूप में कार्य करता है), eIF2a कळेनासे पी-PKR, और दो सूजन संकेत प्रोटीन (NF-kB और उसके अवरोध करनेवाला, IkB) ।

छह मस्तिष्क क्षेत्रों वयस्कों में उनकी क्षमता के आधार पर गुप्त या ओटी के जवाब के लिए चुना गया । एनटीएस, ऊपरी मज्जा में स्थित है, आंत इनपुट की पहली रिले है और आंत31 में वागल संवेदी न्यूरॉन्स से प्रत्यक्ष संकेत मिलता है और संभवतः रक्त जनित साइटोकिंस, विषाक्त पदार्थों, और आसन्न क्षेत्र के माध्यम से हार्मोन-postrema३२. PVN, supraoptic नाभिक (बेटा), striatum नाभिक (एसटीआर), सेरेब्रल प्रांतस्था (CX), और औसत दर्जे का ऑप्टिक नाभिक (MPO) एनटीएस के माध्यम से आंत से संकेतन प्राप्त करते हैं ।

परिणाम से पता चला है कि तत्काल जन्मोत्तर अवधि के दौरान सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया कोलोस्ट्रम भड़काने से पहले और तुरंत बाद पहले खिला PVN और बेटे की तुलना में एनटीएस में अलग है । CX, STR, और MPO में संकेत PVN और बेटे की है कि से भिंन है, के रूप में अच्छी तरह से । कक्ष तनाव और आंत में सूजन मिलाना पहले दिखाया ओटी के विशिष्ट सुरक्षात्मक कार्यों की संभावना मस्तिष्क के कुछ क्षेत्रों द्वारा महसूस कर रहे हैं । सामूहिक रूप से, डेटा संकेत मिलता है कि सेलुलर स्तर पर, जंम के बाद पहले घंटे के दौरान, मस्तिष्क चयापचय पोषक तत्वों की कमी के साथ जुड़े तनाव का जवाब । डेटा भी पता चलता है कि हद और कोलोस्ट्रम फ़ीड के मॉडुलन प्रभाव की दिशा क्षेत्र पर निर्भर कर रहे हैं और कुछ क्षेत्रों में, वे पेट में पहले से दिखाया ओटी प्रभाव दर्पण.

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Protocol

इस अध्ययन के संस्थागत पशु देखभाल और कोलंबिया विश्वविद्यालय और ंयूयॉर्क राज्य मनोरोग संस्थान में उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. टिशू वडा

  1. आदेश विक्रेता से समय पर गर्भवती चूहों ।
  2. सप्ताह में उनके आने के बाद उनके पेट बढ़ रही है और बाद में इस पिंजरे का निरीक्षण हर 2 जब तक वितरण शुरू होता है पर पिल्ले की तलाश के बाद से समय पर गर्भवती चूहों का पालन करें ।
  3. उनकी पूंछ से एक दस्ताने हाथ के साथ अपने पहले को subprime पिल्ले के लिए फ़ीड (कोई सफेद दूध पेट स्पष्ट है जब पेट को देखने) या प्रधान पिल्ले के लिए पहली फ़ीड के बाद (पर जो बिंदु एक सफेद पेट उनके पेट पर दिखाई जाएगी) के रूप में timeli ne (चित्रा एससी) ।
    नोट: पहला कोलोस्ट्रम फीड पिल्ला भड़काने के रूप में माना जाता है; इस प्रकार, एक पिल्ला पहली फ़ीड, जिसके बाद वे कोलोस्ट्रम-प्रधानमंत्री है जब तक unprimeed है ।
  4. जल्दी से तेज, स्वच्छ सर्जिकल कैंची का उपयोग कर unanesthetized पिल्ला decapitate ।
  5. खोपड़ी की midline और ऊपर की सतह को नाक से नीचे की त्वचा को काटने से मस्तिष्क को हटा दें । फिर, संदंश का उपयोग कर, धीरे हड्डी दूर कुतूहल मस्तिष्क का पर्दाफाश करने के लिए (1a आंकड़ा) और bregma स्थानीयकरण, यह एक कलम के साथ अंकन के रूप में हड्डी प्लेट हटा रहे हैं (आंकड़ा 1b).
  6. तेजी से कमरे के तापमान (चित्रा 1C) में राज्याभिषेक टुकड़ा करने की क्रिया के लिए कमरे के तापमान पर एक polymethyl methacrylate मस्तिष्क मोल्ड में पूरे मस्तिष्क जगह है ।
  7. बिना देरी, ५०० mm-मोटी स्लाइसें एक ताजा उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर । एक पेट्री डिश में caudal को rostral स्लाइसें रखना वर्गों के उंमुखीकरण (चित्रा 2) बनाए रखने के ।
  8. जल्दी से कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव जोड़ें (ACSF; १.० मिमी KH2पीओ4, 26 मिमी NaHCO3, ११८.६ मिमी NaCl, ३.० मिमी KCl, २०३.३ मिमी MgCl2-6H2हे) ग्लूकोज के बिना और ६० डिग्री सेल्सियस पर 28-30 मिनट के लिए स्लाइसें की मशीन, लगातार एक पर उभार कक्षीय शेखर को चयापचय और विभेदक बनाम कोलोस्ट्रम-प्राइमेड ऊतकों को चुनौती देते हैं ।
  9. मस्तिष्क नाभिक कि एक ब्रेन एटलस३३ और ऊतक अनुभाग पर शारीरिक स्थलों का उपयोग कर पंच करने के लिए आवश्यक हैं की पहचान करें । इस स्लाइस को एक पेट्री डिश में प् याज के नाभिक के साथ लगाएं और इसे विदारक माइक्रोस्कोप की ओर ले जाएं ।
  10. एक बार visualized, जल्दी से बाहर पंच 6 अलग नाभिक के 4 एक coring उपकरण का उपयोग, सबसे अच्छा सवाल में नाभिक और नमूनों के बीच लगातार पंच के आकार का चयन (चित्रा 2) ।
    नोट: शेष मस्तिष्क टुकड़ा अब एक छेद है जहां मस्तिष्क के ऊतकों को हटा दिया गया होगा । इस अध्ययन में, हम नीचे के निर्देशांक का उपयोग कर नाभिक निंनलिखित उत्पाद । सभी पूर्वकाल/पीछे (A/P) निर्देशांक Bregma से हैं (एनटीएस को छोड़कर, जो कैलमेस Scriptorius के संदर्भ में है). सभी पृष्ठीय/ventral (D/V) निर्देशांक प्रांतस्था की सतह से हैं (सिवाय एनटीएस, जो मज्जा की सतह से है). निंन निर्देशांक शामिल है a/p, औसत दर्जे का/पार्श्व (M/L), और D/V mm में: 1) एकाकी पथ नाभिक (एनटीएस, a/p, ०.४ के लिए ०.८; एल, ± ०.२; D/V, ०.३ (मज्जा की सतह से), 2) paraventricular नाभिक (PVN,-०.८; ± ०.२; 0), 3) ऊपर अर्थ का उपसर्ग (बेटा,-१.१; ± १.४; ४.३), 4) प्रांतस्था (CX, आंशिक प्रांतस्था क्षेत्र 1,-२.८; ± १.५; ०.६), 5) striatum नाभिक (एसटीआर,-०.०; ± १.६; १.८), और 6) औसत दर्जे का ऑप्टिक नाभिक (MPO,-०.६; ± ०.२; ४.२) ।
  11. तेजी से बर्फ की ०.०६ मिलीलीटर ठंड में छिद्रित नाभिक विसर्जित, प्रोटीन निष्कर्षण बफर अवरोधकों और फॉस्फेट अवरोधकों युक्त ६० मिनट के लिए (चरण २.३ देखें) ।

