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Immunology and Infection

Évaluer le Stress cellulaire et l’Inflammation dans les noyaux en cerveau sécrétant ocytocine discrète chez le Rat néonatal avant et après la première tétée de Colostrum

Published: November 14, 2018 doi: 10.3791/58341
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1, 1, 1, 4, 1,2
1Department of Psychiatry, Columbia University, 2Department of Pathology & Cell Biology, Columbia University Medical Center, 3Department of Psychiatry, Division of Molecular Imaging and Neuropathology, New York State Psychiatric Institute, 4EB Sciences

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les noyaux de cerveau dans le cerveau de rats néonatals en conjonction avec la première prise de nourriture de colostrum. Cette technique permet l’étude du stress de l’insuffisance des éléments nutritifs dans le cerveau comme modulée par l’entérocyte de signalisation.

Abstract

Le but du présent protocole est d’isoler les nucléi riches de récepteurs de l’ocytocine dans le cerveau néonatal avant et après la première tétée de colostrum. L’expression des protéines connues pour répondre aux stress métabolique a été mesurée dans le cerveau-noyaux isolats à l’aide de Western Blot. Ceci permet de déterminer si l’insuffisance nutritive induite par le stress métabolique dans le corps déclenche stress neuronale. Nous avons déjà démontré que l’insuffisance nutritive chez les nouveau-nés provoque un stress métabolique dans le tube digestif. En outre, l’ocytocine colostrum module marqueurs de réponse, l’inflammation et autophagie cellulaire au stress dans les villosités gut rat nouveau-né avant et après la tétée première. Signalisation des marqueurs de protéines associées au stress du réticulum endoplasmique [protéine chaperon binding immunoglobulin ER (BiP), traduction eucaryote initiation factor 2 a (eIF2a) et l’eIF2a kinase protéine kinase R (p-PKR)], ainsi que deux inflammation-signalisation protéines [facteur nucléaire-κB (NF-kB) et inhibiteur κB (IkB)], ont été mesurées dans les nucléi nouveau-né [noyau du faisceau solitaire (NFS), noyau paraventriculaire (PVN), noyau supra optique (NSO), cortex (CX), striatum noyaux (STR), et noyau préoptique médian (FTU)] avant le premier flux (désamorcé par le colostrum) et après le départ des soins infirmiers (amorcée par le colostrum). Expression de BiP/GRP78 et p-eIF2a ont été positivement en désamorce et réprimés dans le tissu du SNRC apprêté. NF-kB est maintenu (élevé) dans le cytoplasme de la CX, STR et MPO, alors que le NF-kB est plus faible et inchangé en NTS, PVN et fils dans les deux conditions. Le collectif BiP et p-eIF2 conclusions concordent avec une réponse au stress. eIf2a est phosphorylée par dsRNA dependent kinase (p-PKR) dans le fils, CX, STR et MPO. Toutefois, dans le NTS (et dans une moindre mesure en PVN), eIf2a est phosphorylée par une autre kinase, contrôle général nonderepressible-2 kinase (GCN2). Les mécanismes de modulation de stress précédemment observés dans les entérocytes de l’intestin nouveau-né semblent être reflétés dans certaines régions du cerveau OTR-rich. La RNT et PVN peuvent utiliser un mécanisme de phosphorylation différents (sous des carences nutritives) provenant d’autres régions et être réfractaire à l’incidence de l’insuffisance des éléments nutritifs. Ensemble, ces données suggèrent que les réponses cérébrales au stress de l’insuffisance des éléments nutritifs sont décalés de signalisation de colostrum-amorcé des entérocytes.

Introduction

Contrairement à notre compréhension du développement du cerveau qui se produisent au cours des jours à semaines post-partum, relativement peu est connu sur la myriade de changements dynamiques qui se produisent dans les premières heures de vie chez les rats. Un défi important a été la petite taille du cerveau rat néonatal et une exigence pour les outils de pointe isoler les régions cérébrales discrètes ou des cellules isolées. Études évaluent souvent les gènes transcription et la traduction pas1,2, qui ne donne pas une bonne compréhension des niveaux fonctionnels des molécules de signalisation activées. D’autres examinent l’expression par immunohistochimie de référence des régions du cerveau, qui ne permet pas pour la quantification des niveaux d’expression3. Aucune étude à ce jour a examiné l’activation de la signalisation des voies associées colostrum premier rats' nourrir dans des régions de cerveau discrets, qui exige d’isolation rapide et de sacrifice et de mesure de l’expression de la protéine et la phosphorylation des protéines à l’aide de Western buvard. Alors que le cerveau microdissection est effectuée sur le cerveau des plus âgés et plus grands, nous n’avons pas identifié une référence à l’exécution d’un coup de poing non-single-cellules cérébrales dans un cerveau de P0. Cet article présente un protocole pour isoler les régions restreintes du cerveau néonatal en utilisant une technique de punch relativement rudimentaire et un Western Blot procédure pour mesurer l’expression de la protéine dans des échantillons relativement faibles. Ce protocole peut convenir pour des questions de recherche qui exigent l’évaluation de l’expression des protéines et des modifications post-traductionnelles (e.g., phosphorylation) dans les régions relativement restreintes de petits cerveaux de toute espèce, à condition que le l’utilisateur peut identifier visuellement la région du cerveau d’intérêt avec un atlas et des points de repère identifiables.

Cette technique a été développée pour comprendre les changements qui se produisent dans le cerveau à la suite de colostrum premier rats néonatals, aliments pour animaux, qui est riche en ocytocine (OT). OT a été longtemps connue pour sa capacité à stimuler la contraction réflexe d’éjection et de l’utérus de lait. Cependant, OT sait maintenant jouer un large éventail de rôles dans la régulation de nombreuses fonctions corporelles et comportements4. Par exemple, OT s’oppose le stress et l’inflammation en conjonction avec des comportements adaptatifs affiliatif5, retarde la vidange gastrique et ralentit le transit intestinal. Les récepteurs OT (OTR) ont été identifiés dans les neurones entériques et épithélium intestinal6,7,8. Les effets gastro-intestinaux de OT sont particulièrement importantes pour le nourrisson pendant le début de la période postnatal. Par exemple, l’allaitement est associée à la livraison de quantités importantes d’OT pour le tube digestif néonatal9,10, et les données montrent que l’OTR est fortement surexprimé dans les villosités duodénales pendant le lait de cochon de lait période8.

