Ex Vivo Billeddannelse af celle-specifikke Calcium signalerer på den tredelte Synapse mus membran

Summary

Her præsenterer vi en protokol til billede calcium signalering i populationer af enkelte celletyper på murine neuromuskulære junction.

Abstract

Den elektriske aktivitet i cellerne i væv kan overvåges af elektrofysiologiske teknikker, men disse er normalt begrænset til analyse af individuelle celler. Da en forøgelse af intracellulære calcium (Ca^{2 +}) i cytosol ofte opstår på grund af den elektriske aktivitet, eller som svar på et utal af andre stimuli, denne proces kan blive overvåget af fyldt billeddannelse af celler med fluorescerende calcium-følsomme farvestoffer.  Det er imidlertid vanskeligt at billede dette svar i en enkelt celletype inden for hele væv, fordi disse farvestoffer er taget af alle celletyper i vævet. I modsætning hertil er genetisk kodet calcium indikatorer (GECIs) kan udtrykkes ved en enkelt celletype og fluorescerer reaktion på en stigning af intracellulære Ca^{2 +}, dermed tillade billeddannelse af Ca^{2 +} signalering i hele populationer af enkelte celletyper. Her, vi anvender brug af GECIs GCaMP3/6 til musen neuromuskulære junction, en treparts synapse mellem motoriske neuroner, skeletmuskulatur og terminal/perisynaptic Schwann celler. Vi påvise nytten af denne teknik i klassiske ex vivo væv præparater. Ved hjælp af en optisk splitter, udføre vi dual-bølgelængde billeddannelse af dynamiske Ca^{2 +} signaler og en statisk label af den neuromuskulære junction (NMJ) i en tilgang, der nemt kunne tilpasses til at overvåge to celle-specifikke GECI eller genetisk kodet spænding indikatorer (GEVI) samtidigt. Endelig vil diskutere vi rutiner bruges til at indfange rumlige maps af fluorescens intensitet. Sammen, kan disse optiske, transgene og analytiske teknikker anvendes til at studere den biologiske aktivitet i særskilte celle delpopulationer på NMJ i en lang række sammenhænge.

Introduction

NMJ, ligesom alle synapser, er sammensat af tre elementer: et præsynaptiske terminal afledt af en neuron, en postsynaptiske neuron/effektor celler, og en perisynaptic glial celler^1,2. Mens de grundlæggende aspekter af synaptisk transmission blev først demonstreret på denne synapse³, forbliver mange aspekter af denne proces ukendt, delvis på grund af udtryk for de samme molekyler af de forskellige cellulære elementer i denne synapse. For eksempel, udtrykkes receptorer for både purin adenin nukleotid ATP og acetylkolin (ACh), som er co udgivet af motor neuroner på de hvirveldyr NMJ, ved muskel, Schwann celler og motoriske neuroner, dermed komplicerer fortolkningen af nogen funktionelle virkninger af disse stoffer (fx, senderen frigivelse eller svar, muskel kraft generation)⁴. Desuden, selvom de tredelte komponenter af NMJ er enkel sammenlignet med eksempelvis neuroner i det centrale nervesystem, som ofte udviser flere synaptic indgange, om motoriske neuroner, muskelceller eller Schwann celler varierer i respons på stimuli baseret på deres iboende heterogenitet (f.eks.embryonale afledning, fiber subtype, morfologi) er uklart. For at løse alle disse spørgsmål, ville det være en fordel at samtidig spore svar af mange celler i én synaptic element, samt spor, på samme tid, sådan et svar i en af de andre separate elementer. Konventionelle strategier ved hjælp af kemiske farvestoffer til at måle calcium signalerer ikke kan nå disse to mål, fordi bad-anvendt farvestof er taget af flere celletyper efter ansøgning til væv og intracellulært indlæst farvestof kan kun bruges til at visualisere individuelle eller små grupper af celler. Her udnytter Transgene mus at udtrykke GECIs designet til at måle celle-specifikke calcium signalering, sammen med specifikke billedbehandling og software værktøjer⁵, vi viser først af disse to overordnede mål og diskutere hvordan tilføjelsen af nye transgene værktøjer vil bidrage til at nå andet. Denne teknik vil være nyttig for alle interesserede i at spore calcium dynamics eller andre cellulær signalering begivenheder observerbare gennem gen-kodet optiske sensorer i flere cellepopulationer på samme tid.

