Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Beoordeling van cellulaire Stress en ontsteking in Discrete oxytocine-afscheidende kernen van de hersenen in de neonatale Rat vóór en na de eerste biest voeding

Published: November 14, 2018 doi: 10.3791/58341
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1, 1, 1, 4, 1,2
1Department of Psychiatry, Columbia University, 2Department of Pathology & Cell Biology, Columbia University Medical Center, 3Department of Psychiatry, Division of Molecular Imaging and Neuropathology, New York State Psychiatric Institute, 4EB Sciences

Summary

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van de kernen van de hersenen in de neonatale rat hersenen in combinatie met het eerste biest voeden. Deze techniek maakt het mogelijk de studie van nutriënten insufficiëntie stress in de hersenen zoals gemoduleerd door enterocyte signalering.

Abstract

Het doel van dit protocol is te isoleren van oxytocine-receptor rijke hersenen kernen in de neonatale hersenen vóór en na de eerste biest voeding. De expressie van eiwitten bekend om te reageren op een metabole stress werd gemeten in de hersenen-kernen isolaten gebruikend het westelijke bevlekken. Dit werd gedaan om te beoordelen of metabole stress-geïnduceerde nutriënten insufficiëntie in het lichaam neuronale stress veroorzaakt. Wij hebben eerder aangetoond dat nutriënten insufficiëntie in pasgeborenen metabole stress in de darm lokt. Bovendien, biest oxytocine moduleert cellulaire stress respons, ontsteking, en autophagy markeringen in pasgeboren rat gut villi vóór en na de eerste diervoeders. Signalering eiwitten markeringen die is gekoppeld aan het endoplasmatisch reticulum-stress [ER chaperon bindend immunoglobuline-proteïne (BiP), eukaryote vertaling initiatie factor 2A (eIF2a), en eIF2a kinase proteïne kinase R (p-PKR)], evenals twee ontsteking-signalering eiwitten [nucleaire factor-recombination (NF-kB) en remmer recombination (IkB)], werden gemeten in pasgeboren hersenen kernen [kern van de eenzame tractus (NTS) paraventricular nucleus (PVN), supra-optische kern (zoon), cortex (CX), striatum kernen (STR), en mediale preoptic nucleus (MPO)] vóór de eerste feed (unprimed door biest) en na het begin van de verpleegkunde (primer door biest). Uitdrukking van BiP/GRP78 en p-eIF2a waren upregulated in unprimed en werden in primer NTS weefsel. NF-kB werd behouden (hoog) in het cytoplasma CX, STR en MPO overwegende dat NF-kB lager en ongewijzigd in NTS, PVN en zoon in beide voorwaarden was. De collectieve BiP en p-eIF2 bevindingen zijn consistent met een stress-respons. eIf2a was in de zoon, CX, STR en MPO phosphorylated door dsRNA afhankelijk kinase (p-PKR). Echter was in de NTS (en in mindere mate in de PVN), eIf2a phosphorylated door een ander kinase, algemene controle nonderepressible-2 kinase (GCN2). De stress-modulerende mechanismen eerder waargenomen in pasgeboren darm enterocyten lijken te worden weerspiegeld in bepaalde hersengebieden OTR-rijk. De NTS en de PVN kan gebruik maken van een mechanisme van de verschillende fosforylatie (onder voedingsstoffen tekort) vanuit andere gebieden en worden vuurvaste aan de gevolgen van nutriënten insufficiëntie. Collectief, suggereren deze gegevens dat hersenen reacties op nutriënten insufficiëntie stress worden gecompenseerd door signalering van enterocyten biest-primer.

Introduction

In tegenstelling tot ons begrip van de vroege ontwikkeling van de hersenen die zich voordoen in de loop van dagen-naar-weken postpartum, is relatief weinig bekend over de talloze dynamische veranderingen die zich voordoen in de eerste uren van het leven bij ratten. Een belangrijke uitdaging is het kleine formaat van de neonatale rat hersenen en een eis van high-tech hulpmiddelen te isoleren van de afzonderlijke hersengebieden of afzonderlijke cellen. Studies schatten vaak gene transcriptie en niet vertaling1,2, dat een stevige begrip van functionaliteitsniveaus van geactiveerde signalering moleculen niet geeft. Anderen bekijken expressie met behulp van immunohistochemistry aan referentie hersengebieden, wie niet voor de kwantificering van expressie niveau3 verstrekken doet. Geen studie tot op heden heeft de activering van de trajecten die zijn gekoppeld aan de eerste biest ratten feed in discrete hersengebieden, waarvoor snelle isolatie en offer en meting van eiwit expressie en proteïne fosforylatie met behulp van Western signalering bevlekken. Terwijl op oudere en grotere hersenen hersenen microdissection wordt uitgevoerd, hebben we een verwijzing uitvoeren van een niet-eencellige hersenen punch in de hersenen van een P0 niet geïdentificeerd. Dit document stelt een protocol voor het isoleren van beperkte regio's van de neonatale hersenen met behulp van een relatief low-tech punch techniek en een Western-blottingtechniek voor het meten van de eiwituitdrukking in relatief kleine steekproeven. Dit protocol kan worden geschikt voor onderzoeksvragen die de beoordeling van eiwit expressie en posttranslationele modificaties vereisen (bv., fosforylatie) in relatief beperkte regio's van de kleine hersenen van alle soorten, op voorwaarde dat de gebruiker kan visueel inleven in de regio van de hersenen van belang een atlas en herkenbare monumenten.

Deze techniek werd ontwikkeld om te begrijpen van de veranderingen in de hersenen als gevolg van de neonatale ratten eerste biest feed, die is rijk aan oxytocine (OT). OT is lang gekend voor haar vermogen te stimuleren van melk laat-down en uteriene contractie. Echter, OT is nu bekend dat een brede waaier van rollen te spelen bij de regulering van vele lichaamsfuncties en gedrag4. Bijvoorbeeld, OT verzet zich tegen stress en ontsteking in combinatie met adaptieve affiliërend gedrag5, vertraagt het leegmaken van de maag en intestinale transit vertraagt. OT receptoren (OTR) geconstateerd in de darmen neuronen en intestinale epitheel6,7,8. De gastro-intestinale effecten van OT zijn vooral belangrijk voor de baby tijdens de vroege postnatale periode. Bijvoorbeeld, borstvoeding wordt geassocieerd met de levering van aanzienlijke hoeveelheden OT aan de neonatale gut9,10, en uit de gegevens blijkt dat de OTR is zwaar overexpressie in duodenale villi tijdens de melk periode8zuigen.