Des expériences in vitro à l’aide d’une lignée de cellules du tube digestif ont démontré au niveau cellulaire que l’ocytocine module molécules importantes dans le stress signalisation voie11,12 et joue un rôle régulateur dans la traduction des protéines 12. ces études suggèrent que les composants du lait, notamment ocytocine exogène de la mère, sont importants dans la réponse dévoilée de protéine chez les nouveau-nés afin de réduire le stress cellulaire13.

Des études in vivo et ex vivo ont montré que le colostrum OT module les marqueurs de réponse, l’inflammation et autophagie cellulaire au stress dans les villosités gut rat nouveau-né. Entérocytes nouveau-nés souffrent de stress cellulaire important sur leur côté luminal lorsque l’intestin est exposée simultanément à microbiote de la mère dans le colostrum14,15 et de nombreuses protéines, y compris les hormones telles que l’OT9 , 10 , 16.

Les effets de l’OT sur le cerveau ont été étudiés17. Cependant, les mécanismes de signalisation OT a démontré dans le tube digestif au cours de la période postnatale précoce n’ont pas été étudiées dans le cerveau. Dans cet article, une méthode pour isoler des nucléi discrètes dans le tronc cérébral de rat néonatal et l’hypothalamus par électrophorèse est utilisée pour profiler des régions isolées du cerveau. L’objectif général de cette méthode consiste à capturer l’état de la signalisation dans les zones du cerveau aussi près que possible à la naissance, avant et après le premier lait de cochon de lait, dans le tissu cérébral avec l’index le moins élevé de glial/neuronale de cellules. La raison d’être pour le développement de cette technique est qu’elle permet l’isolement rapide restreint, microscopique de régions du cerveau chez les chiots nouveau-nés avec une collection plus homogène des neurones pour ex vivo études utilisant un immunobuvardage automatisé méthodologie, offrant des résultats très cohérents sur relativement petits échantillons disséqués. Une lacune du travail préalable comprend plus brute dissection (tranches de cerveau ou cerveau entier) et les plus anciens animaux18,19. Le cerveau des jeunes chiots est incroyablement dynamique, avec des vagues de différenciation gliale après la naissance. Afin d’étudier les changements de cerveau influencées par les chiots première alimentation, étudier les noyaux neuronaux restreints avec dissection reproductible est nécessaire.

Flux de lait est généralement analysé pour ses effets immunologiques et nutritionnels sur l’expression de gène ou de santé (par exemple, dans les entérocytes20,,21), alors que son effet sur les zones du cerveau pendant le développement du cerveau est rarement étudié. L’effet de lait transit dans l’intestin sur la fonction cérébrale a été analysée en ce qui concerne le tube digestif la cholécystokinine récepteurs vagaux relais des noyaux du tronc cérébral, mais pas de voies signalisation intracellulaire22. Il y a une vaste littérature sur la vulnérabilité du cerveau en développement du nouveau-né à la malnutrition des mères pendant la grossesse23, mais les signaux de stress et l’inflammation ne sont pas abordées. Ce qui est important, la méthode actuelle tire parti d’un phénomène chez les nouveau-nés de jour zéro rat qui isole les stimuli de colostrum sang-né de vagal relais de stimuli viscéraux. C’est la période d’hypo-réactivité soi-disant contrainte caractérisée par immatures noyau du faisceau solitaire (NTS)-circuit hypothalamique immédiatement après la naissance24,25 qui restreint la RNT, noyau paraventriculaire (PVN), et noyau supraoptique (fils) des signaux à des stimuli de sang-né.

Cette méthode est utile pour l’analyse des multiples voies de signalisation et relativement restreint aux cellules neuronales, pourvu que le tissu cérébral est récolté au jour post-natal-0 chez le rat, en plus de savoir si les mères ont été contestées ou non par un quelconque traitement pendant la grossesse. Litières peuvent être analysées pour les effets du colostrum nourrir contre alimentation pré signalisation. Lorsque l'on compare les signaux entre les zones du cerveau avec les pauvres par rapport aux rendements de protéine riche, cette méthode permet de déterminer dans les capillaires-protéines totales des bandes polypeptide dans capillaires sont parallèles au immunitaire-dosage des antigènes protéiques. Cette méthode permet la comparaison quantitative, en unités arbitraires, des résultats obtenus par le même anticorps sans courbes quantitatives standard et en se référant à des protéines totales par capillaire. En comparant les résultats obtenus par les différents anticorps est possible uniquement à l’aide de courbes standard quantitatives.

Cette méthode a permis pour l’évaluation de bidirectionnel de signalisation qui se produisent entre l’intestin et le cerveau et qui peut avoir un impact fonction dans les deux organes26. L’association entre prise d’ocytocine et de la nourriture, qui a été largement étudiée au cours des dernières années27, prend en charge un lien entre l’ocytocine accrue de signalisation et de la disponibilité des nutriments. Ces études soutiennent également le concept de converse que les déficits sont couplés avec des réductions dans la signalisation de l’ocytocine hypothalamique de l’énergie.

Des études antérieures de l’effet de l’OT sur l’activité cérébrale ont démontré que l’inflammation intestinale induite provoquée cFos transcription dans cortex hypothalamique, PVN, amygdale et piriforme, qui est réfractaire à une vagotomie28. Toutefois, une perfusion systémique de l’OT avec la sécrétine diminue la réponse de cFos de cerveau à la réaction inflammatoire provoquée dans le tube digestif28. Cela suggère que l’effet de l’OT exogène a été réalisée par des voies autres que des relais vagales, éventuellement par l’intermédiaire de molécules de signalisation véhiculés par le sang transportés par le biais de l’area postrema6,29.

Dans cette étude, les voies de signalisation cellulaire au stress qui ont été observés auparavant dans le tube digestif ont été évaluées dans le cerveau. L’hypothèse était que les composants du lait peuvent protéger ou de différer l’effet de l’inflammation sur la perméabilité intestinale en métabolites microbiens, d’autres, et à leur tour, les effets sur le cerveau en fonction. Les différences clairement antagonistes en IkB contre BiP de signalisation trouvés dans les villosités, avant et après l’amorçage par le colostrum13, suggèrent que le cerveau des nouveaux-nés, toujours en train de développer, peut-être détecter ces signaux intestinale induite par le colostrum.