2. प्रोटीन निष्कर्षण

  1. प्रोटीन निष्कर्षण समाधान तैयार प्रोटीन lysis किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर दिन पर उंमीद पिल्ला वितरण से पहले ।
  2. गल (बर्फ पर) जमे हुए (-20 डिग्री सेल्सियस) lysis बफर किट के छेड़ने और फॉस्फेट अवरोधकों के जलीय समाधान और lysis बफर और DMSO समाधान के लिए जगह/phosphatases अवरोधकों बर्फ पर ।
  3. एक साफ, बर्फ ठंड 15 मिलीलीटर ट्यूब में १.८५ मिलीलीटर lysis बफर जोड़ें । फिर, DMSO-भंग अवरोधकों के अवरोधकों और ०.०५ मिलीलीटर के जलीय समाधान के ०.१ मिलीलीटर जोड़ें । अंत में, टोपी और संक्षेप में ट्यूब भंवर और इसे बनाए रखने में-20 ° c जब तक उपयोग ।
  4. लेबल 24 साफ microcentrifuge ट्यूबों (०.५ मिलीलीटर प्रत्येक) lysis प्रक्रिया के लिए । निर्दिष्ट कोलोस्ट्रम के लिए मस्तिष्क प्रति 12 ट्यूबों-unprimeed समूह (यू) [6 वाम (एल) और 6 अधिकार (नि.) ब्रेन नाभिक], और लेबल के अनुसार नाभिक संक्षिप्त, पक्ष, और स्थिति (जैसे, एनटीएस-L-u, एनटीएस-R-u, आदि) । लेबल कोलोस्ट्रम-प्रधान नमूनों के लिए 12 ट्यूबों के दूसरे समूह ।
  5. लेबल ट्यूबों के दो अतिरिक्त सेट के रूप में शेयर प्रोटीन निष्कर्षों के लिए २.४ कदम में किया (१.५ मिलीलीटर Eppendorf-शैली ट्यूबों का उपयोग) और नमूना तैयारी के पहले सेट के लिए (०.५ मिलीलीटर ट्यूबों का उपयोग) । दो अलग में इन ट्यूबों रखें, लेबल ठंड बक्से (प्रत्येक १०० ट्यूबों के लिए तैयार) । एक बॉक्स के लिए इस्तेमाल किया जाएगा और subprime नमूनों के लिए अंय ।
  6. इस दिन कि पिल्ले दिया जाता है पर बर्फ पर lysis समाधान गल, और ACSF में मस्तिष्क स्लाइसें मशीनिंग, aliquot ०.०६ मिलीलीटर lysis समाधान lysis प्रक्रिया ट्यूबों में (२.४ कदम से) और ६० मिनट के लिए बर्फ में नाभिक घूंसे और मशीन जोड़ें ।
  7. एक ठंडा मिनी में 30 मिनट के लिए मशीन लीजड ड नाभिक केंद्रापसारक-१४००० rpm (१०,००० x g) और ध्यान से supernatant के महाप्राण ०.०५५ मिलीलीटर में एक ठीक से सेट पिपेट के साथ केंद्रापसारक । supernatant में स्थानांतरण पूर्व ठंडा १.५ मिलीलीटर स्टॉक ट्यूबों (२.५ कदम से) और उंहें बर्फ पर डाल दिया । ठंड से पहले (पर-20 डिग्री सेल्सियस) प्रोटीन स्टॉक ट्यूबों, supernatant के ०.०१२ मिलीलीटर ०.५ मिलीलीटर पूर्व में पहले नमूना तैयारी के लिए ठंडा ट्यूबों स्थानांतरण (२.५ कदम से) और उंहें बर्फ पर छोड़ दें ।

3. में केशिका प्रोटीन माप के लिए नमूना तैयारी

  1. एक किट का प्रयोग करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार जुदाई के लिए एजेंट तैयार करते हैं । 12 नमूनों में से प्रत्येक के लिए मास्टर-मिक्स रिएजेंट के ०.००३ मिलीलीटर जोड़ें ०.५ मिलीलीटर लेबल ट्यूबों (चरण २.५ से) बर्फ पर कि प्रोटीन के अर्क के ०.०१२ मिलीलीटर होते हैं ।
  2. ९५ ° c करने के लिए हीटिंग ब्लॉक को चालू करें और एक ट्यूब में biotinylated आणविक-भार (मेगावाट) सीढ़ी के लिए ०.००४ मिलीलीटर पानी की ०.०१६ मिलीलीटर के साथ एक यू. ए । सीढ़ी और नमूनों को विकृत करने के लिए, सीढ़ी ट्यूब और ९५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गर्मी ब्लॉक में unprimeed प्रोटीन निष्कर्षों के 12 नमूने जगह है और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग तक की दुकान ।
  3. दोहराएं कदम २.० से ३.२, प्रोटीन निष्कर्षण से नमूना तैयारी के लिए, कोलोस्ट्रम-प्रधानमंत्री चूहों से छिद्रित नाभिक के लिए ।