Protocol

Husdyrhold og eksperimenter blev udført i overensstemmelse med de nationale institutter sundhed Guide for pasning og anvendelse af forsøgsdyr og IACUC ved University of Nevada.

1. forberedelse af membraner og Phrenic nerver fra Transgene mus

1. Køb Transgene mus og oligonukleotid primere til genotype disse mus.
   Bemærk: Primere er angivet på siden "Information" for hver af disse mus.
   1. Yngle en 3 til 6 måneder gammel mus udtrykker én kopi af relevante transgene/knock-i Cre-driver allel og nul kopier af den betingede GCaMP3/6 allel med en anden mus i samme aldersgruppe at udtrykke en eller to kopier af betinget GCaMP3 / 6 allel og nul kopier af Cre-driver-allelen.
   2. Genotype unger og mærke dem som både Cre og betinget GCaMP3/6 alleler – disse vil fremover hedde dobbelt-Transgene mus (f.eks. Myf5-Cre, betingede GCaMP3)⁶.
      Bemærk: Denne måde, alle data vil stamme fra mus udtrykker én kopi af både Cre og betinget GCaMP3/6 alleler. Dette er især vigtigt, når du tilføjer i andre mutant-mus (fx, knockouts) til disse Kors.
2. Når de dobbelt-Transgene mus er af passende alder (fx, postnatal dag 0 eller 5 [P0 eller P5] eller voksen), aflive mus af hugger dem med en saks (for musene yngre end P10) eller ved at placere dem i en isofluran indånding kammer — når de er ikke længere reagerer på klemme halen med et par pincet, de er klar til offer.
3. Ofre dyret ved halshugning med en saks.
4. Paa tvaers sektion på tværs af hele dyret lige under leveren og lige over hjertet og lungerne med iridectomy saks.
5. Dissekere væk leveren, hjertet og lungerne, være omhyggelig med at opretholde en længde af phrenic nerve, der er tilstrækkelig lang til at blive trukket ind i en suge elektrode (dvs., 1-2 cm).
   Bemærk: Den venstre phrenic nerve kan identificeres som et hvidt stykke væv, der træder den mediale del af venstre mellemgulvet. Det skal ikke skæres, når du fjerner lungerne. Lige phrenic nerve kører i et stykke af fascia, der også indeholder den overlegne vena cava og er tyndere og hvidere end vena cava. Sammen, trænger de begge lige mediale mellemgulvet.
6. Yderligere fjerne brystkassen og rygsøjle, med undtagelse af den tynde højderykken omkring mellemgulvet.
7. Placer mellemgulvet og phrenic nerve prøven i et mikrofuge rør med Krebs-Ringer løsning med 1 µg/mL 594-αBTX i 10 min. i mørke.
   Bemærk: Denne koncentration af 594-αBTX etiketter ACh receptorer (AChRs) uden at blokere deres funktion (personlige observation).