On a mesuré des marqueurs protéiques signalisation utilisés dans des expériences antérieures de tube digestif qui sont associés avec le stress du réticulum endoplasmique. Il s’agit notamment de l’escorte ER BiP, translation initiation factor eIF2a (qui sert un stress réponse intégrateur30), eIF2a kinase p-PKR et deux protéines de l’inflammation-signalisation (NF-kB et son inhibiteur, IkB).

Six régions cérébrales selon leur capacité chez l’adulte pour sécréter ou répondre à OT ont été choisies. Le NTS, situé à la médullaire supérieure, est le premier relais de l’entrée viscérale et reçoit signalisation directe des neurones sensoriels vagales dans le tube digestif31 et cytokines éventuellement sang-né, toxines et hormones via la zone adjacente-postrema32. Le PVN, noyau supraoptique (fils), striatum noyaux (STR), cortex cérébral (CX) et noyau préoptique médian (FTU) reçoivent de signalisation provenant de l’intestin par l’intermédiaire de l’ent.

Résultats ont montré que la réponse cellulaire au cours de la période postnatale immédiate avant l’amorçage du colostrum et immédiatement après que la première prise de nourriture est différente en NTS comparée à PVN et fils. Signalisation en CX, STR et FTU différaient de celle du PVN et fils, aussi bien. Les fonctions de protection distinctes des OT décrite précédemment pour moduler le stress cellulaire et l’inflammation dans l’intestin sont probablement détectées par certaines régions du cerveau. Collectivement, les données indiquent qu’au niveau cellulaire, pendant les premières heures après la naissance, le cerveau réagit au stress métabolique associé à l’insuffisance des éléments nutritifs. Les données montrent également que la portée et l’orientation des effets modulateurs du colostrum se nourrissent sont axées sur la région et que dans certaines régions, elles reflètent les effets OT montrés précédemment dans le tube digestif.

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Protocol

Cette étude a été approuvée par les commissions d’utilisation de Columbia University et le New York State Psychiatric Institute et d’animalier institutionnel.

1. préparation du tissu

  1. Commander des rates gravides chronométrés de vendeur.
  2. Suivre des rates gravides chronométrés en observant leur abdomen de plus en plus dans les semaines qui suivent leur arrivée et par la suite à la recherche de chiots à la date de livraison prévue en inspectant la cage toutes les 2 h jusqu'à ce que la livraison commence.
  3. Supprimez les chiots avec une main gantée par leur queue avant leur première nourriture pour chiots désamorcés (aucun ventre blanc lait n’apparaît lorsque vous affichez l’abdomen) ou après la première tétée pour chiots apprêtées (à quel point un ventre blanc sera visible sur leur abdomen) comme décrit dans le timeli ne (Figure S1).
    Remarque : Le premier flux de colostrum est qualifié d’amorçage le chiot ; ainsi, un chiot est désamorcé jusqu'à la première alimentation, après quoi ils sont sensibilisées colostrum.
  4. Rapidement décapiter le pup non anesthésié à l’aide de ciseaux pointus, propre chirurgicales.
  5. Enlever le cerveau en coupant la peau vers le bas de la ligne médiane et la surface supérieure du crâne à la truffe. Puis, à l’aide de pinces, dégager doucement loin l’OS pour exposer le cerveau (Figure 1 a) et localiser le bregma, marquer avec un stylo comme les plaques osseuses sont supprimés (Figure 1 b).
  6. Placez rapidement le cerveau entier dans un moule de cerveau de méthacrylate de polyméthyle à température ambiante pendant coronale tranchage à température ambiante (Figure 1).
  7. Sans tarder, faire 500 tranches de mm d’épaisseur à l’aide d’une lame de rasoir fraîche. Poser les tranches rostrales à caudale dans une boîte de Pétri pour maintenir l’orientation des sections (Figure 2).
  8. Rapidement ajouter artificiel liquide céphalo-rachidien (FSCA ; 1,0 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 118,6 mM NaCl, KCl, 203,3 mM MgCl2-6 H2O 3,0 mM) sans glucose et incuber les tranches pendant 60 min à 28-30 ° C, en remuant constamment sur une agitateur orbital métaboliquement et différentiellement contester la désamorcé par rapport aux tissus colostrum-amorcé.
  9. Identifier les noyaux du cerveau qui sont nécessaires pour percer à l’aide d’un atlas de cerveau33 et les repères anatomiques sur la section de tissu. Placez cette tranche avec les noyaux d’intérêt dans une boîte de Pétri et déplacez-le vers le microscope à dissection.
  10. Une fois visualisé, poinçonner rapidement 4 des 6 noyaux différents à l’aide d’un outil de carottage, sélection de la taille pour mieux percer le noyau en question et cohérente entre les échantillons (Figure 2).
    Remarque : La tranche restante de cerveau auront désormais un trou où les tissus cérébraux a été supprimé. Dans cette étude, nous avons excisé les noyaux suivants à l’aide de la ci-dessous les coordonnées. Tout antérieur/postérieur (A / P) coordonnées proviennent de Bregma (à l’exception du SNRC, c'est-à-dire en ce qui concerne le Calamus Scriptorius). Toutes les coordonnées (D/V) de dorsale/ventrales sont de la surface du cortex (à l’exception du SNRC, qui est de la surface du bulbe rachidien). Les coordonnées suivantes incluent A / P, medial/lateral (M/L) et D/V en mm : 1) noyau du faisceau solitaire (NTS, A / P, 0,4 à 0,8 ; L, ± 0,2 ; D/V, 0,3 (à partir de la surface du bulbe rachidien), 2) noyau paraventriculaire (PVN, -0,8 ; ± 0,2 ; 0), 3) noyau supra optique (fils, -1,1 ; ± 1,4 ; 4.3), 4) cortex (CX, zone de cortex partielle 1, -2,8 ; ± 1,5 ; 0,6), 5) noyaux striatum (STR,-0.0 ; ± 1,6 ; 1,8) et 6) préoptique médial noyau (MPO, -0,6 ; ± 0,2 ; 4.2).
  11. Rapidement immerger les noyaux perforées à 0,06 mL de tampon d’extraction de protéine glacee, contenant des inhibiteurs de la protéase et les inhibiteurs de la phosphatase pendant 60 minutes (voir étape 2.3).