In vitro experimenten met behulp van een gut cellijn hebben aangetoond op cellulair niveau dat oxytocine moduleert belangrijke moleculen in de stress signalering traject11,12 en een regulerende rol speelt in de vertaling van eiwitten 12. deze studies suggereren dat onderdelen van melk, met inbegrip van exogene oxytocine van de moeder, belangrijk in de reactie van de ongevouwen eiwitten bij pasgeborenen zijn te verminderen van cellulaire spanning13.

In vivo en ex vivo studies hebben aangetoond dat biest OT de cellulaire stress respons, ontsteking, en autophagy markers in pasgeboren rat gut villi moduleert. Pasgeboren enterocyten lijden aanzienlijke cellulaire stress aan hun luminal kant wanneer de darm wordt gelijktijdig blootgesteld aan microbiota van de moeder in biest14,,15 en talrijke proteïnen, met inbegrip van hormonen zoals OT9 , 10 , 16.

De effecten van OT op de hersenen geweest bestudeerde17. De OT signalering mechanismen aangetoond in de darm tijdens de vroege postnatale periode zijn echter niet in de hersenen bestudeerd. In dit document wordt een methode voor het isoleren van discrete hersenen kernen in de hersenstam neonatale rat en hypothalamus met behulp van elektroforese gebruikt profileren geïsoleerde hersengebieden. Het algemene doel van deze methode is om vast te leggen van de staat van cel signalering in hersengebieden zo dicht mogelijk bij de geboorte, vóór en na de eerste melk zuigen, in hersenweefsel met de laagste gliale/neuronale index. De reden voor de ontwikkeling van deze techniek is dat het mogelijk maakt voor de snelle isolatie van beperkte, microscopische hersengebieden in neonatale pups met een meer homogene verzameling van neuronen voor ex vivo studies met behulp van een geautomatiseerde westelijke bevlekken methodologie, aanbieden zeer consistente resultaten op relatief kleine ontleed monsters. Een tekortkoming van voorafgaande werk omvat meer bruto dissectie (hersenen segmenten of hele hersenen) en oudere dieren18,19. De hersenen van jonge pups zijn ongelooflijk dynamisch, met golven van gliale differentiatie na de geboorte. Om te kunnen studeren hersenen wijzigingen beïnvloed door de pups eerste voeding, is studeren beperkt neuronale kernen met reproduceerbare dissectie noodzakelijk.

Melk feed is meestal geanalyseerd voor de immunologische en nutritionele gevolgen daarvan voor de gezondheid of gen expressie (bijvoorbeeld in de enterocyten20,21) Overwegende dat het effect daarvan op hersengebieden tijdens de ontwikkeling van de hersenen zelden wordt bestudeerd. Het effect van melk doorvoer in de darm op hersenfunctie werd geanalyseerd met betrekking tot de darm Cholecystokinine receptoren vagale estafette aan kernen van de hersenstam, maar niet aan intracellulaire signalering trajecten22. Er is een enorme literatuur op de kwetsbaarheid van de ontwikkelende hersenen van de pasgeborene voor ondervoeding van moeders tijdens zwangerschap23, maar ook de stress en ontsteking signalen niet worden behandeld. Nog belangrijker is, is de huidige methode maakt gebruik van een fenomeen in de dag-nul rat pasgeborenen waarmee de bloed-geboren biest prikkels van vagale relay van viscerale stimuli worden geïsoleerd. Dit is de zogenaamde stress hypo-reactievermogen periode gekenmerkt door onrijpe nucleus tractus solitarius (NTS)-hypothalame circuit onmiddellijk na de geboorte24,25 , die beperkt NTS, paraventricular nucleus (PVN), en supraoptic nucleus (zoon) signalen op stimuli bloed komaf.

Deze methode is nuttig voor analyse van meerdere signaalroutes en relatief beperkt tot neuronale cellen, mits hersenweefsel wordt geoogst op postnatale dag-0 bij ratten, naast of moeders zijn aangevochten of niet door enige vorm van behandeling tijdens de zwangerschap. Nesten kunnen worden geanalyseerd voor de effecten van colostrum feed versus pre voederen signalering. Bij het vergelijken van signalen tussen hersengebieden met armen versus rijke eiwit opbrengst, kan deze methode in-capillair bepaling van totaal eiwit van de polypeptide bands in haarvaten lopen parallel aan de immuun-kwantificatie van eiwit antigenen. Deze methode kan de kwantitatieve vergelijking, met behulp van willekeurige eenheden, van de resultaten verkregen door het dezelfde antilichaam zonder standaard kwantitatieve curven en verwijzing naar totaal eiwit per capillair. Het vergelijken van resultaten die zijn verkregen door verschillende antilichamen is mogelijk alleen met behulp van kwantitatieve standaard curven.

Deze methode voor de beoordeling van bidirectionele signalering die zich voordoen tussen de darm en de hersenen en dat kan van invloed zijn functie in beide organen26toegestaan. De associatie tussen oxytocine en voedsel inname, die is uitgebreid bestudeerd in de afgelopen jaren27, ondersteunt een verband tussen verhoogde oxytocine signalering en de beschikbaarheid van nutriënten. Deze studies ondersteunen ook het omgekeerde concept die energie die tekorten zijn in combinatie met reducties in de hypothalamische oxytocine signalering.

Eerdere studies van het effect van OT op hersenactiviteit aangetoond dat ontsteking van de darm van de geïnduceerde ontlokte CFO's transcriptie in hypothalame PVN, amygdala en piriform cortex, die vuurvaste vagotomy28 was. Systemische infusie van OT met secretine daalde echter de hersenen CFO's reactie op de uitgelokt ontstekingsreactie in de darm28. Dit stelde dat het effect van exogene OT werd uitgevoerd door routes dan vagale Relais, eventueel via bloed overgedragen signalering moleculen doorgevoerd op het gebied postrema6,29.

In deze studie, werden de cellulaire stress signaalroutes die eerder in de darm hebben waargenomen beoordeeld in de hersenen. De hypothese was dat melkbestanddelen kunnen beschermen of uitstellen van het effect van ontsteking op de doorlaatbaarheid van de darm aan microbiële en andere metabolieten, en op zijn beurt, de gevolgen voor de hersenfunctie. De duidelijke antagonistische verschillen in IkB versus BiP signalering gevonden in villi, vóór en na de priming biest13, stelde dat de hersenen van pasgeborenen, nog steeds bezig, deze darm biest-geïnduceerde signalen kunnen voelen.