४. ट्रो तयारी

  1. बायोटिन लेबलिंग रिएजेंट (डीप फ्रीजर में संग्रहित-८० ओसी) बेंच पर और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर प्रोटीन जांच किट तैयार करें ।
  2. luminol के ०.१५ मिलीलीटर के साथ ०.१५ मिलीलीटर मिक्स और 25 कुओं में लोड ०.०१ मिलीलीटर (पंक्ति ई, वेल्स 1-25) स्वचालित पश्चिमी मशीन के लिए थाली की । Streptavidin-एचआरपी के किट से वेल्स D1 D25 में लोड ०.००८ मिलीलीटर
  3. C25 और B1 को वेल्स C1 में एंटीबॉडी मंदक सॉल्यूशन का ०.०१ mL लोड करें ।
  4. 24 प्रोटीन नमूनों और सीढ़ी ट्यूबों संक्षेप में (2-3 सेकंड) एक minicentrifuge में पूल नीचे ट्यूब टोपियां से पानी काफूर ।
  5. कुओं A2 में 12 unprimeed नमूनों की ०.००३ मिलीलीटर लोड, 12 कोलोस्ट्रम के ०.००३ मिलीलीटर कुओं में प्रधान नमूनों A14 A25 करने के लिए, और ०.००५ मिलीलीटर biotinylated सीढ़ी की अच्छी तरह से A1 में ।
  6. पंक्ति f खाली छोड़ें और प्रत्येक 3 पंक्तियों में से प्रत्येक में 5 डिब्बों में से प्रत्येक में धोने बफर की ०.४५ मिलीलीटर लोड करें f. शेष प्रक्रियाओं के दौरान वाष्पीकरण से बचने के लिए इसकी प्लास्टिक के ढक्कन से प्लेट ढक लें ।
  7. संक्षेप में गल बायोटिन लेबलिंग रिएजेंट भंवर और अपने निर्दिष्ट ट्यूब के लिए एजेंट के ०.१५ मिलीलीटर जोड़ें; फिर इसे जोड़ने के लिए कुल प्रोटीन पुनर्गठन एजेंट के ०.१५ मिलीलीटर और उंहें सजातीयता मिश्रण ।
  8. प्लेट से कवर निकालें और 1 और 2 B25 के लिए वेल्स B2 में एजेंटों की ०.०१ मिलीलीटर लोड । प्लेट को कवर और यह 10 मिनट के लिए १,००० x g पर विभिंन समाधानों से किसी भी हवा में बुलबुले हटाने के लिए केंद्रापसारक । संतुलन के लिए केंद्रापसारक में एक खाली थाली का प्रयोग करें ।

5. ट्रो

  1. जबकि थाली कताई है, स्वचालित पश्चिमी मशीन में एक रन फ़ाइल खोलने से ड्रॉपडाउन पृष्ठ में "फ़ाइल" से संकेत द्वारा संलग्न कंप्यूटर को एक कुल प्रोटीन परख चलाने के लिए और संबंधित जगह क्लिक ।
  2. कंप्यूटर में अच्छी तरह से नमूने व्याख्या । फिर, प्लेट को हटाने के केंद्रापसारक से कवर हटाने और ध्यान से अलग समाधान डिब्बों से एल्यूमीनियम कवर छील ।
  3. स्वचालित पश्चिमी साधन में थाली प्लेस, केशिका कारतूस बॉक्स से कवर छील, अपनी निर्दिष्ट जगह में कारतूस डालने के लिए, और दरवाजा बंद ।
  4. क्लिक करें "भागो" बटन, और जब परख के प्रकार के साथ कहा ("कुल प्रोटीन"), नमूनों के नाम में टाइप (उदाहरण के लिए, "2-13 और कोलोस्ट्रम-primeed 14-25") । क्लिक करें "ठीक", और जब सक्रिय चलाएँ दिनांक और चलाएँ फ़ाइल की ID संख्या द्वारा संकेत दिया, जब चलाएँ समाप्त होता है उस समय का नोट बनाएँ ।
  5. चलाने के अंत में (शुरू करने के बाद १७० मिनट), साधन दरवाजा खोलने, केशिका कारतूस को हटाने, और sharps निपटान में इसे त्यागें । जैविक मामले निपटान में थाली त्यागें ।
  6. चलाएं फ़ाइल के विश्लेषण पृष्ठ में पृथक्करण वक्र चिह्न क्लिक करें, और जांचें कि सभी नमूने ठीक से चल रहे है और सभी केशिकाओं में एकाधिक प्रोटीन घटता दिखा रहे हैं ।