2. Extraction de protéines

  1. Préparer la solution d’extraction de protéine à l’aide de la trousse de lyse des protéines (Table des matières) le jour avant la livraison du chiot attendus.
  2. Dégel (sur glace) la solution aqueuse de congelés (-20 ° C) des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase de la trousse de tampon de lyse et placez le tampon de lyse et la solution de DMSO des inhibiteurs de protéases/phosphatases sur glace.
  3. Ajouter 1,85 mL de tampon de lyse dans un tube propre et glacée 15 mL. Puis, ajouter 0,1 mL de solution aqueuse d’inhibiteurs et 0,05 mL de DMSO-dissous inhibiteurs. Enfin, cap et brièvement vortex le tube et le conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
  4. 24 tubes de microcentrifuge propre (0,5 mL chacune) pour la procédure de la lyse de l’étiquette. Représentant 12 tubes par le cerveau pour le groupe de colostrum-désamorcé (U) [6 gauche (L) et 6 nucléi droite (R)] et l’étiquette selon l’acronyme de noyaux, côté et la condition (e.g., U-L-NTS, NTS-R-U, etc.). Le deuxième groupe de 12 tubes pour les échantillons de colostrum-amorcé de l’étiquette.
  5. L’étiquette de deux autres ensembles de tubes comme faite à l’étape 2.4 pour les extraits de protéine stock (à l’aide de tubes de 1,5 mL Eppendorf-style) et pour le premier ensemble de préparation de l’échantillon (à l’aide de tubes de 0,5 mL). Gardez ces tubes dans deux boîtes congélation séparés, étiquetées (chacun étant conçu pour 100 tubes). Une boîte sera utilisée pour les échantillons désamorcés et l’autre pour les échantillons de couche d’apprêt.
  6. Décongeler la solution de lyse sur la glace le jour où les chiots sont livrés, en incubant des tranches de cerveau dans l’ACSF, aliquote 0,06 mL de solution de lyse dans les tubes de procédure lysis (de l’étape 2.4) et ajouter des poinçons de noyaux et incuber dans les glaces pendant 60 min.
  7. Centrifuger les noyaux lysés incubés pendant 30 min dans une centrifugeuse mini refroidie à 14000 tr/min (10 000 x g) et Aspirez soigneusement 0,055 mL du surnageant avec une pipette correctement réglée. Transférer le liquide surnageant dans les tubes de stock de refroidissement préalable de 1,5 mL (de l’étape 2.5) et les mettre sur la glace. Avant de les congeler (à-20 ° C), les tubes de stock de protéines, transfert de 0,012 mL du surnageant dans les tubes de refroidissement préalable de 0,5 mL pour la première préparation de l’échantillon (de l’étape 2.5) et les laisser sur la glace.

3. préparation pour la mesure de la protéine dans les capillaires-

  1. Utiliser un kit et préparer les réactifs pour la séparation selon les instructions du fabricant. Ajouter 0,003 mL du mélange réactionnel réactif à chacun des 12 échantillons dans le 0,5 mL étiqueté tubes (de l’étape 2.5) sur la glace qui contiennent 0,012 mL des extraits protéiques.
  2. Mettez le bloc chauffant à 95 ° C et ajouter 0,004 mL du réactif préparé à l’étape 3.1 sur une échelle de (MW) de poids moléculaire biotinylé dans un tube à 0,016 mL d’eau désionisée. Dénaturer l’échelle et les échantillons, placer le tube de l’échelle et les 12 échantillons d’extraits protéiques désamorcé dans le bloc chauffant à 95 ° C pendant 5 min et les stocker à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
  3. Répétez les étapes 2.0 à 3,2, d’extraction de protéine pour la préparation de l’échantillon, pour les noyaux perforées de colostrum-amorcé des rats.

4. préparation de l’électrophorèse sur

  1. Décongeler la biotine étiquetage réactif (stocké au congélateur à-80 oC) sur le banc et préparer le kit de détection de protéines sur la glace à 4 ° C, suivant les directives du fabricant.
  2. 0,15 mL de luminol se mêlent 0,15 mL de peroxyde et charger 0,01 mL dans 25 puits (ligne E, puits 1-25) de la plaque de la machine automatisée de l’Ouest. 0,008 mL de streptavidine-HRP la charge de la trousse dans puits D1 à D25
  3. Charger 0,01 mL de la solution de diluant anticorps dans des puits C1 C25 et B1.
  4. Spin l’échelle tubes brièvement (2-3 secondes) et 24 échantillons de protéines dans un minicentrifuge à la piscine vers le bas de l’eau évaporée des bouchons.
  5. Charger 0,003 mL de 12 échantillons désamorcés dans puits A2 à A13, 0,003 mL de 12 échantillons de colostrum-amorcé dans puits A14 à A25 et 0,005 mL de l’échelle biotinylé dans puits A1.
  6. Laissez la ligne F vide et charger 0,45 mL de tampon de lavage dans chacun des 5 compartiments dans chacune des 3 lignes au-dessous de la ligne F. couvercle la plaque avec son couvercle en plastique pour éviter l’évaporation pendant les procédures restantes.
  7. Brièvement le vortex la biotine décongelé étiquetage réactif et ajouter 0,15 mL du réactif à son tube désigné ; puis ajouter 0,15 mL de l’agent de reconstitution des protéines totales et mélanger jusqu'à homogénéité.
  8. Retirer le couvercle de la plaque et charger 0,01 mL d’agents 1 et 2 dans des puits B2 B25. Couvrir la plaque et il Centrifuger pendant 10 min à 1 000 g pour enlever les bulles d’air de différentes solutions. Utiliser une assiette vide dans la centrifugeuse pour la balance.