Signalering eiwitten markeringen gebruikt in vorige gut experimenten die gekoppeld aan het endoplasmatisch reticulum-stress zijn werden gemeten. Zij omvatten de ER chaperon BiP, vertaling initiatie factor eIF2a (die dient als een stress reactie integrator30), eIF2a kinase p-PKR, en twee ontsteking-signalering eiwitten (NF-kB en de Inhibitor van de omwenteling, IkB).

Zes hersengebieden op basis van hun vermogen in volwassenen afscheiden of reageren op OT werden gekozen. De NTS, gelegen op de bovenste medulla, is de eerste slag van de viscerale input en ontvangt directe signalering van vagale sensorische neuronen in de darm31 en eventueel bloed-geboren cytokines, toxines en hormonen via het aangrenzende gebied-postrema-32. De PVN, supraoptic nucleus (zoon), striatum kernen (STR), hersenschors (CX) en mediale preoptic nucleus (MPO) ontvangen signalering uit de darm via de NTS.

Resultaten toonden aan dat de cellulaire stressrespons gedurende de onmiddellijke postnatale periode vóór biest priming en onmiddellijk na de eerste voeding verschilt in NTS in vergelijking met de PVN en zoon. Signalering in CX, STR, en MPO verschilden van die van de PVN en zoon, als goed. De afzonderlijke beschermende functies van OT om te moduleren cel stress en ontsteking in de darm zijn waarschijnlijk gevoeld door sommige gebieden van de hersenen. Collectief, blijkt uit de gegevens dat op het cellulaire niveau, tijdens de eerste uren na de geboorte, de hersenen op de metabolische stress nutriënten insufficiëntie is gekoppeld reageert. Uit de gegevens blijkt ook dat de omvang en de richting van de effecten van de feed biest regio-afhankelijk zijn, en dat in sommige regio's ze OT effecten die zijn aangetoond eerder in de darm weerspiegelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik comités op Columbia University en de New York State psychiatrische Institute.

1. de weefsels voorbereiding

  1. Getimede zwangere ratten bij de leverancier bestellen.
  2. Volg getimede zwangere ratten door het observeren van hun groeiende buikjes in de weken na hun aankomst en vervolgens op zoek naar pups op de verwachte leverdatum door de inspectie van de kooi elke 2 h tot levering begint.
  3. Pups met een gehandschoende hand verwijderen door hun staart vóór hun eerste Voer voor unprimed pups (geen witte melk buik is herkenbaar bij het bekijken van de buik) of na de eerste feed voor primer pups (op dat moment een witte buik zal zichtbaar zijn op hun buik) zoals beschreven in de timeli ne (Figuur S1).
    Opmerking: De eerste biest-feed wordt genoemd als priming de pup; Er is dus een pup unprimed tot de eerste feed, waarna ze biest-primer zijn.
  4. Decapitate snel de unanesthetized pup met behulp van scherpe, schone chirurgische scharen.
  5. Verwijder de hersenen door het snijden van de huid de middellijn en de bovenkant van de schedel naar de neus. Vervolgens, gebruik pincet, zachtjes loerder weg het bot voor het blootstellen van de hersenen (figuur 1A) en lokaliseren van de bregma, te markeren met een pen als de bot-platen worden verwijderd (figuur 1B).
  6. Plaats snel de hele hersenen in een polymethylmethacrylaat methacrylaat hersenen schimmel bij kamertemperatuur voor coronale snijden bij kamertemperatuur (Figuur 1 c).
  7. Maakt onverwijld, 500 mm dik segmenten met behulp van een verse scheermesje. Leg de plakjes rostraal van caudal in een petrischaal te handhaven oriëntatie van secties (Figuur 2).
  8. Snel toevoegen van kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF; 1,0 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 118.6 mM NaCl, 3.0 mM KCl, 203.3 mM MgCl2-6 H2O) zonder glucose en Incubeer de segmenten voor 60 min bij 28-30 ° C, voortdurend roeren op een rondschudapparaat metabolisch en differentieel uitdaging de unprimed versus biest-primer weefsels.
  9. De kernen van de hersenen die nodig zijn om de punch met behulp van een atlas hersenen33 en anatomische bezienswaardigheden op de weefselsectie te identificeren. Plaats dit segment met de kernen van belang in een petrischaal en verplaats het naar de ontleden Microscoop.
  10. Zodra gevisualiseerd, punch snel uit 4 van 6 verschillende kernen met een grondonderzoek, selecteren de grootte om beste punch de kern betrokken programma en consequent tussen monsters (Figuur 2).
    Opmerking: Het overige segment van de hersenen krijgen nu een gat waar hersenweefsel werd verwijderd. In deze studie, weggesneden we de volgende kernen met behulp van de onderstaande coördinaten. Alle anterior/posterior (A / P) coördinaten zijn van Bregma (met uitzondering van de NTS, die met betrekking tot de Calamus Scriptorius is). Alle dorsale/ventrale (D/V) coördinaten zijn van het oppervlak van de cortex (behalve NTS, die uit het oppervlak van de medulla is). Met de volgende coördinaten bevatten A / P, mediale/laterale (M/L) en D/V in mm: 1) eenzame tract nucleus (NTS, A / P, 0,4 tot 0,8; L, ± 0,2; D/V, 0,3 (van het oppervlak van de medulla), 2) paraventricular nucleus (PVN, -0,8; ± 0,2; 0), 3) supra-optische kern (zoon,-1.1, ± 1.4; 4.3), 4) cortex (CX, gedeeltelijke cortex gebied 1, -2,8; ± 1,5; 0,6), 5) striatum kernen (STR,-0.0, ± 1.6; 1.8), en 6) mediale preoptic Nucleus (MPO, -0,6; ± 0,2; 4.2).
  11. Snel onderdompelen de geponste kernen in 0.06 mL ijskoud, eiwit extractie buffer met proteaseinhibitors en phosphatase inhibitors gedurende 60 minuten (zie stap 2.3).