2. stimulation og optagelse af muskel handling potentialer

1. Bruger minutien stifter, immobilisere mellemgulvet Fastgør det op på en 6-cm parabol belagt med silikone dielektrisk gel og fyldt med ~ 8 mL af iltet Krebs-Ringer og placere den på mikroskop-scenen. Perfuse membran med flere Krebs-Ringer løsning (8 mL/min) i 30 min.
   Bemærk: Dette skylninger den ubundne 594-αBTX, som afbalanceres vævet efter dissektion.
2. Gøre en suge elektrode efter etablerede metoder⁷.
   1. På 4 X forstørrelse, ved hjælp af en micromanipulator, flytte den suge elektrode over den venstre phrenic nerve og anvende suge ved at trække tønden af en 5-mL sprøjte forbindelse til de rør, der er knyttet til den suge elektrode.
      Bemærk: Når med held trukket ind i den suge elektrode, phrenic nerve er stram. Tænd stimulatoren og stimulere den phrenic nerve ved at vende manuelt Skift 1 x.
   2. Sikre at mellemgulvet kontrakter som svar på 1-Hz stimulation af visuelt undersøge det med brightfield belysning. Hvis ikke, justere spændingen ved at dreje spændingen knop gradvist for at opnå et supramaximal pulse, som kan verificeres ved en visuel undersøgelse af muskelsammentrækning. Hvis den stadig ikke synlig, blæse ud nerven med sprøjten og forsøge at tegne det i igen ved at anvende suge.
3. Slukke perfusion og tilføje muskel-specifikke myosin hæmmer BHC⁶ eller spænding-gated natrium kanalen antagonist µ-conotoxin⁸ til en endelig koncentration på 100 µM.
   1. For at gøre 100 µM BHC, afpipetteres 4 µL af 200 mM bestand i DMSO og predilute det i 1 mL af Krebs-Ringer løsning.
   2. Fjerne 1 mL af Krebs-Ringer løsning fra fadet.
   3. Tilføj prediluted BHC til fadet.
      Bemærk: Denne predilution hjælper med at forhindre induktion af ufortyndet DMSO af en ikke-forbigående fluorescerende svar i GCaMP3-udtrykker celler.
   4. Vente 30 minutter og derefter tænde perfusion af friske Krebs-Ringer løsning for en anden 20-30 min.
4. Forberede optagelse elektrode.
   1. Iført handsker, placere en filamented borsilikatglas med en ydre diameter (OD) på 1 mm og en indre diameter (ID) af 0,4 mm i en mikropipette aftrækker og stramme ringer for at klemme den ind i position. Luk puller.
   2. Ved hjælp af en P-97 aftrækker, programmere følgende indstilling: varme på 900, pull på 120, hastighed på 75, tid på 250, pres på 500 og ikke ekstra loops.
      Bemærk: Resistance (R) måles ved hjælp af software kontrol af forstærkeren: data erhvervelse software bekræfter resistens ved at løse formlen V = IR. Software controller passerer en kendt strøm (I) (typisk 1 nA) gennem elektrode og måler ændringen i spænding (V), således at vi kan løse for R.
   3. Embryonale membraner, sikre at modstanden er nær 60 MΩ, og for ældre membraner, 10-20 MΩ. Indlæse optagelse elektrode med 3 M KCl.
5. Ved 10 X forstørrelse, lavere elektroden i muskel, ved hjælp af en anden micromanipulator på den modsatte side af scenen som en stimulerende elektrode.
6. Brug af elektrofysiologiske data erhvervelse software, vent indtil den hvilende membran potentiale ændres fra 0 til-65 mV eller nedenfor.
7. Stimulere på 1 Hz og kontrollere tilstedeværelsen af en muskel handling potentiale ved at kontrollere for et stort potentiale, der udviser en beskeden overskridelse (potentiale, der stiger til over 0 mV når det starter ved-65 mV eller nedenfor). Ikke at forveksle stimulation artefakt med en aktionspotentialet.
   Bemærk: Potentialer er betydeligt længere varighed (~ 5 ms) end stimulation artefakter.