5. électrophorèse

  1. Tandis que la plaque est en rotation, ouvrir un fichier à exécuter dans le Western informatique rattaché au machine automatisé en indiquant dans la page menu déroulant « fichier » pour exécuter un dosage protéique total en cliquant sur la place respective.
  2. Annoter les échantillons de puits dans l’ordinateur. Ensuite, retirez la plaque de l’enlever de la centrifugeuse le couvercle et décollez soigneusement le couvercle en aluminium des compartiments solution séparation.
  3. Placer la plaque dans l’instrument occidental automatisé, retirez le couvercle de la boîte de la cartouche capillaire, insérer la cartouche dans son endroit désigné et fermer la porte.
  4. Cliquez sur le bouton « Exécuter » et lorsque vous êtes invité avec le type du test (« protéines totales »), tapez le nom des échantillons (par exemple, « désamorcé 2-13 et colostrum-amorcé 14-25"). Cliquez sur « OK » et lorsque vous êtes invité par la date d’exécution activation et le numéro d’identification du fichier exécution, faire une indication de l’heure où la course se termine.
  5. À la fin de la course (170 min après le début), ouvrir la porte de l’appareil, retirez la cartouche capillaire et jetez-le dans l’élimination des objets pointus ou tranchants. Jeter la plaque dans l’élimination de la matière biologique.
  6. Cliquez sur l’icône de courbes de séparation dans la page analyse de la fichier à exécuter et vérifier que tous les échantillons ont exécuté correctement et montrent plusieurs courbes de protéine dans tous les vaisseaux capillaires.

6. l’analyse des protéines de signalisation

  1. Dans un tube marqué 1,5 mL, ajouter 0,003 mL de lapin anti anticorps phospho-eIF2a (p-eIF2a) et le suspendre dans 0,3 mL (dilution 1 : 100) en anticorps diluant du kit de détection appropriés. Ensuite, le garder sur la glace.
  2. Étiqueter un tube de luminol et ajouter 0,15 mL de luminol et 0,15 mL de peroxyde de ce kit de module de détection et Pipeter 0,01 mL dans puits E1 à E25 d’une plaque Ouest frais et automatisée.
  3. Distribuer 0,01 mL du secondaire anti anticorps de lapin dans puits D2 à D25 et ajoutez 0,01 mL de streptavidine-HRP du kit à bien D1.
  4. Distribuer de 0,01 mL de l’anticorps primaire (de l’étape 6.1) dans les puits C2 à C25 et ajouter 0,01 mL de solution 2 diluant anticorps aux puits C1 et B1 à B25.
  5. Laissez les puits de la ligne F vide et remplir de 0,45 mL de tampon de lavage dans les 5 compartiments de 3 lignes au-dessous de la ligne F.
  6. Tourner brièvement les échantillons réfrigérés pendant 3 s et ajouter 0,003 mL de chaque échantillon à ligne A dans le même ordre qu’ils ont été ajoutés pour le dosage de la protéine totale, à partir de A2 à A25. Ajouter 0,005 mL de l’échelle de MW biotinylé puits A1 et la plaque de recouvrement.
  7. Centrifuger la plaque comme fait par étape 4.8. Tandis que la plaque est en rotation, ouvrir (dans le logiciel automatisé associée à l’Ouest et de l’ordinateur), un nouveau fichier d’exécution et indiquer dans la page menu déroulant « Fichier » pour exécuter un test de taille moléculaire en cliquant sur le spot respectif.
  8. Dans la page de test, tapez les noms d’échantillon dans chaque capillaire, puis tapez le nom de l’anticorps primaire dans l’endroit affecté et l’anticorps secondaire d’anti-lapin en dessous.
  9. À la fin de la centrifugation, répétez les étapes 5,3 à 5,5, sauf le nom donné au fichier exécution cette fois devrait être « p-eIF2a désamorcé 2 – 13 et 14 – 25 colostrum-amorcé ».
  10. Après la séparation de l’électrophorèse, vérifiez le fichier à exécuter pour la réactivité immunitaire pics d’antigènes à des tailles de 40 – 43 kDa. Où MW des pics de cette taille sont manquants, faites un clic droit au-dessous de la courbe et indiquer à l’intérieur de la liste déroulante pour ajouter MW à la crête, qui fait en sorte que la taille et la quantité arbitraire au-dessous de la courbe sont enregistrées.

7. traitement des résultats

  1. Ouvrir un fichier de feuille de calcul pour la protéine totale exécuter dans le Western automatisé exécuter fichier et fournir un numéro d’identification.
  2. Ouvrez le fichier d’exécution de l’analyse de la protéine totale dans la page d’analyse sur le mode de la courbe et marquer tous les pics dans les capillaires. Ensuite, copier et coller dans la feuille de calcul et les aires sous la courbe de tous les pics enregistrés dans le capillaire tout la somme.
  3. Dans une colonne séparée, organiser la quantité totale de protéines pour chaque colonne avec capillaires numéros, noms des noyaux respectifs de cerveau et les numéros d’identification des dossiers d’exécution.
  4. Ouvrez une feuille de calcul pour l’antigène p-eIF2a et dans une seule colonne, inscrire l’aire sous la courbe de chaque capillaire-by-side avec son nombre capillaire respectif, le nom du noyau du cerveau et numéro d’identification du fichier exécution.
  5. Copiez la colonne de protéines totales (parallèle aux quantités courbe p-eIF2a) dans une troisième feuille de calcul et de calculer la p-eIF2a:total rapports de protéine dans une troisième colonne.
  6. Recueillir les résultats des étapes 4 à 6 pour chaque noyau de cerveau, répartissez-les dans les groupes de noyaux et générer un graphique à barres.

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Representative Results

Les bandes représentatives d’immunoréactivité par rapport aux protéines totales montrent qu’il y a des nucléi avec récoltés très pauvre en protéines. Ceci nécessite l’utilisation de la technique automatisée de Western blot, qui est très sensible par rapport à la tache occidentale canonique. Cette approche peut être exécutée avec sino-européen moins de protéines par capillaire par rapport à la voie par dans les transferts Western.

Effets différentiels d’apprêtage de colostrum sur les niveaux de BiP dans les noyaux de cerveau

Les sections coronales de cerveau de rat ont été récoltées avant le premier colostrum alimentation (désamorcé) et après la première prise de nourriture (amorcée). Des échantillons ont été fractionnés par électrophorèse capillaire (sur WES), et les protéines ont été quantifiés à l’aide du kit pour la coloration capillaire en protéines totales (voir le protocole). Supplémentaire immunitaire fractionnement capillaire sur le Western automatisé fourni identification des antigènes protéiques respectifs. Dans la Figure 3 a, expression de protéines représentante BiP apparaît dans le panneau supérieur, avec la protéine totale correspondante ci-dessous. BiP est une protéine chaperon de ER. Dans la Figure 3 b, immunoréactivités étalonnées sont présentées par graphiques à barres par rapport à la protéine totale correspondante.