2. eiwit extractie

  1. Bereid de eiwit extractie-oplossing met behulp van het eiwit lysis kit (Tabel of Materials) op de dag vóór de levering van de verwachte pup.
  2. Ontdooien (op ijs) de waterige oplossing van de bevroren (-20 ° C) van het protease en phosphatase inhibitors van de lysis buffer kit en plaats de lysis-buffermengsel en DMSO oplossing van de proteasen/phosphatases remmers op ijs.
  3. Voeg 1.85 mL lysis-buffermengsel in een schone, ijskoude 15 mL-buis. Dan, Voeg 0,1 mL van een waterige oplossing van remmers en 0,05 mL van DMSO-opgelost-remmers. Ten slotte, GLB en kort vortex de buis en houd het bij-20 ° C tot gebruik.
  4. Label 24 schone microcentrifuge buizen (0,5 mL elk) voor de lysis van de procedure. Voorgedragen 12 buizen per hersenen voor de biest-unprimed fractie (U) [6 links (L) en 6 juiste kernen van de hersenen van het (R)], en het etiket wordt gegeven overeenkomstig de kernen acroniem, kant, en voorwaarde (bv., NTS-L-U, NTS-R-U, enz.). Label de tweede groep van 12 buizen voor de monsters biest-primer.
  5. Label twee extra sets van buizen zoals gedaan in stap 2.4 voor de voorraad eiwitten extracten (met behulp van 1,5 mL Eppendorf-stijl buizen) en voor de eerste reeks van de bereiding van de monsters (met behulp van 0,5 mL buizen). Houd deze buizen in twee afzonderlijke, gelabelde bevriezing vakken (elk ontworpen voor 100 buizen). Een doos zal worden gebruikt voor de unprimed monsters en de andere voor de voorbehandelde monsters.
  6. Ontdooien van de lysis van de oplossing op het ijs op de dag dat de pups worden geleverd, en terwijl het broeden van hersenen segmenten in ACSF, aliquoot 0.06 mL lysis van de oplossing in de buizen van lysis van de procedure (uit stap 2.4) en voeg kernen stoten en incubeer in ijs voor 60 min.
  7. Centrifugeer de bebroede lysed kernen gedurende 30 min. in een gekoelde mini centrifuge op 14000 rpm (10.000 x g) en zorgvuldig gecombineerd 0.055 mL van het supernatans dat met een goed ingestelde pipet. Breng het supernatant in de vooraf gekoelde 1,5 mL voorraad buizen (uit stap 2.5) en leg ze op het ijs. Voordat de bevriezing (bij-20 ° C) de eiwit voorraad buizen, Pipetteer 0.012 mL van het supernatans dat in de 0,5 mL pre gekoelde buizen voor de eerste monsterverwerking (uit stap 2.5) en laat ze op het ijs.

3. monstervoorbereiding voor In-capillair eiwit meting

  1. Gebruik een kit en voorbereiden van de reagentia op scheiding volgens de aanwijzingen van de fabrikant. 0.003 milliliters reagens van de meester-mix toevoegen aan elk van de 12 monsters in de 0,5 mL label buizen (uit stap 2.5) op ijs waarin 0.012 mL van de eiwit-extracten.
  2. Zet de verwarming blok tot 95 ° C en Voeg 0,004 mL van het reagens bereid in stap 3.1 naar een ladder biotinyleerd moleculair-gewicht (MW) in een buis met 0,016 mL gedeïoniseerd water. Te denatureren van de ladder en monsters, plaats de buis van de ladder en de 12 monsters van extracten van de unprimed eiwitten in de warmte blok bij 95 ° C gedurende 5 min en hen bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
  3. Herhaal stap 2.0 te 3.2, van eiwit extractie naar de bereiding van de monsters, voor de kernen sloeg uit biest-primer ratten.

4. elektroforese voorbereiding

  1. Ontdooi de Biotine labeling reagens (opgeslagen in de diepvries bij-80 oC) op de Bank en bereiden het eiwit detectie kit op ijs bij 4 ° C na aanwijzingen van de fabrikant.
  2. Meng 0,15 mL luminol met 0,15 mL peroxide en laadt 0,01 mL in 25 putjes (rij E, putten 1-25) van de plaat voor de geautomatiseerde westerse machine. Laden 0.008 milliliters daar-HRP van de kit in putten D1 naar D25
  3. Laad 0,01 mL verdunningsmiddel antilichaam-oplossing in putten C1 C25 en B1.
  4. Draai de 24 EiwitSteekproeven en ladder buizen kort (2-3 seconden) in een minicentrifuge naar zwembad beneden verdampt water uit de tube caps.
  5. Laad 0.003 mL 12 unprimed monsters in putten A2 A13, 12 biest-primer monsters in putten A14 naar A25 0.003 mL en 0,005 mL van de ladder van de biotinyleerd in goed A1.
  6. Rij F leeg en laadt 0,45 mL was buffer in elk van de 5 compartimenten in elk van de 3 rijen onder rij F. Cover de plaat met de plastic deksel te vermijden van verdamping tijdens de overige procedures.
  7. Kort de ontdooide Biotine vortex labeling reagens en 0,15 mL van het reagens toe te voegen aan haar aangewezen buis; dan Voeg aan het 0,15 mL van de totale proteïne reconstitutie agent en meng ze aan homogeniteit.
  8. Verwijder de kap van de plaat en laadt 0,01 mL van agenten 1 en 2 in putten B2 naar B25. De afdekplaat en Centrifugeer het gedurende 10 minuten op 1000 x g luchtbellen verwijderen uit de verschillende oplossingen. Gebruik een lege plaat in de centrifuge voor evenwicht.

5. elektroforese

  1. Terwijl de plaat draait, een run bestand opent in de geautomatiseerde westerse machine-verbonden computer die aangeeft in de dropdown-pagina uit "bestand" om uit te voeren van een bepaling van de totale proteïne en te klikken op de respectieve plek.
  2. Aantekeningen van de monsters door goed in de computer. Verwijder vervolgens de plaat van de centrifuge verwijderen de cover en zorgvuldig afschilferen van de aluminium cover van de scheiding oplossing compartimenten.
  3. Plaats de plaat in het geautomatiseerde westerse instrument, afschilferen van de cover van het vak capillaire cartridge, plaats de cartridge in de aangewezen plaats en sluit de deur.
  4. Klik op de "Uitvoeren" knop, en wanneer souffleur van het type van de test ("total protein"), typ de naam van de monsters (bijvoorbeeld, "unprimed 2-13 en biest-primer 14-25"). Klik op "OK", en wanneer gevraagd door de geactiveerde looppasdatum en id-nummer van het beheerde bestand, maak een notitie van de tijd wanneer de termijn eindigt.
  5. Aan het eind van de run (170 min na het begin), open de deur van het instrument, verwijder de capillaire cassette en gooi het in de sharps verwijdering. Gooi de plaat in de verwijdering van biologisch materiaal.
  6. Klik op het pictogram Curven scheiding in de pagina van de analyse van het beheerde bestand en controleer of alle monsters correct hebt uitgevoerd en meerdere eiwit krommen in alle haarvaten tonen.