3. billeddannelse af fluorescens af prøven

1. Ved 20 X forstørrelse, finde endplate band på center for muskel ved at kigge efter 594-αBTX-mærket NMJs under grøn/gul lys excitation (550 nm). Skifte til den blå lys excitation (470 nm) til billedet Ca^{2 +} svar i muskel, motor neuron eller Schwann celler.
2. Hvis det ønskes, oprette image splitter med bandpass filtre og en dichroic single-edge filter til dual-bølgelængde billeddannelse.
3. For at beregne den maksimal fluorescens (Fmax) udstillet ved GCaMP3/6-udtrykker væv, skal du tilføje 12 µL af 3 M kaliumchlorid (KCl) til mellemgulvet præparater⁶.
   1. Udføre eksperimenter med lysstyrken baren på opslag tabel bar sæt til 110% af det niveau, hvor GCaMP3/6-udtrykker væv udstiller mætning på 20 X forstørrelse, uden binning svar på KCl.
4. Registrere ved 20 frames per sekund gå ikke glip af nogen hurtig begivenheder.
5. Stimulere med 1-45 s på 20-40 Hz nerve stimulation ved at levere et tog af impulser ved hjælp af de suge elektrode eller tilføje farmakologiske agonister ved Bad ansøgning eller perfusion og indsamle dynamisk fluorescerende Ca^{2 +} svar i én celle undertype sammen med statisk 594-αBTX NMJ signal.
   Bemærk: Hvis væv-specifikke rød eller far-red GECI eller GEVI mus bliver tilgængelige til brug på NMJ, de kan bruges til at indsamle to dynamiske signaler afspejler to forskellige cellulære elementer på NMJ.
6. Når de billeddiagnostiske eller elektrofysiologiske eksperimenter er færdig fordi har opnået de ønskede resultater, perfuse vand gennem linjerne perfusion og suge vand 2 x - 3 x gennem den suge elektrode til at sikre, at salte ikke bygge.

4. eksport og analyse af Data fra en standardafvigelse kort af fluorescens intensitet (SD_iu16)

1. Optag billedsekvenser registreret som 16-bit TIFF stakke og indlæse dem i den ønskede billeddiagnostiske data analysesystem til analyse.
2. I den software 8d filmenuen, Vælg billedstak af interesse og klik for at indlæse.
   1. Når først videoen indlæser, scanne gennem tid til at identificere et afsnit, der har ingen cellulære fluorescerende aktivitet.
      Bemærk: Denne region vil blive brugt til at oprette en baggrund prøve.
   2. Holde Skift nede og klikke for at tegne en region af interesse (ROI) afkrydsningsfeltet i området betegnes prøven baggrundsområdet.
   3. Efter oprettelse af boksen, skal du trykke på mellemrumstasten til at generere et plot af baggrund aktivitet ændring.
   4. Højreklik på sporet og vælge indstillingen assorterede at præsentere mulighed for at Dumpe ROI som tekst til at gøre spor som en xy koordinere tekstfil.
3. Flytte tilbage til video af interesse, scan igen for at identificere regionen tid hvor aktiviteten af interesse forekommende.
   1. Brug den midterste museknap, Vælg denne gang region i boksen gule tid.
   2. Højreklik på videoen og vælg Stak OPS og derefter Stat kort option 5.
      Bemærk: Dette vil generere en standardafvigelse kort (SD kort) i den venstre rude.
   3. Klik på SD-kort og derefter presse [ ] nøglen 19 x gælde passende farve varmekort.
   4. Højreklik på SD kortet, og vælg STM indlæse og gemme, som vil præsentere mulighed for gemme stm som tiff at gemme SD kort.
   5. Derefter, tryk på [ nøglen 19 x at vende tilbage til et gråtone farve kort.
   6. Tryk på C og derefter D at opdrage tæthed kortlægningsværktøjer. Brug venstre museknap og center museknap, justere tærsklen til at omfatte alle fluorescerende aktivitet vist i SD kort.
   7. Tryk på C for at lukke tæthed værktøjer samtidig med at de angivne indstillinger for tærskelværdi.
   8. Højreklik på SD-kort og vælg STM partikler og derefter Finde PTCLS.
      Bemærk: Dette vil identificere individuelle celler, der udtrykker fluorescerende aktivitet.
   9. Højreklik på SD-kort igen og vælg Opret partikel ROIs.
      Bemærk: Dette vil indsætte de markerede celler på den originale video af interesse.
   10. Mens du holder Shift, Højreklik på en af de nu identificeret partikel ROIs på den originale video.
   11. Vælg ROI markør og foranstaltning Int i ROI.
       Bemærk: Dette vil generere enkelte fluorescerende aktivitet parceller for hver identificerede ROI i videoen af interesse. Disse kan gemmes ved at højreklikke på en af disse og vælge Assorted, efterfulgt af Dump ROI som tekst.
4. For detaljerede logik bag disse operationer, se venligst den kilde kode fil⁹.

Representative Results

Flere eksempler af fluorescens intensitet ændringer, medieret af stigninger af intracellulære Ca^{2 +} inden for definerede celletyper af NMJ, Vis nytten af denne fremgangsmåde. Disse resultater præsenteres som rumlige fluorescens intensitet kort, som giver placeringen af besvarende celler samt intensiteten af deres svar, således at til vurdering af hvor mange celler reagerer og hvor meget hver celle reagerer på en bestemt stimulus. For eksempel som vist i figur 1, tog vi videoer af Ca^{2 +} svar i en population af terminal/perisynaptic Schwann celler (TPSCs) på NMJs membran af en P7 Wnt1-Cre; betinget GCaMP3-udtryk for mus i svar til stimulering af phrenic nerve og identificeret delpopulationer af de besvarende celler af rumlige fluorescens intensitet kort. Disse kort af fluorescens intensitet er præsenteret som varme kort og farvekodede efter en brand farve opslagstabel (brand CLUT). Vi indspillet disse videoer med og uden at opdele billedet og samtidig se klynger af α-BTX-mærket AChRs midt i mellemgulvet (videoer 1 og 2), en tilgang, der kunne nemt tilpasses til fange dynamisk GECI eller GEVI svar fra to særskilte celle typer, forudsat at hver af dem udviser ikke-overlappende excitation og emission spektre.

I figur 2, vi udførte samme nerve stimulation eksperimentet på mellemgulvet af en P4 Myf5-Cre; betinget GCaMP3-udtryk for mus og afbildet Ca^{2 +} svar i muskelcellerne. Interessant, når vi har brugt enten myosin blocker BHC eller i skelet muskler-specifikke spænding-gated natrium kanal (Na_v1,4) blocker µ-conotoxin (figur 2A og Video 3 eller figur 2B og Video 4, henholdsvis) , vi visualiseret Ca^{2 +} transienter der rejser den fulde længde af muskelfiber, der repræsenterer handlingen potentielle og medieret af frigivelsen af Ca^{2 +} fra sarcoplasmic reticulum, eller blot længden af endplate band, der repræsenterer den endplate potentielle og medieret af ekstracellulære Ca^{2 +} tilstrømning gennem AChR.In supplement til at identificere delpopulationer af besvarende celler med rumlige fluorescens intensitet kort (SD kort), som i figur 1, vi også målt ændringen i fluorescens over tid i en population af disse muskelceller med spatiotemporelle (ST) kort. Hver af disse eksperimenter repræsenterer en anden celletype, en anden tidsalder, en anden behandling (nerve stimulation vs nervestimulation i overværelse af forskellige stoffer) og forskellige typer af analyse (rumlige vs. spatiotemporelle Fluorescens intensitet kort). Disse tal også illustrere en af de mest nyttige funktioner i transgene at udtrykke GCaMP mus, nemlig evnen til gentagne gange stimulere og image samme prøve og derfor teste effekten af forskellige behandling betingelser.

Figur 1: Måling af aktivitet-induceret Schwann celle Ca^{2 +} svar i mellemgulvet og phrenic nerve af P7 Wnt1-Cre; betinget GCaMP3 mus. (A) (venstre) en gennemsnitlig fluorescens intensitet billede, viser baggrundsværdier for fluorescens i Schwann celler langs phrenic nerve filialer og på den neuromuskulære junction (NMJ), blev erobret før nervestimulation (Prestim). Værdierne i denne baggrund fluorescens blev trukket fra fluorescens værdier opnået efter nervestimulation. (Højre) Et geografisk kort over standardafvigelsen af 16-bit fluorescens intensitet enheder (SDiu₁₆) af Ca^{2 +} svar genereret efter 30 s 40 Hz phrenic nerve stimulation (Stim kort eller SD kort) viser en robust svar i terminal/perisynaptic Schwann celler (TPSCs) på NMJ. Brand CLUT heatmap er i SDiu₁₆ og skalalinjen i mikron. Alle billeder i paneler B - E er samme forstørrelse som dem i panelet A. (B) (til venstre) den samme membran var mærket med 594-konjugeret α-bungarotoxin (α-BTX), som binder sig til og etiketter acetylcholin receptorer (AChRs) og ophidset med grøn/gule lys til at identificere NMJ. (Højre) Dette panel viser et brightfield billede af den samme membran, viser spidsen af en intracellulær optagelse elektrode (pil), som kan blive guidet til en NMJ, baseret på α-BTX mærkning. (C) i Ca^{2 +} forbigående funktioner (fx, intensitet, debut efter stimulation, varighed) af individuelle celler eller grupper af celler kan vurderes af afgrænser enkelte regioner i den rumlige intensitet kort som partikler (venstre), der repræsenterer dem som farvekodede områder af interesse (ROIs), og (D) plotte deres intensiteter over tid. (E) dette panel viser dual-bølgelængde billeder af GCaMP3-medieret fluorescerende Ca^{2 +} svar og 594-α-mærket NMJs i den samme membran ved hjælp af Gemini image splitter efter nervestimulation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1: film uden billede opdeling af aktivitet-induceret Schwann celle Ca ^{2 +} svar på P7, som beskrevet i detaljer i den Figur 1 legend. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Video 2: film med billede opdeling af aktivitet-induceret Schwann celle Ca ^{2 +} svar og 594- Α-BTX-mærket AChRs på P7, som beskrevet i detaljer i den Figur 1 legend. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Figur 2: Måling af aktivitet-induceret muskel celle Ca^{2 +} svar i mellemgulvet af P4 Myf5-Cre; betinget GCaMP3 mus. (A) (venstre) nicotinsyre AChR klynger af centralt beliggende endplate band af mellemgulvet er mærket med 594-α-BTX. (I midten) Et geografisk kort af Ca^{2 +} forbigående intensiteter (SD kort), genereret efter 30 s 40 Hz phrenic nerve stimulation i overværelse af myosin hæmmer BHC, viser en reaktion i hele området af alle mellemgulvet muskelceller. (Højre) Derimod en SD kort genereres ud fra de samme membran efter den samme stimulation, men i nærværelse af Na_v1,4 antagonist µ-conotoxin (µ-CTX), udstiller et rumligt begrænset svar i den mediale region i alle mellemgulvet muskel celler der svarer til AChR klynge-beriget endplate band. Brand CLUT heatmap er i SDiu₁₆ og skalalinjen i mikron. (B) dette panel viser spatiotemporelle kort af Ca^{2 +} forbigående intensiteter over tid (ST kort) i en population af muskelceller (y-akse) følges over tid (x-akse). Skalalinjen er i sekunder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video 3: film af aktivitet-induceret muskel celle Ca ^{2 +} svar i overværelse af myosin blocker BHC på P4, som beskrevet i detaljer i den Figur 2A legend. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Video 4: film af aktivitet-induceret muskel celle Ca ^{2 +} svar i nærværelse af Na _v 1.4 antagonist µ-conotoxin på P4, som beskrevet i detaljer i den Figur 2B legend. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Discussion

Her giver vi nogle eksempler på måling Ca^{2 +} svar i bestemte celler i intakt neuromuskulære væv ved hjælp af GECI-udtrykker mus. For at kunne udføre disse eksperimenter, er det absolut nødvendigt ikke at såre den phrenic nerve under dissektion. For at billede Ca^{2 +} svar i Schwann celler ved enten lav eller høj effekt (dvs., 20 X eller 60 X), er det nødvendigt at bruge enten BHC eller µ-conotoxin til blok bevægelse. For energibesparende billeddannelse af Ca^{2 +} svar i muskelceller er det muligt at måle dem i mangel af disse stoffer, dermed tillade den samtidige overtagelse af muskel Ca^{2 +} forbigående Støtteintensiteter og muskel længde ændringer under højfrekvente nerve stimulation⁶. Når du udfører flere eksperimenter på den samme prøve, er det nødvendigt at adskille hver enkelt af mindst 15 min., i hvilket tidsrum prøven kan være perfunderet. Disse trin muliggøre den gentagne billeddannelse af stimulation-induceret Ca^{2 +} svar fra den samme synsfelt i samme prøve i mindst 3-5 timer. Det er også afgørende for predilute narkotika opløst i DMSO som beskrevet for BHC, som DMSO påføres direkte på GCaMP-udtrykker væv inducerer irreversibel, stimulus-uafhængig fluorescens svar.

Vi fandt, at af grunde, der er uklare, Wnt1-Cre; conditionalGCaMP3/6 mus undlader at udstille nervestimulation eller agonist-induceret Ca^{2 +} svar i Schwann celler efter P15 - P20. Dog Sox10-Cre; betinget GCaMP3/6 mus fortsat udviser disse svar i det mindste så sent som P56, den ældste alder, at vi har undersøgt. Derimod udstille Myf5-betingede GCaMP3/6 mus svar så gammel som et år, den ældste alder undersøgt.

GECI-udtrykker mus giver unikke muligheder for imaging Ca^{2 +} svar i hele populationer af celler af en bestemt undertype, men der er nogle begrænsninger, såsom manglende evne til at udføre ratiometric billeddannelse og dermed, udtrække kvantitative Ca ^{2 +} målinger. Der er også begrænsninger for mængden af dybden af væv hvorfra disse svar kan være afbildet ved hjælp af widefield Fluorescens mikroskopi (dvs.i modsætning til ved hjælp af Konfokal eller multiphoton mikroskopi). Derfor, mens thinness i mellemgulvet er modtagelig for anvendelse af de teknikker præsenteret her, indfange celle-specifikke Ca^{2 +} svar i celletyper af NMJ i andre muskler, der er tykkere kraeve sub dissektion eller andre former for Fluorescens mikroskopi.

Disse genetiske og optisk værktøjer repræsenterer en betydelig fremgang over tidligere Ca^{2 +} imaging teknikker, hvorved kun flere celletyper eller et par enkelte celler i én celletype kunne blive afbildet. En yderligere fordel er, at Ca^{2 +} svar kan være repeatably afbildet i lange perioder fra de samme celler ved hjælp af GECI mus, det er ikke let muligt ved hjælp af traditionelle kemiske Ca^{2 +}-bindende fluorescerende farvestoffer. Endelig, ved hjælp af et image splitter, vi udføre dual-bølgelængde imaging af en dynamisk signal inden for én celletype (Schwann celler) og en fast etiket i en anden (muskelceller) og således viser hvordan flere celle-specifikke calcium eller spænding svar kan blive evalueret) f.eks.en Schwann celle Cre-køre musen krydsede en betinget Cre-afhængige GCaMP mus som rapporteret her, krydsede en transgene Cre-uafhængig mus at udtrykke en muskel celle-specifikke GECI eller GEVI med ikke-overlappende fluorescens excitation / emission spectra¹⁰, vil tillade samtidige inddeling af dynamiske Ca^{2 +} og/eller spænding ændringer i både Schwann og muskel celler). Sådanne værktøjer kunne hjælpe vurdere hvorvidt svar af én celletype til en bestemt stimulus, som purin ATP eller dens fordeling produkt adenosin, er direkte eller indirekte medieret af en direkte virkning på en anden celletype på NMJ.

Hovedformålet med disse undersøgelser var at vurdere den spatiotemporelle Ca^{2 +} svar mønster af celle undertyper til nervestimulation, men de teknikker, der er ansat til at opnå dette kan sættes ind mod andre mål. For eksempel, de kan bruges til at analysere Ca^{2 +} svar i nærværelse af visse antagonister eller i visse mutant baggrunde, såsom i specifikke dyremodeller motor neuron sygdom, muskelsvind eller Charcot-Marie-Tooth sygdom, til at analysere de Ca^{2 +} svar på specifikke agonister at evaluere receptor udtryk, at vurdere heterogenitet af Ca^{2 +} respons funktioner i en celle undertype til en stimulus, eller til at sammenligne Ca^{2 +} svar i en celle undertype til andre funktionelle svar inden for denne type (electrophysiologically registrerede muskel endplate eller handling potentialer, optisk afbildet muskel afkortning, kraft-transducer-indspillet muskelspændinger, etc.) eller til andre parametre (fx, post hoc evaluering af nerve/muskel Schwann celle morfologi eller Molekylær udtryk via Immunhistokemi). Sammen, disse undersøgelser viser hvordan celle-specifikke GECI eller GEVI mus kan bruges til at belyse et bredt spektrum af fysiologiske processer på en synapse sammensat af genetisk identificerbare, celle-specifikke indgange.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myf5-Cre mice	Jax	#007893	Drives muscle cell expression as early as E136
Wnt1-Cre mice	Jax	#003829	Drives expression into all  Schwann cells at E13 but not P209
Sox10-Cre mice	Jax	#025807	Drives Schwann cell expression at older ages
Conditional GCaMP3 mice	Jax	#029043	Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion
Conditional GCaMP6f mice	Jax	#024105	Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion
BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)	Hit2Lead	#5102862	Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ
µ-conotoxin GIIIb	Peptides Int'l	#CONO20-01000	Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8
Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel .9KG	Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins
Minutien pins (0.1mm diameter)	Fine Science Tools	26002-10	Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel
Eclipse FN1 upright microscope	Nikon	MBA74100	Allows staging and observation of specimen
Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator	Autom8	MXMScr	Allows movement of specimen
Manual micromanipulator	Narishige	M-152	Holds recording and stimulating electrodes
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Axoclamp 900A	Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording
Microelectrode low-noise data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1550	Allows electrophysiological data acquisition
Microelectrode data analysis system	Molecular Devices	PCLAMP 10 Standard	Performs electrophysiological data analysis
Square wave stimulator	Grass	S48	Stimulates nerve to excite muscle
Stimulus Isolation Unit	Grass	PSIU6	Reduces  stimulation artifacts
Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter	Sutter	FG-GBF100-50-15	Impales and records nerve-evoked muscle potentials
Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter	Sutter	BF150-117-15	Lengthened and used for suction electrode
Micropipette Puller	Sutter	P-97	Pulls and prepares recording electrodes
1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera	Photometrics	Prime 95b	Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging
Light Source	Lumencor	Spectra X	Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation
Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm	Nikon	CFI60	Provide long working distances for visualization of specimen
Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp	Sumita	LS-DWL-N	Provides illumination for brightfield observation
W-View Gemini Image Splitter	Hamamatsu	A12801-01	Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera
Single-band Bandpass Filters  (512/25-25 and 630/92-25)	SemRock	FF01-512/25-25; FF01-630/92-25	Permits dual band imaging
560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging
Imaging data acquisition system	Nikon	NIS Elements - MQS31000	Allows imaging data acquisition
Wavelength control module	Nikon	MQS41220	Module for imaging data acqusiition
Emission splitter hardware module	Nikon	MQS41410	Module for imaging data acqusiition
Imaging data analysis system	NA	Volumetry 8D5, Fiji	Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data