6. संकेतन प्रोटीन का विश्लेषण

  1. एक लेबल १.५ एमएल ट्यूब में, खरगोश विरोधी phospho के ०.००३ मिलीलीटर जोड़ें-eIF2a (पी-eIF2a) एंटीबॉडी और यह ०.३ मिलीलीटर में निलंबित (1:100 कमजोर पड़ने) एंटीबॉडी मंदक में उपयुक्त जांच किट से । फिर, इसे बर्फ पर रखें ।
  2. एक luminol ट्यूब लेबल और इस का पता लगाने मॉड्यूल किट से luminol और पेरोक्साइड के ०.१५ मिलीलीटर के ०.१५ मिलीलीटर जोड़ें और एक ताजा, स्वचालित पश्चिमी प्लेट के कुओं में E1 के लिए E25 ०.०१ मिलीलीटर बांटना ।
  3. D25 के लिए वेल्स D2 में माध्यमिक विरोधी खरगोश एंटीबॉडी के ०.०१ मिलीलीटर वितरण, और अच्छी तरह से D1 करने के लिए किट से streptavidin-एचआरपी के ०.०१ मिलीलीटर जोड़ें ।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी (चरण ६.१ से) वेल्स C2 से C25 में ०.०१ मिलीलीटर का वितरण, और वेल्स C1 और B1 के लिए एंटीबॉडी मंदक 2 समाधान के ०.०१ मिलीलीटर जोड़ने के लिए B25.
  5. पंक्ति f कुओं को खाली छोड़ दो और धो बफर के ०.४५ मिलीलीटर एफ पंक्ति के नीचे 3 पंक्तियों के 5 डिब्बों में भरें ।
  6. संक्षेप में 3 एस के लिए प्रशीतित नमूनों स्पिन, और पंक्ति के लिए प्रत्येक नमूने के ०.००३ मिलीलीटर एक ही क्रम में जोड़ने के लिए वे कुल प्रोटीन परख के लिए जोड़ा गया, A2 से A25 से शुरू । अच्छी तरह से A1 के लिए biotinylated मेगावाट सीढ़ी के ०.००५ मिलीलीटर जोड़ें और थाली को कवर किया ।
  7. के रूप में ४.८ कदम में किया प्लेट केंद्रापसारक । जबकि थाली कताई, खुला है (स्वचालित पश्चिमी में संबद्ध सॉफ्टवेयर और कंप्यूटर) एक नया रन फ़ाइल और ड्रॉपडाउन पृष्ठ में से संकेत मिलता है "फ़ाइल" से संबंधित स्थान पर क्लिक करके एक आणविक आकार परख चलाने के लिए ।
  8. परख पृष्ठ में, प्रत्येक केशिका में नमूना नाम टाइप करें, तो आवंटित स्थान और उसके नीचे माध्यमिक विरोधी खरगोश एंटीबॉडी में प्राथमिक एंटीबॉडी का नाम लिखें ।
  9. केंद्रापसारक के अंत में, दोहराएं चरण 5.3 – 5.5, को छोड़कर चलाने के लिए फ़ाइल इस समय "पी-eIF2a पर प्रधानमंत्री 2-13 और कोलोस्ट्रम-प्रधानमंत्री 14-25" होना चाहिए नाम दिया ।
  10. ट्रो जुदाई के बाद, 40 – 43 केडीए के आकार में एंटीजन की प्रतिरक्षा-जेट चोटियों के लिए चलाएँ फ़ाइल की जाँच करें । जहां मेगावाट की चोटियों के इस आकार को याद कर रहे हैं, वक्र नीचे राइट-क्लिक करें और ड्रॉपडाउन सूची के अंदर संकेत मिलता है, जो यह सुनिश्चित करता है कि आकार और वक्र नीचे मनमाना मात्रा दर्ज की गई हैं ।

7. परिणाम प्रसंस्करण

  1. कुल प्रोटीन के लिए एक स्प्रेडशीट फ़ाइल खोलें स्वचालित वेस्टर्न भागो फ़ाइल में चलाने के लिए और एक आईडी नंबर प्रदान करते हैं ।
  2. वक्र मोड पर विश्लेषण पृष्ठ पर कुल प्रोटीन परख की भागो फ़ाइल खोलें और व्यक्तिगत केशिकाओं में सभी चोटियों निशान । फिर, कॉपी और स्प्रेडशीट में उन्हें पेस्ट और सभी चोटियों पूरे केशिका में दर्ज की वक्र के तहत क्षेत्रों योग.
  3. एक अलग कॉलम में, केशिका संख्या, संबंधित मस्तिष्क नाभिक के नाम, और रन फ़ाइलों के आईडी नंबर के साथ प्रत्येक स्तंभ के लिए प्रोटीन की कुल राशि की व्यवस्था ।
  4. p-eIF2a antigen के लिए कोई स्प्रेडशीट खोलें, और किसी एकल स्तंभ में, अपने संबंधित केशिका संख्या, मस्तिष्क नाभिक का नाम, और रन फ़ाइल की ID संख्या के साथ प्रत्येक केशिका साथ-साथ साइड से वक्र के अंतर्गत क्षेत्र रिकॉर्ड करें ।
  5. एक तिहाई स्प्रेडशीट में कुल प्रोटीन कॉलम (पी-eIF2a वक्र मात्रा के समानांतर) की प्रतिलिपि बनाएं और p-eIF2a की गणना करें: एक तिहाई कॉलम में कुल प्रोटीन अनुपात ।
  6. प्रत्येक मस्तिष्क नाभिक के लिए कदम 4 से 6 से परिणाम एकत्र, उंहें नाभिक के समूहों में व्यवस्था है, और एक बार ग्राफ उत्पंन करते हैं ।

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Representative Results

कुल प्रोटीन के सापेक्ष immunoreactivity के प्रतिनिधि बैंड बताते हैं कि बहुत कम काटा प्रोटीन के साथ मस्तिष्क नाभिक हैं । यह स्वचालित पश्चिमी दाग तकनीक है, जो विहित पश्चिमी दाग की तुलना में अति संवेदनशील है के उपयोग की आवश्यकता है । यह दृष्टिकोण पश्चिमी दाग में प्रति-लेन की तुलना में केशिका प्रति fortyfold कम प्रोटीन के साथ चलाया जा सकता है ।

मस्तिष्क नाभिक में बिप स्तरों पर कोलोस्ट्रम भड़काने के विभेदक प्रभाव

चूहे दिमाग के राज्याभिषेक वर्गों पहले कोलोस्ट्रम खिलाने () और पहले खिला (प्रधान) के बाद पहले काटा गया । नमूनों केशिका ट्रो (वेस पर) द्वारा fractionated थे, और प्रोटीन में केशिका कुल प्रोटीन धुंधला (देखें प्रोटोकॉल) के लिए किट का उपयोग कर quantified थे । अतिरिक्त प्रतिरक्षा केशिका भिन्नीकरण पर स्वचालित पश्चिमी संबंधित प्रोटीन एंटीजन की पहचान प्रदान की । चित्र 3ए में, प्रतिनिधि बिप प्रोटीन अभिव्यक्ति ऊपरी पैनल में दिखाया गया है, इसी कुल प्रोटीन के साथ नीचे दिखाया गया है । बिप एक एर निगरानी प्रोटीन है । चित्र बीमें, quantitated immunoreactivities संबंधित कुल प्रोटीन के सापेक्ष बार रेखांकन द्वारा प्रस्तुत कर रहे हैं ।

unprimeed ऊतक नमूनों के भीतर, एनटीएस में स्तरों सभी अंय क्षेत्रों की तुलना में काफी अधिक थे (पी < ०.०५, n = 4 नाभिक) । कोलोस्ट्रम के साथ आंत ऊतक के भड़काना एनटीएस में एक विपरीत प्रभाव था, अन्य क्षेत्रों में वृद्धि हुई बिप के साथ तुलना में, unprimeed ऊतक के सापेक्ष (चित्र बी). भड़काने एनटीएस में कमी बिप (चित्र बी) और PVN और SOPT पर कोई प्रभाव नहीं था । हालांकि, भड़काना CX, STR में बिप वृद्धि हुई है, और MPO के सापेक्ष unprimeed ऊतक । इस डेटा का तात्पर्य यह है कि विभिंन परीक्षण मस्तिष्क नाभिक में बिप के स्तर पर अलग तरह से पेट भड़काने के लिए और कहा कि वहां अभी तक किसी भी पार नहीं प्रदर्शन विभिंन नाभिक परीक्षण के बीच बात करते हैं ।

मस्तिष्क नाभिक में ElF2a और पी-ElF2a स्तरों पर कोलोस्ट्रम भड़काने के विभेदक प्रभाव

मस्तिष्क ऊतक के नमूने तैयार किए गए थे, विश्लेषण, और quantified के रूप में चित्र 3 ए में दिखाया गया है । बिप के स्तर (चित्रा बी) के साथ के रूप में, एनटीएस में elF2a और पी-elF2a का स्तर अन्य नाभिक (चित्रा 4B और 4c) के सापेक्ष subprime हालत में बुलंद किया गया. के रूप में बिप के स्तर के साथ प्रदर्शन किया, कोलोस्ट्रम के साथ आंत ऊतक के भड़काने के लिए एनटीएस में प्रतिक्रिया है कि अंय नाभिक में विपरीत था । एनटीएस में elF2a और पी-elF2a दोनों के स्तर को कम किया गया । अंय सभी परीक्षण नाभिक में, भड़काने elF2a और पी में वृद्धि स्तर-elF2a के सापेक्ष प्रधान ऊतक (चित्रा 4B और 4c) ।

फास्फारिलीकरण के बाद एनटीएस और PVN में कळेनासे GCN2 द्वारा elF2a का कोलोस्ट्रम भड़काने के बाद

मस्तिष्क ऊतक नमूने तैयार किया गया, विश्लेषण, और quantified के रूप में चित्र 3में दिखाया गया है । भड़काना मृतक पी-PVN में PKR (χ2 पी = ०.०२५), अंय सभी क्षेत्रों में जहां यह बढ़ गया था के विपरीत । p-elF2a निष्कर्षों (चित्र 4c) के विपरीत, p-PKR के स्तर एनटीएस (चित्र 5) में प्राइम नमूनों के सापेक्ष प्राइम नमूनों में कम थे । elF2a के फास्फारिलीकरण आमतौर पर वायरस३४ के जवाब में अपने कळेनासे PKR द्वारा catalyzed है और पेट में OT द्वारा, के रूप में पहले11का प्रदर्शन किया । हालांकि, तथ्य यह है कि पी-PKR स्तर बहुत subprime बनाम प्राइमेड एनटीएस में कम थे (अंय नाभिक, आंकड़ा 5के सापेक्ष) दृढ़ता से पता चलता है कि एक और कळेनासे phosphorylating elF2a (आंकड़ा 4c) में शामिल किया जाना चाहिए । तदनुसार, एनटीएस और PVN में GCN2 स्तरों का परीक्षण किया गया क्योंकि यह भी elF2a३५के एक ज्ञात कळेनासे है । पी-GCN2 (सक्रिय रूप) के स्तर एनटीएस और PVN (चित्रा 5B), और GCN2 (निष्क्रिय रूप) में प्रधान नमूनों की तुलना में subprime नमूनों में अधिक थे, पी-GCN2 की तुलना में, व्युत्क्रम PVN (चित्रा 5C) में व्यक्त किया गया था । pGCN2 में एनटीएस (चित्रा 5C) को pPKR (चित्रा धारा 5) के दोनों और subprime एनटीएस में व्युत्क्रम व्यक्त किया गया । प्रधान ऊतक में, पी-eIF2a अन्य सभी मस्तिष्क क्षेत्रों [PVN (p < ०.०१), SON (p < ०.०१), CX (p < ०.०१), और MPO (p = ०.०२)] की तुलना में एनटीएस में काफी कम था । यह इंगित करता है कि pGCN2, बजाय pPKR, एनटीएस में eIF2 अवरोध के लिए जिंमेदार था ।

कोलोस्ट्रम भड़काना रोकता NF-kB में CX, STR, और MPO

चित्रा 6A से पता चलता है कि IkB के स्तर पर बेटे को subprime नमूनों बनाम में काफी अधिक थे । बेटा, CX, STR, और MPO में IkB स्तर एक ही दिशा में उच्च trended । चित्रा 6C, NF CX, STR, और MPO में केबी के स्तर में काफी अधिक थे प्राइमेड बनाम में प्रधान ऊतक । हालांकि, NF-केबी स्तर काफी प्राइम एनटीएस ऊतक है, जो पता चलता है कि कोलोस्ट्रम इस मस्तिष्क क्षेत्र पर एक अलग विरोधी भड़काऊ प्रभाव था में कम थे । Cytosolic NF-kB उच्च था (रखी) unprimeed एनटीएस नमूनों में, जबकि इसके अवरोध करनेवाला IkB कम था और प्रधान नमूनों में अपरिवर्तित । यह पता चलता है कि एक अलग विरोधी भड़काऊ तंत्र एनटीएस में NF-kB विनियमन है । इस पोषक तत्व कमी तनाव प्रभाव वर्तमान निष्कर्षों के अनुरूप है कि तनाव मार्करों बिप और पी eIF2a दोनों कोलोस्ट्रम भड़काना की उपस्थिति द्वारा विनियमित रहे है (आंकड़े 3 और 4, क्रमशः), भी पिछले बिप और पी में दिखाया elF2a 10निष्कर्षों । IkB और NF की अलग प्रतिक्रिया के लिए कारण-एनटीएस में केबी CX, STR, और MPO के साथ तुलना में अभी तक पूरी तरह से समझ नहीं है । हालांकि, यह अवलोकन के अनुरूप है कि एनटीएस, जो मस्तिष्क को पेट से संकेत रिले, विशिष्ट और विपरीत बनाम अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों परिधीय सूजन३६की तुलना में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है. CX में IkB के स्तर, STR, और MPO कम थे (चित्रा 6A), NF के उच्च स्तर की तुलना में एक ही क्षेत्रों में केबी (चित्रा 6C) । हालांकि यह खोज जाहिरा तौर पर आधार है कि IkB बाध्यकारी है और cytosol, डेटा जो जोड़ती है और CX, STR में सभी प्रधान नमूनों की तुलना में NFkB को बनाए रखने के विरोधाभासों, और MPO प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग करके पता चलता है कि NF-kB अत्यधिक IkB के साथ संबद्ध (p < ०.०००१, n = 24)

Figure 1
चित्रा 1: कीट नवजात चूहे मस्तिष्क । (क) bregma को rostral निकाले गए हड्डियों के साथ विच्छेदित मस्तिष्क दिखाया जाता है. (ख) मस्तिष्क को bregma पर एक रेखा खींचे जाने के बाद दिखाया गया है, जिसके बाद शेष अस्थि प्लेटें हटाई गईं. (ग) मस्तिष्क एक polymethyl methacrylate मस्तिष्क मोल्ड में दिखाया गया है बस से पहले एक उस्तरा ब्लेड के साथ कटा हुआ जा रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: मस्तिष्क स्लाइस घूंसे (लाल हलकों) के साथ rostral से caudal के लिए व्यवस्था की । संक्षिप्त नाम: CX: प्रांतस्था, पार्श्विका पालि; MPO: औसत दर्जे का ऑप्टिक क्षेत्र; एनटीएस: नाभिक tractus solitaries; PVN: paraventricular नाभिक; बेटा: supraoptic नाभिक; और STR: striatum । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: बिप/एनटीएस में GRP78 प्रतिक्रिया अंय नाभिक के लिए औंधा है । (एक) प्रतिनिधि बिप नीचे पैनल में प्रस्तुत कुल प्रोटीन के सापेक्ष ऊपरी पैनल में प्रोटीन अभिव्यक्ति । ध्यान दें कि विभिंन केशिकाओं में कुल प्रोटीन घनत्व विषम हैं, और इन के लिए उपयोग किया जाता है पैनल बी में प्रोटीन प्रति संबंधित बिप अभिव्यक्ति बराबर (ख) दिखाया गया है मतलब बिप की ब्रेन नाभिक में कुल प्रोटीन के सापेक्ष ( नीला) बनाम कोलोस्ट्रम-प्रधान नमूने (ब्राउन) । संबंधित रंगों के तारांकन अंय नाभिक में एनटीएस बनाम बिप में बिप के बीच महत्वपूर्ण अंतर (p < ०.०५, n = 4 नाभिक) को निर्दिष्ट करते हैं । एनटीएस में प्राइमेड नमूनों में बिप अभिव्यक्ति काफी STR में उन लोगों के लिए औंधा है (χ2 p = ०.०२८, n = 4) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: सक्रिय और निष्क्रिय eIF2a (पी-eIF2a) कोलोस्ट्रम भड़काने बनाम एनटीएस में subprime नमूनों की प्रतिक्रिया है कि अंय नाभिक के लिए औंधा । (क) प्रतिनिधि eIF2a और पी-eIF2a प्रोटीन के भाव ऊपरी पैनलों में दर्शाए जाते हैं. कुल प्रोटीन लेन निचले पैनल पर प्रस्तुत कर रहे हैं । (ख) दर्शाए गए 4 नमूनों में से कुल प्रोटीन के सापेक्ष व्यक्त किए गए eIF2a का अर्थ है (निचले पैनल ए से), नाभिक (नीले) बनाम कोलोस्ट्रम-प्रधान नमूनों (ब्राउन), और (ग) eIF2a के निष्क्रिय रूप (पी-eIF2a) । संबंधित रंगों के तारांकन अंय नाभिक में एनटीएस बनाम संबंधित स्तरों में दोनों eIF2a प्रपत्रों के बीच महत्वपूर्ण अंतर (p < ०.०५, n = 4 नाभिक) को निर्दिष्ट करते हैं । एनटीएस में प्रधानमन्त्री के नमूनों में सक्रिय eIF2a अभिव्यक्ति काफी CX, STR, और MPO (χ2 पी < ०.०५ बनाम सभी तीन नाभिक, n = 4) में उन लोगों के लिए औंधा हैं । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि दर्शाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: पी-eIF2 स्तर के साथ समझौते में एनटीएस eIF2a कळेनासे पी-GCN2 व्यक्त करता है और पी-PKR स्तर के लिए व्युत्क्रम । (क) पी-PKR के स्तर (आपन dsRNA कळेनासे of eIF2a) में व्यक्त की गई है, जो प्रधानमन्त्री बनाम कोलोस्ट्रम-प्रधान एनटीएस व्युत्क्रम 1) पी के स्तर PVN में PKR (χ2 पी = ०.०२५) और 2) इसकी उंमीद लक्षित सब्सट्रेट eIF2a इसके फास्फारिलीकरण के बाद ( p-eIF2a, चित्र 2c). ध्यान दें कि पी के पैटर्न बेटा, CX, STR में PKR, और MPO बनाम कोलोस्ट्रम-प्रधानमंत्री के नमूनों के संबंधित पैटर्न पी-eIF2a से चित्र 2cमें फिट बैठता है । (ख) सक्रिय eIF2a कळेनासे (पी-GCN2) में प्राइमेड बनाम प्राइम एनटीएस नमूनों में चित्रा 2c से पी-eIF2a अभिव्यक्ति की एक समान पैटर्न और चित्रा 2 ए से pPRK अभिव्यक्ति की एक व्युत्क्रम पैटर्न इस प्रकार है (χ२ पी = ०.०२८). C = मतलब निष्क्रिय GCN2 का स्तर । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि दर्शाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: Cytoplasmic अभिव्यक्ति NF-kB और IkB से मस्तिष्क नाभिक में unprimeed और कोलोस्ट्रम-प्रधान आंत के नमूने. (A) संकेत मस्तिष्क नाभिक पर कुल प्रोटीन (पैनल सी से) के सापेक्ष IkB की cytoplasmic अभिव्यक्ति का मतलब है । (ख) IkB प्रोटीन के प्रतिनिधि cytoplasmic बैंड ऊपरी पैनल और निचले पैनल में संबंधित गलियों में कुल प्रोटीन घनत्व में प्रस्तुत कर रहे हैं । (ग) NF का मतलब cytoplasmic अभिव्यक्ति-केबी कुल प्रोटीन के सापेक्ष (पैनल डी से) संकेत मस्तिष्क नाभिक में । (घ) NF के प्रतिनिधि cytoplasmic बैंड-केबी बैंड ऊपरी पैनल और निचले पैनल में संबंधित गलियों में कुल cytoplasmic प्रोटीन घनत्व में प्रस्तुत कर रहे हैं । रंगीन तारांकन संकेत नमूनों के बीच महत्वपूर्ण अंतर निर्दिष्ट करते है (p < ०.०५, n = 4) । ध्यान दें कि cytoplasmic nf-kb स्तर कोलोस्ट्रम में उच्च रहे है प्राइमेड CX, STR, और MPO से हाइपोथैलेमस नाभिक एनटीएस, PVN, और के स्तर के साथ असहमति में बेटा nf-kb अवरोध करनेवाला (IkB) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: योजनाबद्ध कोलोस्ट्रम-प्रधान आंत और मस्तिष्क क्षेत्रों में संकेतन ओटी की तुलना. (क) enterocytes में कोलोस्ट्रम OT ओटीआर के साथ सीधा संपर्क के द्वारा अपनी रिसेप्टर सक्रिय हो जाता है, वृद्धि हुई IkB बहाव संकेतन के माध्यम से सूजन को कम करने. प्रोटीन अनुवाद बढ़ती पी-PKR, जो फास्फारिलीकरण के माध्यम से elF2a गतिविधि घट जाती है द्वारा बाधित है । Homeostasis वृद्धि हुई बिप जीन अभिव्यक्ति13,३७के माध्यम से बहाल है । (ख) न्यूरॉन या संचार ओटी सीएस, STR में अपनी रिसेप्टर सक्रिय करता है, और मस्तिष्क के MPO क्षेत्रों, downregulating सूजन और आंत के रूप में एक ही अणुओं के माध्यम से प्रोटीन अनुवाद (पैनल एक देखें). (ग) मस्तिष्क के एनटीएस क्षेत्र में कोलोस्ट्रम भड़काने के प्रभाव अलग और पैनल ए और बी GCN2, जो एमिनो एसिड की आपूर्ति के प्रति संवेदनशील है में उन लोगों से विपरीत हैं, दोनों eIF2a और प्रोटीन अनुवाद बढ़ जाती है । एक ही समय में, IkB के निंन स्तर NF-केबी नाभिक में प्रवेश और सूजन पैदा करने के लिए अनुमति देते हैं । ध्यान दें कि बिप पेट में और मस्तिष्क में एनटीएस में homeostasis बहाल करने के लिए इसी तरह कार्य करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Figure
अनुपूरक चित्रा 1: योजनाबद्ध प्रोटोकॉल समयरेखा दिखा रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

नवजात चूहे के मस्तिष्क में असतत, ओटीआर युक्त मस्तिष्क नाभिक के microdissection के लिए एक तकनीक इस पत्र में प्रस्तुत की गई है. यह अच्छी तरह से पहचाना जाता है कि न्यूरॉन्स अत्यधिक विशिष्ट हैं, यहां तक कि मस्तिष्क में अच्छी तरह से विशेषता नाभिक के भीतर. इस उच्च reproducible दृष्टिकोण विशिष्ट ओटीआर-रिच नाभिक को अलग करने के लिए मजबूत परिकल्पना परीक्षण सक्षम बनाता है । स्वचालित वेस्टर्न सोख्ता का उपयोग करते हुए, स्थिरता और परिणामों के reproducibility आगे सुधार किया गया । इस तकनीक की एक सीमा मामूली मस्तिष्क पंच परिवर्तनशीलता रहता है, जबकि; इस तकनीक एकल सेल, पूरे मस्तिष्क या मस्तिष्क टुकड़ा दृष्टिकोण पर एक अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है । एकल सेल दृष्टिकोण बहुत सीमित तस्वीर शॉट्स प्रदान करने से जटिल हैं । अगर प्रभाव एक मस्तिष्क क्षेत्र या न्यूरॉन उपप्रकार के लिए प्रतिबंधित है पूरे मस्तिष्क का उपयोग करना, किसी भी निष्कर्ष पतला हो सकता है. microdissection बिना मस्तिष्क स्लाइस दृष्टिकोण केवल माइक्रोन के भीतर परिणाम में एक टुकड़ा है, जो विशेष रूप से समस्याग्रस्त है इस अध्ययन में hypothalamus के लिए, अलग नाभिक के तंग clustering के कारण में गहरा परिवर्तनशीलता लागू कर सकते हैं । एक मानकीकृत पंच का उपयोग और एक खुर्दबीन की सहायता, प्रोटीन माप में परिवर्तनशीलता कम हो गया था.

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण हैं । ये पहली फ़ीड के संबंध में ऊतक फसल के समय का पालन शामिल है, प्रोटीन निष्कर्षण बफर की एक ंयूनतम मात्रा का उपयोग करना, ACSF में मस्तिष्क स्लाइस की मशीन इतना है कि आणविक अवरोधकों या उत्तेजक इस्तेमाल किया जा सकता है, और एक संवेदनशील का उपयोग प्रतिरक्षा-electrophoretic डिवाइस । संभव संशोधनों में शामिल है और मशीन की अवधि के लिए रिएजेंट की पसंद और असामयिक भुखमरी के समय का विस्तार करने के लिए बराबर समय में दिमाग की तुलना करें । महत्वपूर्ण सीमाएं कुछ गैर-ंयूरॉन कोशिकाओं की उपस्थिति (यहां तक कि यह बहुत जल्दी नवजात अवधि के दौरान) और नमूनों की एक प्रतिबंधित संख्या है कि एक दिन में नवजात शिशुओं के एक कूड़े से तैयार किया जा सकता शामिल हैं । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण पर पूरी तरह से निर्भर है जब पिल्ले पैदा कर रहे हैं । मौजूदा तरीकों के संबंध में, इस उंर में मस्तिष्क में जीन अभिव्यक्ति आम तौर पर और अधिक सुविधाजनक transcriptional स्तर पर मूल्यांकन किया गया है । हालांकि, सेल संकेतन विश्लेषण के लिए, कोर सुविधा उपकरण द्वारा निष्पादित proteomic दृष्टिकोण डेस्कटॉप स्वचालित उपकरणों की तुलना में अधिक महंगा है । पारंपरिक पश्चिमी दाग विधि बहुत अधिक प्रोटीन की आवश्यकता है, को पूरा करने के लिए कई दिन लगते हैं, और तकनीकी जनशक्ति द्वारा कई हेरफेर कदम शामिल है । इस स्वचालित दृष्टिकोण की आवश्यकता है ०.८ µ ग्राम केशिका प्रति प्रोटीन, एक बार साधन में भरी हुई सभी कदम मानव हाथ हस्तक्षेप के बिना प्रदर्शन कर रहे हैं और रन पूरा करने के लिए 2 एच और ५० मिनट लेता है. इस तकनीक को चूहों और आनुवंशिक रूप से हेरफेर माउस मॉडल की व्यापक रेंज में तत्काल जन्मोत्तर मस्तिष्क के विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस तकनीक का उपयोग, सेलुलर स्तर पर OT के प्रभाव, विशेष रूप से जंम और भोजन के बीच बहुत महत्वपूर्ण अवधि में, जब ओटीआर अधिक से अधिक उपकला8में व्यक्त की है की जांच की गई । कक्ष आंत कोशिकाओं में अणुओं संकेत पर ओटी के मॉडुलन प्रभाव, दोनों एक सेल लाइन३७ में और vivo13में, पहले प्रदर्शन किया गया. वर्तमान अध्ययन में, आंत कोशिकाओं में मनाया प्रभाव मस्तिष्क ओटीआर में अमीर क्षेत्रों में मूल्यांकन किया गया । बिप/GRP78 और पी-eIF2a की अभिव्यक्ति (तनाव के लिए एक उंमीद की प्रतिक्रिया के साथ संगत) और प्राइम में downregulated एनटीएस ऊतक (तनाव के लिए एक तनु की प्रतिक्रिया के साथ संगत) में विनियमित किया गया था, जबकि NF-kB उच्च और स्थिर दोनों स्थितियों में था ३८. बिप और NF के भाव-केबी अंय परीक्षण क्षेत्रों में एक ही थे दोनों और प्रधानमंत्री की स्थिति में । eIf2a पुत्र, pPKR, एसटीआर, और CX में dsRNA आश्रित कळेनासे (MPO) द्वारा phosphorylated गया । हालांकि, एनटीएस में, और PVN में एक हद तक कम करने के लिए, eIf2a एक और कळेनासे, जनरल नियंत्रण nonderepressible-2 कळेनासे (GCN2) द्वारा phosphorylated था । एक योजनाबद्ध मस्तिष्क और कोलोस्ट्रम जोखिम द्वारा बटोरा आंत में संकेत में कल्पना मतभेद चित्रण चित्र 7में प्रस्तुत किया है ।

इस microdissection तकनीक यह नवजात मस्तिष्क में असतत ओटीआर-अमीर नाभिक में तनाव से संबंधित संकेतन पर पहली कोलोस्ट्रम फ़ीड के प्रभाव से संबंधित परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए संभव बनाता है. इस डेटा का सुझाव है कि पहले नई जंमे आंत enterocytes में मनाया तंत्र मॉडुलन तनाव विशिष्ट मस्तिष्क ओटीआर में अमीर क्षेत्रों में प्रतिबिंबित कर रहे हैं, के रूप में NFKB की वृद्धि की cytosolic प्रतिधारण द्वारा दिखाया गया (PVN, बेटा CX, STR, और MPO) । परिणाम भी संकेत मिलता है कि एनटीएस और PVN अंय क्षेत्रों है कि पोषक तत्वों की कमी के प्रभाव को दुर्दम्य हो सकता है से एक अलग फास्फारिलीकरण तंत्र का उपयोग । सामूहिक रूप से, डेटा संकेत मिलता है कि जंम के बाद पहले घंटे के दौरान पोषक तत्व और हार्मोनल कमी के साथ जुड़े मस्तिष्क में संकेत सेल एक ही परिस्थितियों में आंत में संकेतन सेल के समान है । यह डेटा पेट और मस्तिष्क दोनों में तनाव मॉडुलन के लिए जन्म के समय मां के दूध के महत्व का समर्थन करता है । इन परिणामों के मस्तिष्क समारोह पर कोलोस्ट्रम के प्रभाव के आगे अन्वेषण के लिए की आवश्यकता को रेखांकित ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने इस प्रोटोकॉल को तैयार करने में उनकी सहायता के लिए Manon रेंजर और एलेक्जेंड्रा Schulz का धन्यवाद किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford solution Bio Rad
Protein lysis kit Protein simple CBS403 Bicine/CHAPS
WES kits Protein simple WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a Cell Signaling technology SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR Cell Signaling technology 2103
Rabbit anti-phospho-PKR Millipore Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR Cell Signaling technology 12297
rabbit mAb anti-GAPDH Cell Signaling technology 2118
mouse mAb anti-phospho-IKB Cell Signaling technology 9246
mouse mAb anti-IKB Cell Signaling technology 4814
rabbit anti-BiP Cell Signaling technology 3183
Rabbit anti GCN2 Cell Signaling technology 3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2 BIORBYT T899
pregnant Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories
Punch device WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50

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References

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Klein, B. Y., Tamir, H., Anwar, M., Ludwig, R. J., Kaidbey, J. H., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding. J. Vis. Exp. (141), e58341, doi:10.3791/58341 (2018).

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