6. analyse van signalering eiwitten

  1. In een buis van gelabelde 1,5 mL, Voeg 0.003 mL konijn anti phospho-eIF2a (p-eIF2a) antilichaam en schorten in 0.3 mL (1:100 verdunning) in antilichaam verdunningsmiddel van de geschikte detectie kit. Dan houd het op ijs.
  2. Label een luminol buis en 0,15 mL luminol en 0,15 mL peroxide uit deze detectie module kit toevoegen en afzien van 0,01 mL in putten E1 naar E25 van een verse, geautomatiseerde westerse plaat.
  3. Afzien van 0,01 mL van de secundaire anti konijn antilichaam in putten D2 naar D25, en voeg daar-HRP 0,01 mL uit de kit aan goed D1.
  4. Afzien van 0,01 mL van het primaire antilichaam (uit stap 6.1) in putten C2 aan C25, en voeg toe van 0,01 mL verdunningsmiddel 2 oplossing van antilichaam aan putjes C1 en B1 naar B25.
  5. Laat de rij F putten leeg en vul 0,45 mL was buffer in de 5 compartimenten van 3 rijen onder de F-rij.
  6. Kort draaien de gekoelde monsters voor 3 s, en Voeg 0.003 mL van elk monster rij A in dezelfde volgorde als zij werden toegevoegd voor de bepaling van de totale proteïne, vanaf A2 tot A25. Voeg 0,005 mL van de biotinyleerd MW ladder goed A1 en de afdekplaat.
  7. Centrifugeer de plaat zoals gedaan in stap 4.8. Terwijl de plaat draait, een nieuwe run bestand (in de geautomatiseerde Western-geassocieerde software en computer) opent en geven in de dropdown-pagina uit "Bestand" om uit te voeren van een bepaling van moleculaire grootte door te klikken op de respectieve plek.
  8. In de test pagina, typt u de namen van het monster in elke capillair, dan typt u de naam van het primaire antilichaam in de toegewezen plek en het secundaire antilichaam anti-konijn eronder.
  9. Aan het einde van centrifugeren, herhaal stappen 5.3-5.5, behalve de naam gegeven aan het beheerde bestand ditmaal moet "p-eIF2a op unprimed 2 – 13 en 14-25 biest-primer".
  10. Na de scheiding van de elektroforese, Controleer het lopen bestand voor immuun-reactiviteit pieken van antigenen op grootte van 40-43 kDa. Indien MW van pieken deze grootte ontbreken, klik met de rechtermuisknop onder de curve en aangeven binnen de dropdown-lijst toe te voegen MW aan de piek, die ervoor zorgt dat de grootte en willekeurige hoeveelheid onder de curve worden vastgelegd.

7. verwerking van de resultaten

  1. Open een spreadsheet-bestand voor totale proteïne uitvoeren in de geautomatiseerde westelijke bestand uitvoeren en voorzien van een id-nummer.
  2. Open het run bestand van de bepaling van de totale eiwitten op de pagina van de analyse op de curve modus en Markeer alle de pieken in individuele haarvaten. Kopieer en plak ze in het werkblad en som van de gebieden die onder de curve van alle pieken in het gehele capillair opgenomen.
  3. Regelen in een aparte kolom, de totale hoeveelheid eiwit voor elke kolom met capillaire nummers, namen van de respectieve hersenen kernen, en de id-nummers van de beheerde bestanden.
  4. Open een werkblad voor de p-eIF2a-antigeen, en in één kolom, het oppervlak onder de kromme van elk capillaire side-by-side met haar respectieve capillaire nummer, de naam van de kern van de hersenen, en id-nummer van het beheerde bestand opnemen.
  5. De totale proteïne kolom (parallel aan de aantallen van de kromme p-eIF2a) te kopiëren naar een derde spreadsheet en berekenen van p-eIF2a:total eiwit verhoudingen in een derde kolom.
  6. Resultaten van de stappen 4 tot en met 6 voor elke kern hersenen verzamelen, schik ze in groepen van kernen en genereren een staafdiagram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representatieve bands van immunoreactivity ten opzichte van de totale proteïne blijkt dat er hersenen kernen met zeer lage geoogste eiwit. Dit vereist het gebruik van de geautomatiseerde westelijke vlek-techniek, die zeer gevoelige in vergelijking met de canonieke westelijke vlek. Deze aanpak kan worden uitgevoerd met fortyfold minder eiwit per capillair ten opzichte van de per-baan in Western blots.

Differentiele effecten van biest priming op BiP niveaus in de kernen van de hersenen

Coronale secties van rat hersenen zijn geoogst vóór de eerste biest voeding (unprimed) en na de eerste voeding (primer). Gefractioneerde monsters werden door capillaire elektroforese (op WES) en eiwitten zijn gekwantificeerd aan de hand van de kit voor in-capillair totaal eiwit kleuring (Zie Protocol). Extra immuun capillaire fractionering op de geautomatiseerde westelijke mits identificatie van de respectieve eiwit antigenen. In figuur 3A, wordt representatieve BiP eiwit expressie weergegeven in het bovenste deelvenster, met de overeenkomstige totale proteïne hieronder weergegeven. BiP is een ER chaperon-eiwit. In figuur 3B, quantitated immunoreactivities uitgereikt door staafdiagrammen ten opzichte van de overeenkomstige totale proteïne.

Binnen de unprimed weefselsteekproeven, BiP niveaus in NTS waren aanzienlijk hoger in vergelijking met alle andere regio's (p < 0,05, n = 4 kernen). Priming van gut weefsel met colostrum gehad een tegenovergestelde effect in NTS, vergeleken met verhoogde BiP in andere regio's, ten opzichte van unprimed weefsel (figuur 3B). Priming daalde BiP in NTS (figuur 3B) en had geen effect op de PVN en SOPT. Echter verhoogd priming BiP in CX, STR en MPO ten opzichte van unprimed weefsel. Deze gegevens betekent dat BiP niveaus in de verschillende kernen van de geteste hersenen anders op gut priming en dat er niet nog aantoonbare cross-talk tussen de verschillende kernen getest reageren.

Differentiele effecten van biest priming op ElF2a en p-elF2a niveaus in de kernen van de hersenen

Hersenen weefselsteekproeven werden opgesteld, geanalyseerd en gekwantificeerd zoals weergegeven in figuur 3A en 3B. Als met BiP niveaus (figuur 3B), elF2a en p-elF2a werden niveaus in NTS verheven in de unprimed staat ten opzichte van andere kernen (figuur 4B en 4 C). Zoals aangetoond met BiP niveaus, was het antwoord in NTS op priming van gut weefsel met biest tegengesteld aan die in andere kernen. Niveaus van zowel de elF2a als de p-elF2a in NTS teruggebracht ten opzichte van unprimed weefsel. In alle andere geteste kernen, priming wordt verbeterd in elF2a en p-elF2a ten opzichte van unprimed weefsel (figuur 4B en 4 C).