Dans les échantillons de tissus désamorcé, BiP niveaux en NTS étaient significativement plus que toutes les autres régions (p < 0,05, n = 4 noyaux). Apprêtage de tissus de tube digestif avec le colostrum a un effet inverse en NTS, comparativement à une augmentation BiP dans d’autres régions, par rapport au tissu désamorcé (Figure 3 b). D’amorçage a diminué de BiP en RNT (Figure 3 b) et n’avait aucun effet sur le PVN et Sopp. Cependant, l’amorçage augmenté BiP en CX, STR et FTU par rapport au tissu désamorcé. Ces données implique que BiP niveaux dans divers noyaux testé cerveau ne réagissent différemment aux amorçage du tube digestif et qu’il pas encore tout a démontré la diaphonie entre les noyaux différents testés.

Effets différentiels de l’amorçage de colostrum niveau ElF2a et p-elF2a dans les noyaux de cerveau

Échantillons de tissu de cerveau ont été préparés, analysés et quantifiés comme illustré dans la Figure 3 a et 3 b. Comme avec BiP niveaux (Figure 3 b), elF2a et p-elF2a les niveaux en NTS ont été élevés dans la condition désamorce par rapport à d’autres noyaux (Figure 4 b et 4C). Comme l’a démontré avec des niveaux de BiP, la réponse dans NTS d’apprêtage de tissus de tube digestif avec le colostrum était opposée à celle dans les autres noyaux. Niveaux d’elF2a et de p-elF2a en NTS ont été réduites par rapport au tissu désamorcé. Dans tous les autres noyaux testés, amorçant une augmentation des niveaux d’elF2a et de p-elF2a par rapport au tissu désamorcé (Figure 4 b et 4C).

Phosphorylation d’elF2a par la kinase GCN2 NTS et PVN après l’amorçage de colostrum

Échantillons de tissu de cerveau ont été préparés, analysés et quantifiés comme illustré à la Figure 3. D’amorçage décédé p-PKR en PVN (χ2 p = 0,025), contrairement à dans toutes les autres régions où elle a été augmentée. Niveaux de résultats (Figure 4), à l’encontre de p-elF2a de p-PKR étaient faibles dans les échantillons désamorcés par rapport aux échantillons amorcées en RNT (Figure 5 a). La phosphorylation d’elF2a est généralement catalysée par ses kinase PKR en réponse au virus34 et OT dans le tube digestif, comme précédemment démontrée11. Toutefois, le fait que les niveaux de p-PKR étaient très faibles dans désamorcé fortement contre apprêtée NTS (par rapport à d’autres noyaux, Figure 5 a) suggère qu’une autre kinase doit être impliqué dans la phosphorylation d’elF2a (Figure 4). En conséquence, les niveaux GCN2 furent testés en NTS et PVN parce que c’est aussi une kinase connue d’elF2a35. Niveaux de p-GCN2 (forme active) étaient plus élevées dans les échantillons désamorcés par rapport aux échantillons apprêtées NTS PVN (Figure 5 b) et GCN2 (forme inactive), par rapport à p-GCN2, a été inversement exprimée en PVN (Figure 5). pGCN2 en RNT (Figure 5) a suscité inversement pPKR (Figure 5 a) en NTS fois désamorcé et apprêtée. Dans le tissu apprêté, p-eIF2a était nettement plus faible chez NTS que dans toutes les autres régions du cerveau [PVN (p < 0,01), fils (p < 0,01), CX (p < 0,01) et MPO (p = 0,02)]. Ceci indique que pGCN2, plutôt que de pPKR, était responsable d’eIF2 inhibition en NTS.

Amorçage de colostrum inhibe la NF-kB dans la CX, STR et MPO

Figure 6 a montre que les niveaux de l’IkB étaient significativement plus élevées chez les fils désamorcé échantillons échantillons vs amorcées. IkB niveaux fils, CX, STR et FTU tendanciel supérieur dans la même direction. Dans la Figure 6, niveaux de NF-kB dans la CX, STR et MPO étaient significativement plus élevées chez amorcée par rapport aux tissus désamorcé. Toutefois, les niveaux de NF-kB étaient significativement plus faibles dans les tissus du SNRC apprêté, qui suggère que le colostrum a un effet anti-inflammatoire distinct sur cette région du cerveau. Cytosolique de NF-kB est supérieur (rétention) dans des échantillons NTS désamorcés, alors que son inhibiteur IkB a été faible et inchangée dans des échantillons de couche d’apprêt. Ceci suggère qu’un mécanisme distinct de l’anti-inflammatoire est réglementer NF-kB dans NTS. Cet effet de stress de l’insuffisance des éléments nutritifs est conforme aux résultats actuels qui insistent sur les marqueurs BiP et p-eIF2a sont les deux régies par la présence d’apprêtage de colostrum (Figures 3 et 4, respectivement), il est également indiqué dans le précédent BiP et p-elF2a résultats10. La raison de la réponse distincte d’IkB et NF-kB dans NTS par rapport à la CX, STR et FTU n’est pas encore pleinement comprise. Toutefois, il est compatible avec l’observation que le NTS, qui relaie les signaux provenant de l’intestin vers le cerveau, peut jouer un rôle crucial pour répondre de façon unique et opposées par rapport aux autres régions du cerveau par rapport à l’inflammation périphérique36. Niveaux d’IkB CX, STR et MPO étaient faibles (Figure 6 a), par rapport à des niveaux élevés de NF-kB dans les mêmes zones (Figure 6). Bien que cette conclusion est apparemment en contradiction avec la prémisse que IkB est contraignant et conservant NFkB dans le cytosol, calcul différent des données qui combine plusieurs échantillons tout apprêtées en CX, STR et FTU utilisant l’analyse de régression révèle que NF-kB hautement corrèle avec IkB (p < 0,0001, n = 24)

Figure 1
Figure 1 : dissection de cerveau de rat néonatal. (A) le cerveau disséqué est montré avec os ont été retirés rostral au bregma. (B), le cerveau est montré après qu’une ligne a été établie au bregma, après quoi les plaques osseuses restantes ont été supprimés. (C) le cerveau est indiqué dans un moule de cerveau de méthacrylate de polyméthyle juste avant d’être tranchés avec une lame de rasoir. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : cerveau en tranches disposées de rostral à caudale avec poinçons (cercles rouges). Abréviations : CX : cortex, lobe pariétal ; MPO : aire préoptique médial ; NTS : solitaires noyau du faisceau ; PVN : le noyau paraventriculaire ; FILS : noyau supraoptique ; et STR : striatum. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : réponse de BiP/GRP78 en NTS est inversé à celle des autres noyaux. (A) expression de la protéine représentant BiP dans le panneau supérieur par rapport aux protéines totales présentées dans le tableau ci-dessous. Notez que la densité de protéines totales dans les capillaires divers sont hétérogènes, et elles sont utilisées pour égaliser l’expression BiP respectif par protéine dans panneau b. (B) illustré est le BiP moyens par rapport aux protéines totales dans les noyaux de cerveau d’échantillons désamorcé ( bleu) par rapport aux échantillons de colostrum-amorcé (bruns). Désignent des astérisques de couleurs respectives des différences significatives (p < 0,05, n = 4 noyaux) entre BiP en NTS versus PIF dans les autres noyaux. Expression de BiP dans désamorcé par rapport aux échantillons amorcées en NTS sont inversées sensiblement à ceux de STR (χ2 p = 0,028, n = 4). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : eIF2a actifs et inactifs (p-eIF2a) réponse à amorçage de colostrum par rapport aux échantillons désamorcés dans NTS inversé à celle des autres noyaux. Représentant expressions de protéine d’eIF2a et de p-eIF2a (A) sont affichées dans les panneaux supérieurs. Les voies de protéines totales sont présentés sur le panneau inférieur. Il est décrit (B) est la moyenne eIF2a des 4 échantillons calculées par rapport aux protéines totales (à partir de la paroi inférieure A) dans les noyaux de cerveau d’échantillons désamorcés (bleus) par rapport aux échantillons de colostrum-amorcé (bruns) et (C) la forme inactive d’eIF2a (p-eIF2a). Désignent des astérisques de couleurs respectives des différences significatives (p < 0,05, n = 4 noyaux) entre les deux formes d’eIF2a en NTS par rapport aux niveaux respectifs dans les autres noyaux. Actif eIF2a expression dans désamorcé par rapport aux échantillons amorcées en NTS sont inversées sensiblement à ceux de la CX, STR et MPO (χ2 p < 0,05 par rapport à tous les trois noyaux, n = 4). Barres d’erreur représentent écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : NTS exprime eIF2a kinase p-GCN2, en accord avec le niveau de p-eIF2 et inversement au niveau p-PKR. (A) le niveau de p-PKR (kinase activée dsRNA d’eIF2a) est exprimé en désamorcé versus le colostrum-amorcé NTS inversement à 1) au niveau de p-PKR en PVN (χ2 p = 0,025) et 2) ses attendus ciblées substrat eIF2a après sa phosphorylation (to p-eIF2a, Figure 2). Notez que le modèle de p-PKR en fils, CX, STR et FTU de désamorcé par rapport aux échantillons de colostrum-amorcé s’adapte les patrons respectifs de p-eIF2a de la Figure 2. (B) actif eIF2a kinase (p-GCN2) en désamorcé versus apprêtée NTS échantillons suit un modèle similaire d’expression de la p-eIF2a de la Figure 2 et un modèle inverse de l’expression pPRK Figure 3 a (χ2 p = 0,028). C = concentrations moyennes de GCN2 inactif. Barres d’erreur représentent écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : expression cytoplasmique de NF-kB et IkB dans les noyaux de cerveau d’échantillons gut désamorcé et colostrum-amorcé. (A) expression cytoplasmique moyenne d’IkB par rapport aux protéines totales (à partir de panneau C) aux noyaux du cerveau indiquée. (B) des bandes cytoplasmiques représentatif de protéine IkB sont présentés dans le panneau supérieur et de la densité de protéines totales dans les couloirs respectifs dans le panneau inférieur. (C) expression cytoplasmique moyenne de NF-kB par rapport aux protéines totales (à partir de panneau D) aux noyaux du cerveau indiquée. (D) des bandes cytoplasmiques représentant des bandes de NF-kB sont présentés dans le panneau supérieur et de la densité totale de protéine cytoplasmique dans les couloirs respectifs dans le panneau inférieur. Couleurs astérisques désignent des différences significatives entre les échantillons indiquées (p < 0,05, n = 4). Notez que les niveaux cytoplasmiques de NF-kB sont plus élevés dans le colostrum-amorcé CX, STR et FTU que dans les noyaux hypothalamiques NTS, PVN et fils en désaccord avec les niveaux de l’inhibiteur de la NF-kB (IkB). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : schéma comparant l’hypothèse OT de signalisation dans les régions de cerveau et l’intestin colostrum-amorcé. (A) OT de Colostrum dans les entérocytes active son récepteur via une interaction directe avec l’OTR, réduction de l’inflammation par une augmentation IkB de signalisation en aval. Traduction de la protéine est inhibée en augmentant p-PKR, qui diminue l’activité elF2a par phosphorylation. L’homéostasie est rétablie via une augmentation BiP gene expression13,37. (B) Neuronal ou circulatoire OT active son récepteur dans les CS, STR et FTU régions du cerveau, Ciapin inflammation et protéine traduction via les mêmes molécules comme le tube digestif (voir tableau A). (C) l’hypothétique d’effets d’apprêtage de colostrum dans la région SNRC du cerveau sont distincts et en face de ceux des groupes A et B. GCN2, qui est sensible à l’apport en acides aminés, augmente la traduction d’eIF2a et de protéines. Dans le même temps, des niveaux bas d’IkB permettent de NF-kB entrer dans le noyau et induisent une inflammation. Notez que BiP agit de même pour restaurer l’homéostasie dans le tube digestif et en NTS dans le cerveau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplementary Figure
Supplémentaire Figure 1 : Schéma montrant la chronologie protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Une technique pour microdissection Discrete, noyaux de cerveau OTR-riches dans le cerveau de rat néonatal est présentée dans cet article. Il est bien établi que les neurones sont très spécialisés, même à l’intérieur des noyaux bien caractérisés dans le cerveau. Cette approche hautement reproductible pour isoler les noyaux riches en OTR spécifiques permet des tests d’hypothèse robuste. L’utilisation automatisée Éponger occidental, l’uniformité et la reproductibilité des résultats ont été encore améliorées. Alors qu’une limitation de cette technique reste la variabilité punch modeste cerveau ; Cette technique représente une avancée sur unicellulaires, cerveau entier ou approches de tranches de cerveau. Approches unicellulaires sont compliquées en fournissant des clichés très limitée. À l’aide de tout le cerveau, tous les résultats peuvent être dilués si l’effet est limité à une région du cerveau ou un sous-type neuronale. Cerveau tranche approches sans microdissection peuvent introduire une profonde variabilité dans les résultats au sein de simples microns dans une tranche, ce qui est particulièrement problématique pour l’hypothalamus dans cette étude, en raison de groupement serré des noyaux distincts. La variabilité dans les mesures de la protéine à l’aide d’un poinçon normalisé et l’aide d’un microscope, a été réduite.

Il y a plusieurs étapes critiques au sein de ce protocole. Il s’agit d’adhésion pour le moment de la récolte de tissus en ce qui concerne le premier flux, en utilisant un volume minimal de tampon d’extraction de protéine, l’incubation des tranches de cerveau dans le FSCA afin que moléculaires inhibiteurs ou stimulants peuvent être utilisés et en utilisant un sensible dispositif immunitaire-électrophorétique. Les modifications possibles incluent le choix des réactifs pour l’incubation et la durée d’incubation et de prorogation du délai de la famine désamorcé pour comparer les cerveaux en temps équivalents. Restrictions importantes incluent la présence de quelques cellules non neuronales (même pendant cette période néonatale précoce) et un nombre restreint d’échantillons qui peuvent être préparés d’une portée de nouveaux-nés en un jour. En outre, cette approche est totalement tributaire de quand les chiots sont nés. En ce qui concerne les méthodes existantes, expression des gènes dans le cerveau à cet âge est, en général et plus commodément, évaluée au niveau transcriptionnel. Toutefois, pour la cellule analyse de signalisation, l’approche protéomique exécuté par l’équipement d’installations de base est plus cher que les Bureau instruments automatisés. La méthode conventionnelle de Western blot nécessite beaucoup plus de protéines, dure plusieurs jours et implique plusieurs étapes de manipulation par le personnel technique. Cette approche automatisée requiert 0,8 µg de protéines par capillaire, une fois chargée dans l’instrument toutes les étapes sont exécutées sans homme mains interférence et prend 2 h et 50 min pour terminer la course. Cette technique peut être utilisée pour étudier le développement du cerveau postnatal immédiat chez le rat et le large éventail de modèles murins génétiquement manipulés.

En utilisant cette technique, les effets de l’OT au niveau cellulaire, plus précisément dans la période très critique entre la naissance et de l’alimentation, ont été étudiés lors de l’OTR s’exprime au maximum dans l' épithélium8. Les effets modulateurs de l’OT sur cellule signalisation des molécules dans les cellules de l’intestin, dans une cellule ligne37 et in vivo13, précédemment recueillies. Dans la présente étude, les effets observés dans les cellules de l’intestin ont été évaluées dans des régions de cerveau riches en OTR. L’expression de BiP/GRP78 et p-eIF2a a été positivement en désamorce (compatible avec une réponse prévisible au stress) et réprimés dans le tissu du SNRC apprêté (conformément à une réponse atténuée au stress), alors que le NF-kB est élevée et stable dans les deux conditions 38. expressions de BiP et NF-kB étaient les mêmes dans les autres régions testées en conditions désamorcées ou apprêtées. eIf2a est phosphorylée par dsRNA dependent kinase (pPKR) dans le fils, CX, STR et MPO. Toutefois, dans le NTS et dans une moindre mesure en PVN, eIf2a est phosphorylée par une autre kinase, contrôle général nonderepressible-2 kinase (GCN2). Un schéma illustrant l’hypothèse des différences dans la signalisation dans le cerveau et l’intestin provoquée par une exposition de colostrum est présenté à la Figure 7.

Ce fait de technique de microdissection, il est possible de vérifier les hypothèses relatives à l’incidence de la premier colostrum se nourrit de signalisation liés au stress dans les noyaux riches en OTR discrètes dans le cerveau néonatal. Ces données suggèrent que les mécanismes modulant de stress précédemment observés dans les entérocytes de l’intestin de nouveaux-nés sont reflétées dans certaines régions du cerveau riches en OTR, comme illustré par l’augmentation de la rétention cytosolique de NFKB (PVN, fils CX, STR et MPO). Les résultats indiquent également que le NTS et PVN utilisent un mécanisme de phosphorylation différent des autres régions qui peut être réfractaire à l’incidence de l’insuffisance des éléments nutritifs. Collectivement, les données indiquent que signalisation de cellules dans le cerveau associée à l’insuffisance nutritive et hormonaux durant les premières heures après la naissance est semblable à la cellule de signalisation dans le tube digestif dans les mêmes conditions. Ces données confirment l’importance du lait maternel au moment de la naissance pour la modulation du stress dans l’intestin et le cerveau. Ces résultats soulignent la nécessité d’une poursuite de l’exploration de l’impact du colostrum sur la fonction cérébrale.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Manon Ranger et Alexandra Schulz pour leur aide dans la préparation de ce protocole.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford solution Bio Rad
Protein lysis kit Protein simple CBS403 Bicine/CHAPS
WES kits Protein simple WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a Cell Signaling technology SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR Cell Signaling technology 2103
Rabbit anti-phospho-PKR Millipore Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR Cell Signaling technology 12297
rabbit mAb anti-GAPDH Cell Signaling technology 2118
mouse mAb anti-phospho-IKB Cell Signaling technology 9246
mouse mAb anti-IKB Cell Signaling technology 4814
rabbit anti-BiP Cell Signaling technology 3183
Rabbit anti GCN2 Cell Signaling technology 3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2 BIORBYT T899
pregnant Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories
Punch device WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50

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Klein, B. Y., Tamir, H., Anwar, M., Ludwig, R. J., Kaidbey, J. H., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding. J. Vis. Exp. (141), e58341, doi:10.3791/58341 (2018).

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