Fosforylering van de elF2a door kinase GCN2 in NTS en de PVN na biest priming

Hersenen weefselsteekproeven werden opgesteld, geanalyseerd en gekwantificeerd als afgebeeld in Figuur 3. Priming overleden p-PKR in PVN (χ2 p = 0,025), in tegenstelling tot in alle andere regio's waar het werd verhoogd. In tegenstelling tot de p-elF2a bevindingen (figuur 4C), niveaus van p-PKR waren laag in unprimed monsters ten opzichte van de voorbehandelde monsters in NTS (figuur 5A). Fosforylering van de elF2a wordt meestal gekatalyseerd door de kinase PKR in reactie op virussen34 en OT in de darm, zoals eerder bewezen11. Echter, het feit dat de p-PKR niveaus zeer laag in unprimed versus primer NTS (ten opzichte van andere kernen waren, figuur 5A) sterk suggereert dat een ander kinase moet worden betrokken bij de phosphorylating elF2a (figuur 4C). Dienovereenkomstig, GCN2 niveaus werden getest in de NTS en de PVN want het is ook een bekende kinase elF2a35. Niveaus van p-GCN2 (actief formulier) waren hoger in unprimed monsters in vergelijking met voorbehandelde monsters in NTS PVN (figuur 5B) en GCN2 (inactieve vorm), ten opzichte van p-GCN2, werd omgekeerd uitgedrukt in PVN (figuur 5C). pGCN2 in NTS (figuur 5C) werd omgekeerd tot pPKR (figuur 5A) uitgedrukt in zowel unprimed als primer NTS. In primer weefsel, p-eIF2a was aanzienlijk lager in NTS dan in alle andere hersengebieden [PVN (p < 0,01), zoon (p < 0,01) en CX (p < 0,01) MPO (p = 0,02)]. Dit geeft aan dat pGCN2, in plaats van pPKR, was verantwoordelijk voor de remming van de eIF2 in de NTS.

Biest priming remt NF-kB in CX, STR en MPO

Figuur 6A toont dat IkB niveaus significant hoger in de zoon waren unprimed monsters vs primer monsters. IkB niveaus in zoon, CX, STR en MPO trended hoger in dezelfde richting. In Figuur 6 cwaren NF-kB niveaus in CX, STR en MPO aanzienlijk hoger in primer versus unprimed weefsel. NF-kB niveaus waren echter aanzienlijk lager in primer NTS weefsel, die suggereert dat colostrum een duidelijke anti-inflammatoire effect gehad op deze regio van de hersenen. Cytosolische NF-kB was hoger (bewaarde) in unprimed NTS monsters, terwijl de Inhibitor van de omwenteling IkB laag en ongewijzigd in voorbehandelde monsters. Dit suggereert dat een duidelijke anti-inflammatoire mechanisme is het reguleren van NF-kB in NTS. Dit effect van de stress nutriënten insufficiëntie strookt met de huidige bevindingen die stress markeringen BiP en p-eIF2a worden geregeld door de aanwezigheid van biest priming (figuren 3 en 4, respectievelijk), ook weergegeven in vorige BiP en p-elF2a bevindingen10. De reden voor de duidelijke reactie van IkB en NF-kB in NTS vergeleken met CX, STR en MPO is nog niet volledig begrepen. Het is echter consistent zijn met de opmerking die de NTS, die signalen van de darm naar de hersenen stuurt, een cruciale rol spelen kunnen in het unieke en tegengesteld te reageren tegenover andere hersengebieden ten opzichte van perifere ontsteking36. Niveaus van IkB in CX, STR en MPO waren laag (figuur 6A), in vergelijking met de hoge niveaus van NF-kB in dezelfde gebieden (Figuur 6 c). Hoewel deze bevinding blijkbaar de veronderstelling weerspreekt dat IkB is bindend en behoud van NFkB in het cytosol, verschillende berekening van de gegevens die combineert en vergelijkt alle voorbehandelde monsters in CX, STR en MPO met behulp van regressie analyse toont dat NF-kB zeer correleert met IkB (p < 0,0001, n = 24)

Figure 1
Figuur 1: ontleed neonatale rat hersenen. (A) de ontleed hersenen wordt weergegeven met de beenderen verwijderd rostraal van bregma. (B) de hersenen wordt weergegeven nadat een lijn heeft getrokken op bregma, waarna de resterende bot platen werden verwijderd. (C) de hersenen wordt in een mal van polymethylmethacrylaat methacrylaat hersenen net voordat het wordt gesneden met een scheermesje. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Brain segmenten gerangschikt van rostraal van caudal met stoten (rode cirkels). Afkortingen: CX: cortex, Pariëtale kwab; MPO: mediale preoptic gebied; NTS: nucleus tractus eenzaten; PVN: paraventricular kern; ZOON: supraoptic kern; en STR: striatum. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: BiP/GRP78 reactie in NTS is omgekeerd met die van andere kernen. (A) vertegenwoordiger BiP eiwituitdrukking in het bovenste deelvenster ten opzichte van de totale proteïne in het deelvenster hieronder gepresenteerd. Merk op dat de dichtheid van de totale proteïne in de verschillende haarvaten heterogene, en deze worden gebruikt om het egaliseren van de respectieve expressie van het BiP per eiwit in deelvenster B. (B) getoond is de gemiddelde BiP ten opzichte van de totale proteïne in de hersenen kernen van unprimed monsters ( blauwe) versus biest-primer monsters (bruin). Sterretjes van respectieve kleuren aanwijzen significante verschillen (p < 0,05, n = 4 kernen) tussen BiP in NTS versus BiP in de andere kernen. BiP expressie in unprimed versus voorbehandelde monsters in NTS worden aanzienlijk omgekeerd aan degenen in STR (χ2 p = 0.028, n = 4). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: actieve en inactieve eIF2a (p-eIF2a) reactie op biest priming versus unprimed monsters in NTS omgekeerd met die van andere kernen. (A) representatieve eIF2a en p-eIF2a eiwit expressies worden weergegeven in de bovenste panelen. De totale proteïne rijstroken worden gepresenteerd in het onderste deelvenster. (B) getoond is de gemiddelde eIF2a van 4 monsters uitgedrukt ten opzichte van totale proteïne (van lagere paneel A) in de hersenen kernen van unprimed monsters (blauw) versus biest-primer monsters (bruin), en (C) de inactieve vorm van eIF2a (p-eIF2a). Sterretjes van respectieve kleuren aanwijzen significante verschillen (p < 0,05, n = 4 kernen) tussen beide vormen van de eIF2a in NTS versus respectieve niveaus in de andere kernen. Actieve eIF2a expressie in unprimed versus voorbehandelde monsters in NTS worden aanzienlijk omgekeerd aan degenen in CX, STR en MPO (χ2 p < 0.05 versus alle drie kernen, n = 4). Foutbalken vertegenwoordigen standaardfout. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: NTS spreekt eIF2a kinase p-GCN2 in overeenstemming met de p-eIF2 niveau en omgekeerd naar p-PKR niveau. (A) het niveau van de p-PKR (geactiveerde dsRNA kinase van eIF2a) wordt uitgedrukt unprimed versus biest-primer NTS omgekeerd op 1) het niveau van de p-PKR in PVN (χ2 p = 0,025) en 2) de verwachte gericht substraat eIF2a na haar fosforylatie (to p-eIF2a, 2C van de figuur). Merk op dat het patroon van p-PKR in zoon, CX, STR en MPO van unprimed versus biest-primer monsters de respectieve patronen van p-eIF2a van figuur 2C past. (B) actieve eIF2a kinase (p-GCN2) in unprimed versus primer NTS monsters volgt een soortgelijk patroon van p-eIF2a expressie van figuur 2C en een omgekeerde patroon van pPRK expressie uit figuur 3A (χ2 p = 0.028). C = gemiddelde niveaus van inactieve GCN2. Foutbalken vertegenwoordigen standaardfout. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: cytoplasmatische uitdrukking van NF-kB en IkB in hersenen kernen van unprimed en biest-primer gut monsters. (A) gemiddelde cytoplasmatische expressie van IkB ten opzichte van de totale proteïne (vanuit deelvenster C) op de aangegeven hersenen kernen. (B) vertegenwoordiger cytoplasmatische bands van IkB eiwit worden gepresenteerd in het bovenste deelvenster en de totale proteïne dichtheid in de respectieve rijstroken in het onderste deelvenster. (C) gemiddelde cytoplasmatische expressie van NF-kB ten opzichte van totale proteïne (van deelvenster D) op aangegeven hersenen kernen. (D) de representatieve cytoplasmatische bands van NF-kB bands worden gepresenteerd in het bovenste deelvenster en de totale cytoplasmatische eiwit dichtheid in de respectieve rijstroken in het onderste deelvenster. Gekleurde sterretjes aanwijzen significante verschillen tussen de aangegeven monsters (p < 0,05, n = 4). Merk op dat cytoplasmatische NF-kB niveaus hoger in biest-primer CX STR en MPO dan in hypothalamische kernen NTS, PVN en zoon oneens met de niveaus van NF-kB-remmer (IkB). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: schematische vergelijking hypothetische OT signalering regio biest-primer gut en hersenen. (A) Colostrum OT in de enterocyten activeert de receptor via directe interactie met de OTR, vermindering van ontsteking via verhoogde IkB downstream signalering. Eiwit vertaling wordt geremd door het verhogen van de p-PKR, die elF2a activiteit via fosforylering vermindert. Homeostase is hersteld via verhoogde BiP gen expressie13,37. (B) Neuronal of bloedsomloop OT activeert de receptor in de CS, STR en MPO gebieden van de hersenen, downregulating ontsteking en eiwit vertaling via de dezelfde moleculen als de darm (zie paneel A). (C) de hypothetische effecten van biest priming NTS regio van de hersenen te onderscheiden en tegenover degenen in panelen A en B. GCN2, die gevoelig voor aminozuur aanbod is, zowel eIF2a als eiwit vertaling verhoogt. Op hetzelfde moment toestaan lage niveaus van IkB NF-kB voor het invoeren van de kern en ontsteking veroorzaken. Merk op dat BiP ook handelt om te herstellen van de homeostase in de darm en in de NTS in de hersenen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Supplementary Figure
Aanvullende figuur 1: schematische tonen de protocol-tijdlijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een techniek voor microdissection van discrete, OTR-rijke kernen van de hersenen in de neonatale rat hersenen wordt gepresenteerd in deze white paper. Het is goed herkend dat neuronen zijn zeer gespecialiseerd, zelfs binnen goed gekarakteriseerd kernen in de hersenen. Deze zeer reproduceerbaar aanpak te isoleren van de specifieke OTR-rijke kernen stelt gebruikers robuuste hypothese te testen. Met behulp van geautomatiseerde westelijke bevlekken, werden de samenhang en de reproduceerbaarheid van de resultaten verder verbeterd. Terwijl een beperking van deze techniek bescheiden hersenen punch variabiliteit blijft; Deze techniek is een voorschot opzichte van eencellige, hele hersenen of hersenen segment benaderingen. Eencellige benaderingen worden bemoeilijkt door het verstrekken van zeer beperkt module schoten. Met het hele brein, kunnen alle bevindingen worden verdund indien het effect beperkt tot een regio van de hersenen of de neuronale subtype is. Benaderingen van de slice van de hersenen zonder microdissection kunnen leiden tot diepe variabiliteit in resultaten binnen slechts micron in een segment, die met name problematisch voor de hypothalamus in deze studie is, vanwege het strakke clustering van verschillende kernen. Met behulp van een gestandaardiseerde punch en de hulp van een Microscoop, werd de variabiliteit in eiwit metingen verminderd.

Er zijn verschillende kritische stappen binnen dit protocol. Deze omvatten aanhankelijkheid aan de timing van weefsel oogst met betrekking tot de eerste feed, met behulp van een minimale hoeveelheid eiwit extractie buffer, incubatie van hersenen segmenten in ACSF zodat moleculaire remmers of stimulerende middelen mogen worden gebruikt, en het gebruik van een gevoelige immuun-elektroforetische apparaat. Mogelijke wijzigingen omvatten de keuze van reagentia voor incubatie en de duur van incubatie en uitbreiding van het moment van unprimed honger om te vergelijken hersenen tijde gelijkwaardig. Belangrijke beperkingen omvatten de aanwezigheid van sommige non-neuronale cellen (zelfs in deze zeer vroege neonatale periode) en een beperkt aantal monsters dat kan worden bereid uit een nest van pasgeborenen in één dag. Deze aanpak is bovendien volledig afhankelijk van wanneer de pups zijn geboren. Met betrekking tot de bestaande methoden, genexpressie in de hersenen op deze leeftijd is meestal en meer gemakshalve beoordeeld op het transcriptional niveau. Echter voor cel signalering van analyse, is de aanpak van de proteomic uitgevoerd door core opslagruimte apparatuur duurder dan de desktop automatische instrumenten. De conventionele westelijke vlek-methode vereist veel meer eiwit, duurt enkele dagen in beslag, en bestaat uit verschillende stappen van de manipulatie door de technische mankracht. Deze geautomatiseerde aanpak vereist 0.8 µg eiwit per capillair, zodra geladen in het instrument al de stappen worden uitgevoerd zonder menselijke handen inmenging en duurt 2 uur en 50 minuten te voltooien de run. Deze techniek kan worden gebruikt voor het bestuderen van de ontwikkeling van de onmiddellijke postnatale hersenen in ratten en brede waaier van genetisch gemanipuleerde Muismodellen.

Met deze techniek kan werden de effecten van OT op cellulair niveau, speciaal in de zeer kritische periode tussen geboorte- en voedermethoden, onderzocht als de OTR maximaal in het epitheel8 uitgedrukt is. De effecten van OT op cel signalering van moleculen in de cellen van de darm, zowel in een cel lijn37 en in vivo13, werden eerder gedemonstreerd. In de huidige studie, werden de effecten waargenomen in de darm cellen in hersengebieden rijk aan OTR beoordeeld. De uitdrukking van BiP/GRP78 en p-eIF2a was upregulated in unprimed (in overeenstemming met een verwachte reactie op spanning) en werden in primer NTS weefsel (in overeenstemming met een verzwakte reactie op spanning), overwegende dat NF-kB hoog en stabiel in beide voorwaarden was 38. expressies van BiP en NF-kB waren hetzelfde in de andere geteste regio's in zowel unprimed als primer voorwaarden. eIf2a was in de zoon, CX, STR en MPO phosphorylated door dsRNA afhankelijk kinase (pPKR). Echter was in de NTS, en in mindere mate in de PVN, eIf2a phosphorylated door een ander kinase, algemene controle nonderepressible-2 kinase (GCN2). Een schematische beeltenis hypothetische verschillen in signalering in de hersenen en darm ontlokte bij biest blootstelling wordt gepresenteerd in Figuur 7.

Dit microdissection techniek maakt het mogelijk om te testen van hypothesen aan de gevolgen van de eerste biest gerelateerde waardplanten stressgerelateerde signalering in discrete OTR-rijke kernen in de neonatale hersenen. Deze gegevens stellen voor dat de stress modulerende mechanismen eerder waargenomen in pasgeboren darm enterocyten worden weerspiegeld in specifieke hersengebieden rijk aan OTR, zoals blijkt uit de verhoogde cytosolische eigendomsvoorbehoud NFKB (PVN, zoon CX STR en MPO). Resultaten wijzen ook erop dat NTS en de PVN een mechanisme van de verschillende fosforylering van de andere regio's die mogelijk aan de gevolgen van nutriënten insufficiëntie vuurvaste gebruiken. Collectief, blijkt uit de gegevens dat cel signalering in de hersenen verbonden aan nutriënten en hormonale insufficiëntie tijdens de eerste uren volgende geboorte is vergelijkbaar met cel signalering in de darm onder dezelfde voorwaarden. Deze gegevens ondersteunt het belang van moedermelk op het moment van geboorte voor stress modulatie in zowel de darm en de hersenen. Deze resultaten onderstrepen de noodzaak voor verder onderzoek van de gevolgen van colostrum op de hersenfunctie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Manon Ranger en Alexandra Schulz voor hun hulp bij de voorbereiding van dit protocol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford solution Bio Rad
Protein lysis kit Protein simple CBS403 Bicine/CHAPS
WES kits Protein simple WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a Cell Signaling technology SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR Cell Signaling technology 2103
Rabbit anti-phospho-PKR Millipore Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR Cell Signaling technology 12297
rabbit mAb anti-GAPDH Cell Signaling technology 2118
mouse mAb anti-phospho-IKB Cell Signaling technology 9246
mouse mAb anti-IKB Cell Signaling technology 4814
rabbit anti-BiP Cell Signaling technology 3183
Rabbit anti GCN2 Cell Signaling technology 3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2 BIORBYT T899
pregnant Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories
Punch device WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).
  2. Okabe, A., et al. Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex. Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).
  3. Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain. Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).
  4. Carter, C. S. Oxytocin and Human Evolution. Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).
  5. Sippel, L. M., et al. Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities. Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).
  6. Agnati, L. F., et al. Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine". Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).
  7. Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice. American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).
  8. Welch, M. G., et al. Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium. Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).
  9. Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin. Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).
  10. Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis. Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).
  11. Klein, B. Y., et al. Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells. Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).
  12. Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut. Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).
  13. Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi. Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).
  14. Donnet-Hughes, A., et al. Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education. Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).
  15. Perez, P. F., et al. Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells? Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).
  16. Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. Concentrations and origin of oxytocin in breast milk. Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).
  17. Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol. Systematic Reviews. 5 (1), 205 (2016).
  18. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).
  19. Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain. Frontiers in Neuroscience. 10, 504 (2016).
  20. Hansson, J., et al. Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development. Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).
  21. Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period. Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).
  22. Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits. Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).
  23. Johannes, G., Sarnow, P. Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites. RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).
  24. Rinaman, L. Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).
  25. Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness. Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).
  26. Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality. Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70 (2013).
  27. Blevins, J. E., Ho, J. M. Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).
  28. Welch, M. G., et al. Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons. Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654 (2010).
  29. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  30. Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases. Scientific Reports. 6, 32886 (2016).
  31. Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts. Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).
  32. Shapiro, R. E., Miselis, R. R. The central neural connections of the area postrema of the rat. Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).
  33. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1997).
  34. Nayak, R., Pintel, D. J. Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA. Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).
  35. Zaborske, J. M., et al. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).
  36. Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).
  37. Klein, B. Y., et al. Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).
  38. Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. NF-kappaB in the nervous system. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271 (2009).

Tags

Immunologie en infecties probleem 141 nutriënten insufficiëntie nucleus tractus solitarius (NTS) stress respons algemene controle nonderepressible 2 (GCN2) nucleaire factor-kB (NF-kB) eukaryote vertaling initiatie factor 2A (eIF2a)
Beoordeling van cellulaire Stress en ontsteking in Discrete oxytocine-afscheidende kernen van de hersenen in de neonatale Rat vóór en na de eerste biest voeding
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klein, B. Y., Tamir, H., Anwar, M.,… More

Klein, B. Y., Tamir, H., Anwar, M., Ludwig, R. J., Kaidbey, J. H., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding. J. Vis. Exp. (141), e58341, doi:10.3791/58341 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter