Summary
Her presenterer vi en protokoll til bildet kalsium signalering i populasjoner av enkelte celletyper i murine nevromuskulær krysset.
Abstract
Den elektriske aktiviteten i cellene i vev kan overvåkes av elektrofysiologiske teknikker, men disse er vanligvis begrenset til analyse av individuelle celler. Siden en økning av intracellulær kalsium (Ca2 +) i stoffer ofte skyldes den elektriske aktiviteten, eller svar på et mylder av andre stimuli, denne prosessen kan overvåkes av lastet avbilding av celler med fluorescerende kalsium-sensitive fargestoffer. Det er imidlertid vanskelig å avbilde dette svaret i en enkelt celle type i hele vev fordi disse fargestoffer er tatt opp av alle celletyper i vevet. I kontrast, genetisk kodet kalsium indikatorer (GECIs) kan uttrykkes ved en enkeltcelle type og fluoresce svar på en økning på intracellulær Ca2 +, og tillater avbilding av Ca2 + signalering i hele populasjoner av individuelle celletyper. Her bruker vi bruk av GECIs GCaMP3/6 musen nevromuskulær veikrysset, en tredelt synapse mellom motor neurons, skjelettlidelser muskel og terminal/perisynaptic Schwann celler. Viser vi nytten av denne teknikken i klassisk ex vivo vev preparater. Bruker en optisk splitter, utføre vi dual-bølgelengde bildebehandling dynamisk Ca2 + signaler og en statisk etikett av nevromuskulær krysset (NMJ) i en tilnærming som kan være enkelt tilpasses til å overvåke to celle-spesifikke GECI eller genetisk kodet spenning indikatorer (GEVI) samtidig. Til slutt, vi diskutere rutinene som brukes til å fange romlige kart over fluorescens intensitet. Sammen kan disse optisk transgene og analytiske teknikker brukes til å studere biologiske aktivitet distinkte celle subpopulasjoner på NMJ i en rekke sammenhenger.
Introduction
NMJ, som alle synapser, består av tre elementer: en presynaptic terminal avledet fra en Nevron, en postsynaptic Nevron/effektor celle, og en perisynaptic glial celle1,2. Mens de grunnleggende aspektene av synaptic overføring ble først vist på denne synapse3, fortsatt mange aspekter av denne prosessen ukjent, delvis på grunn av uttrykket av de samme molekylene av de forskjellige Mobiltlf elementene av denne synapse. For eksempel uttrykkes reseptorer for både purine adenine nukleotid ATP og acetylkolin (ACh), som er co utgitt av motor neurons på virveldyrenes NMJ, av muskel, Schwann cellene og motor neurons, dermed kompliserer tolkningen av noen funksjonell effekt utøves av stoffer (f.eks, sender utgivelse eller svar, muskel styrkegenerering)4. Videre, selv om de tre komponentene i NMJ er enkelt forhold til, for eksempel nerveceller i sentralnervesystemet som ofte viser flere synaptic innganger, om motor neurons, muskelceller eller Schwann celler varierer i respons på stimuli basert på deres iboende heterogenitet (f.eksembryonale avledning fiber undertypen, morfologi) er uklart. For å møte hver av disse problemene, ville det være fordelaktig å samtidig spore responsen av mange celler innenfor en synaptic element, i tillegg til spor på samme tid, slik respons i ett av de andre momenter. Konvensjonelle strategies bruke kjemiske fargestoffer måle kalsium signalering kan ikke oppnå disse to mål, fordi bad brukte fargestoff er tatt opp av flere celletyper etter søknad til vev og intracellulært lastet fargestoff kan bare brukes til å visualisere individuelle eller små kohorter av celler. Her bruker transgene mus uttrykke GECIs utformet for å måle celle-spesifikke kalsium signalnettverk, bestemte bildebehandling og programvare verktøy5, vi viser først av disse to overordnede mål og diskutere hvordan tillegg av nye transgene verktøy ville bidra til å oppnå andre. Denne teknikken vil være nyttig for alle som er interessert i å spore kalsium dynamics eller andre mobilnettet signalisering hendelser observerbare gjennom gen-kodet optiske sensorer i flere celle populasjoner samtidig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Husdyrhold og eksperimenter ble utført i samsvar med den nasjonale institutter for helse Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr og IACUC på University of Nevada.
1. forberedelse av membraner og Phrenic nerver fra transgene mus
- Kjøpe transgene mus og oligonucleotide primere for genotype disse musene.
Merk: Primerne vises på siden "Informasjon" for hver av disse musene.- Rase 3 til 6-måneden-gamle musen uttrykke en kopi av det aktuelle transgene/knock-i grobunn-driver allelet og null kopier av det betingede GCaMP3/6 allelet med andre mus på samme alder uttrykke en eller to kopier av kondisjonalis GCaMP3 / 6 allelet og null kopier av allelet grobunn-driver.
- Genotype pups og merke de som har både grobunn og betinget GCaMP3/6 alleler-dette vil heretter bli kalt dobbel-transgene mus (f.eks Myf5-grobunn, betinget GCaMP3)6.
Merk: Denne måten alle data vil få fra mus uttrykke en kopi av både grobunn og betinget GCaMP3/6 alleler. Dette er spesielt viktig når du legger til i andre mutant mus (f.eks, fortrenging) disse krysser.
- Når dobbel-transgene mus er over myndighetsalder (f.eks, postnatal dag 0 eller 5 [P0 eller P5] voksne), euthanize musene decapitating dem med saks (for mus yngre enn P10) eller ved å plassere dem i en isoflurane innånding kammer-når de er ikke lenger mottakelig for knipe halen med en tang, de er klar for offer.
- Ofre dyr ved halshogging med en saks.
- Tvers delen over hele dyret rett under leveren og rett over hjertet og lungene med iridectomy saks.
- Dissekere bort leveren, hjertet og lungene, pass på å opprettholde en lengde på phrenic nerve som er tilstrekkelig lang til å bli trukket inn i en suge elektrode (dvs., 1-2 cm).
Merk: Venstre phrenic nerve kan bli identifisert som en hvit papirlapp vev som angir den mediale delen av venstre mellomgulvet. Det må ikke kuttes når du fjerner lungene. Rett phrenic nerve kjøres i et stykke fascia som også inneholder den overlegne vena cava og er tynnere og hvitere enn vena cava. Sammen trenge begge rett mediale mellomgulvet. - Videre fjerne brystkasse og virvelsøylen, bortsett fra den tynne ryggen rundt mellomgulvet.
- Plass membranen og phrenic nerve prøven i et microfuge rør med Krebs-ringe løsning med 1 µg/mL 594-αBTX i 10 min i mørket.
Merk: Denne konsentrasjonen av 594-αBTX etiketter ACh reseptorer (AChRs) uten å blokkere deres funksjon (personlig observasjon).
2. stimulering og opptak av muskel handling potensialer
- Bruker minutien pinner, nakkens membranen låsing på en 6 cm rett belagt med silikongel dielektrisk og fylt med ~ 8 mL oksygenrikt Krebs-Ringer og plassere den på mikroskopet scenen. Perfuse membran med mer Krebs-ringe løsning (8 mL/min) i 30 min.
Merk: Dette skyllinger ubundet 594-αBTX, samt equilibrates vevet etter disseksjon. - Gjøre en suge elektrode ifølge etablerte metoder7.
- På 4 X forstørrelse, bruker et micromanipulator, flytter sugekraft elektroden over venstre phrenic nerve og bruke sugekraft ved å trekke ut fat av en 5-mL sprøyte koblet til slangen som er knyttet til sugekraft elektroden.
Merk: Når ble trukket inn i sugekraft elektroden, phrenic nerve er stram. Slå på stimulator og stimulere den phrenic nerve ved å bla i manuell bytte 1 x. - Kontroller at membranen kontrakter svar på 1-Hz stimulering av visuelt undersøke det med brightfield belysning. Hvis ikke, justere spenningen ved å vri på spenning bryteren trinnvis for å oppnå en supramaximal pulse, som kontrolleres av en visuell undersøkelse av muskel sammentrekning. Hvis fortsatt ikke er synlig, blåse ut nerve med sprøyten og forsøker å trekke det i igjen ved å bruke sugekraft.
- På 4 X forstørrelse, bruker et micromanipulator, flytter sugekraft elektroden over venstre phrenic nerve og bruke sugekraft ved å trekke ut fat av en 5-mL sprøyte koblet til slangen som er knyttet til sugekraft elektroden.
- Slå av perfusjon og legge muskel-spesifikke myosin hemmer BHC6 eller spenning-gated natrium kanal antagonist μ-conotoxin8 til en siste konsentrasjon av 100 µM.
- 100 µM BHC, Pipetter 4 µL av 200 mM lager i DMSO og predilute det i 1 mL av Krebs-ringe løsning.
- Fjerne 1 mL av Krebs-ringe løsning fra parabolen.
- Legge til den prediluted BHC, i retten.
Merk: Denne predilution hindrer induksjon av ufortynnet DMSO av ikke er midlertidig fluorescerende svar i GCaMP3-uttrykke celler. - Vent 30 min og deretter slå på perfusjon av fersk Krebs-ringe løsning for en annen 20-30 min.
- Forbered innspilling elektroden.
- Bruk hansker, plassere en filamented Borosilikatglass med en ytre diameter (OD) 1 mm og en diameter (ID) på 0.4 mm i en brønnene avtrekker og stram ringer til det på plass. Lukk døren avtrekker.
- Bruke en P-97 avtrekker, programmet følgende innstilling: varme på 900, trekk på 120, hastighet på 75, tid på 250, trykk på 500, og ingen ytterligere looper.
Merk: Resistance (R) måles programvarekontroller av forsterkeren: den oppkjøp programvaren bekrefter motstand ved å løse formelen V = IR. Software-kontrolleren går en kjent gjeldende (I) (vanligvis 1 nA) gjennom elektroden og måler endringen i spenning (V), dermed slik at vi kan løse for R. - For embryonale membraner, påse at motstanden er nær 60 MΩ, og for eldre membraner, 10-20 MΩ. Last opptak elektroden med 3 M KCl.
- 10 X forstørrelse, lavere elektroden i muskler, med en andre micromanipulator på motsatt side av scenen som en stimulerende elektrode.
- Bruker elektrofysiologiske oppkjøpet programvare, vente til hvile membran potensialet endres fra 0 til-65 mV eller nedenfor.
- Stimulere ved 1 Hz og bekrefte tilstedeværelse av en muskel handling potensial ved å søke etter et stort potensial som viser en beskjeden overshoot (potensial som stiger over 0 mV når den starter på-65 mV eller nedenfor). Forvirre ikke stimulering gjenstand med en handling potensial.
Merk: Potensialer er betydelig lengre varighet (~ 5 ms) enn stimulering gjenstander.
3. avbilding av fluorescens av prøven
- På 20 X forstørrelse, finne endplate bandet i sentrum av muskel etter 594-αBTX-merket NMJs under grønne/gule lys eksitasjon (550 nm). Bytt til blå lys magnetisering (470 nm) bilde Ca2 + tiltak i muskler, motoriske nervecellen eller Schwann celler.
- Eventuelt definere bilde splitter med Båndpassdesign filtre og en dichroic én kant for dual-bølgelengde avbilding.
- For å beregne den maksimal fluorescensen (Fmax) utstilt ved GCaMP3/6-uttrykke vev, Legg 12 µL av 3 M kalium klorid (KCl) til membran forberedelser6.
- Utføre eksperimenter med lysstyrkelinjen på oppslag tabell baren satt til 110% nivå som GCaMP3/6-uttrykke vevet utstillinger metning på 20 X forstørrelse, uten binning svar på KCl.
- Registrere på 20 bilder per sekund gå ikke glipp av rask hendelser.
- Stimulere med 1-45 s av 20-40 Hz nervestimulering ved å levere et tog av impulser bruke sugekraft elektroden eller legge farmakologiske agonister av bad program eller av perfusjon og samler inn dynamisk fluorescerende Ca2 + svar i én celle undertype sammen med statisk 594-αBTX NMJ signalet.
Merk: Hvis vev-spesifikke rød eller langt rødt GECI eller GEVI mus blir tilgjengelige for bruk i NMJ, kan de brukes til å samle to dynamiske signaler reflekterer to distinkte Mobiltlf elementer på NMJ. - Når imaging eller elektrofysiologiske eksperimenter er ferdig fordi de ønskede resultatene er oppnådd, perfuse vann gjennom perfusjon linjene og suge vann 2 x - 3 x gjennom sugekraft elektroden slik at salter ikke bygge.
4. eksport og analyse av Data fra en standardavvik kart av fluorescens intensitet (SDiu16)
- Registrere bildesekvenser som 16-biters TIFF stabler og laste dem inn i ønsket bildebehandling data analysesystem for analyse.
- Programvaren 8d fil-menyen, velg bildestakk rundt og klikk for å laste.
- Når videoen laster, søke gjennom tid til å identifisere en del som har ingen mobilnettet fluorescerende aktivitet.
Merk: Denne regionen skal brukes til å lage en bakgrunn utvalg. - Hold forskyvning og klikk for å tegne et område av interesse (ROI) i området identifisert som eksempel bakgrunnsområdet.
- Når du har opprettet boksen, trykk space for å generere en tomt på bakgrunn aktivitet endrer.
- Høyreklikk spor og diverse velger å presentere alternativet Dumpe avkastning som tekst å gjøre sporingen som en xy koordinere tekstfil.
- Når videoen laster, søke gjennom tid til å identifisere en del som har ingen mobilnettet fluorescerende aktivitet.
- Flytte tilbake til video av interesse, skanne på nytt for å identifisere tid området der aktiviteten rundt skjer.
- Bruk det midtre musen knappen velge denne tid-regionen i den gule boksen.
- Høyreklikk på videoen og velg Stabel OPS og deretter Stat kart alternativet 5.
Merk: Dette vil generere kart standardavviket (SD kart) i det venstre vinduet. - Klikk på kartet for SD og deretter trykk ] nøkkel 19 x bruke den riktige farge varmekartet.
- Høyreklikk SD kartet og velg STM laste- og lagre, som vil presentere alternativet Lagre stm som tiff lagre SD kartet.
- Så, trykk [ nøkkel 19 x for å returnere til kart gråtone farge.
- Trykk C og deretter D å oppdra tetthet kartleggingsverktøy. Med venstre museknapp og museknappen center, justere terskelen for å inkludere alle fluorescerende aktivitet vises i SD kartet.
- Trykk C for å lukke tetthet verktøy mens innstillingene for terskelverdi.
- Høyreklikk SD kartet og velg STM partikler og deretter Finne PTCLS.
Merk: Dette identifiserer individuelle celler uttrykke fluorescerende aktivitet. - Høyreklikk SD kartet igjen og velg Opprette partikkel ROIs.
Merk: Dette vil vise de merkede cellene på den opprinnelige videoen rundt. - Mens du holder SKIFT, høyreklikker du på ett av nå identifiserte partikkel ROIs på den opprinnelige videoen.
- Velg ROI markør og måle Int i avkastning.
Merk: Dette vil generere enkelt fluorescerende aktivitet tomter for hver identifisert avkastning i videoen av interesse. Dette kan lagres ved å høyreklikke en av disse og velger Assorted, etterfulgt av Dumpe avkastning som tekst.
- For detaljert logikk underliggende disse operasjonene, se kilde koden fil9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flere eksempler på fluorescens intensitet endringer, formidlet av økning av intracellulær Ca2 + innenfor definerte celletyper NMJ, viser verktøyet av denne tilnærmingen. Disse resultatene presenteres som romlig fluorescens intensitet kart, som gir plasseringen av svarer cellene og intensiteten av svar, slik at for vurdering av hvor mange cellene reagerer og hvor mye hver celle svarer på et bestemt stimulans. For eksempel, som vist i figur 1, tok vi videoer av Ca2 + svarene i en befolkning på terminal/perisynaptic Schwann celler (TPSCs) ved NMJs av membranen av en P7 Wnt1-grobunn; betinget GCaMP3-uttrykke mus svar til stimulering av phrenic nerve og identifisert subpopulasjoner svarer cellene av romlige fluorescens intensitet kart. Disse kartene fluorescens intensitetsnivåer presenteres som varme kart og fargekodet etter en brann farge oppslagstabell (brann CLUT). Vi registrerte disse videoene med og uten deling bildet for å vise samtidig i klynger av α-BTX-merket AChRs i mellomgulvet (videoer 1 og 2), en tilnærming som kan enkelt tilpasses til å fange dynamisk GECI eller GEVI svar fra to forskjellige celle typer, forutsatt at hver av dem har ikke-overlappende eksitasjon og utslipp spektra.
I figur 2, vi utført samme nerve stimulering eksperiment på membranen av en P4 Myf5-grobunn, betinget GCaMP3-uttrykke mus og fotografert Ca2 + svarene i muskelceller. Interessant, da vi brukte myosin blokkering BHC eller den skjelettlidelser muskel-spesifikt spenning-gated kanal natrium (Nav1.4) blokkering μ-conotoxin (figur 2A og Video 3 eller figur 2B og Video 4, henholdsvis) , vi visualisert Ca2 + transienter som reiser hele lengden av muskel fiber, som representerer handlingen og mediert av utgivelsen av Ca2 + sarcoplasmic retikulum eller bare lengden på endplate bandet, som representerer den endplate potensial og mediert av ekstracellulære Ca2 + tilstrømningen gjennom AChR.In tillegg til å identifisere subpopulasjoner svarer celler med romlig fluorescens intensitet kart (SD kart), som i figur 1, vi også målt endring i fluorescens over tid i en populasjon av disse muskelceller med spatiotemporal (ST) kart. Hver av disse eksperimentene representerer en annen celle type, en annen alder, en annen behandling (nerve stimulering vs nervestimulering i nærvær av ulike legemidler) og forskjellige typer analyse (romlige vs spatiotemporal fluorescens intensitet kart). Disse tallene viser også en av de mest nyttige funksjonene av transgene GCaMP-uttrykke mus, nemlig evnen til å stimulere gjentatte ganger og bilde samme prøven, derfor teste effekten av annen behandling.
Figur 1: Måling av aktivitet-indusert Schwann celle Ca2 + svar i mellomgulvet og phrenic nerven i P7 Wnt1-grobunn; betinget GCaMP3 mus. (A) (til venstre) et gjennomsnittlig fluorescens intensitet bilde, viser bakgrunnen nivåer av fluorescens i Schwann celler langs phrenic nerve grenene og nevromuskulær krysset (NMJ), ble tatt før nervestimulering (Prestim). Verdiene for denne bakgrunnen fluorescens ble trukket fra fluorescens verdier hentet etter nervestimulering. (Høyre) Kart romlige standardavvik av 16-biters fluorescens intensitet enheter (SDiu16) av Ca2 + svar generert etter 30 s av 40 Hz phrenic nervestimulering (Stim kart eller SD kart) viser en robust reaksjon i terminal/perisynaptic Schwann celler (TPSCs) på NMJ. Brann CLUT heatmap er i SDiu16 skala baren er i mikron. Alle bilder i paneler B - E er den samme forstørrelsen som i panelet A. (B) (til venstre) samme membranen var merket med 594-konjugerte α-bungarotoxin (α-BTX), som binder seg til etiketter acetylkolin reseptorer (AChRs) og glade med grønne/gule lys for å identifisere NMJ. (Høyre) Dette panelet viser en brightfield bilde av samme membranen, viser spissen av en intracellulær opptak elektrode (pil), som kan styres til en NMJ, basert på α-BTX merking. (C) Ca2 + forbigående funksjoner (f.eks, intensitet, utbruddet etter stimulering, varighet) for enkeltceller eller grupper av celler kan evalueres ved demarcating personlige regionene i romlige intensitet kartet som partikler (venstre), som representerer dem som fargekodede områder av interesse (ROIs), og (D) planlegger deres intensiteter over tid. (E) dette panelet viser dobbelt-bølgelengde bilder av GCaMP3-mediert fluorescerende Ca2 + svar og 594-α-merket NMJs i samme membranen bruke Gemini bilde splitter etter nervestimulering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: film uten bilde deling av aktivitet-indusert Schwann celle Ca 2 + svar på P7, som beskrevet i detalj i den Figur 1 legende. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 2: film med bilde deling av aktivitet-indusert Schwann celle Ca 2 + svar og 594- Α-BTX-merket AChRs på P7, som beskrevet i detalj i den Figur 1 legende. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Figur 2: Måling av aktivitet-indusert muskel celle Ca2 + svar i membranen av P4 Myf5-grobunn; betinget GCaMP3 mus. (A) (til venstre) nikotinsyre AChR klynger av sentralt endplate bandet av membranen er merket med 594-α-BTX. (I midten) En romlig kart over Ca2 + forbigående intensiteter (SD kart), genereres etter 30 s på 40 Hz i phrenic nervestimulering i nærvær av den myosin inhibitor BHC, viser et svar gjennom hele regionen av alle membran muskelceller. (Høyre) I kontrast, en SD-kart som er generert fra samme membranen etter samme stimulering, men i nærvær av Nav1.4 antagonist μ-conotoxin (μ-CTX), viser en romlig begrenset respons i den mediale regionen alle membran muskel celler som tilsvarer AChR cluster-beriket endplate bandet. Brann CLUT heatmap er i SDiu16 skala baren er i mikron. (B) dette panelet viser spatiotemporal kart av Ca2 + forbigående intensiteter over tid (ST kart) i en populasjon av muskelceller (y-aksen) fulgt over tid (x-aksen). Baren skala er sekunder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 3: film av aktivitet-indusert muskelcelle Ca 2 + svar i nærvær av myosin blokkering BHC på P4, som beskrevet i detalj i den Figur 2A legende. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 4: film av aktivitet-indusert muskelcelle Ca 2 + svar i nærvær av Na v 1,4 antagonist μ-conotoxin på P4, som beskrevet i detalj i den Figur 2B legende. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her gi vi noen eksempler på måler Ca2 + svar i bestemte celler i intakt nevromuskulær vev ved hjelp av GECI-uttrykke mus. For å utføre disse eksperimentene, er det viktig ikke å skade phrenic nerve under dissection. For å bilde Ca2 + svar i Schwann celler på enten lav eller høy effekt (dvs20 X eller 60 X), er det nødvendig å bruke enten BHC eller μ-conotoxin til å blokkere bevegelse. For lavt strømforbruk avbildning av Ca2 + svar i muskelceller er det mulig å måle dem i fravær av disse stoffene, og tillater samtidig anskaffelsen av muskelen Ca2 + forbigående intensitet og muskel lengde endringer under høyfrekvente nerve stimulering6. Når du utfører flere eksperimenter på samme prøven, er det nødvendig å skille hver og en av minst 15 minutter, hvor prøven kan være parfyme. Disse trinnene gir gjentatte avbilding av stimulering-indusert Ca2 + svar fra samme synsfelt i samme utvalget i minst 3-5 timer. Det er også avgjørende for predilute stoffer oppløst i DMSO som BHC, som DMSO brukes direkte på GCaMP-uttrykke vev medfører irreversible, uavhengig av stimulans fluorescens svar.
Vi fant det for grunner som er uklart, Wnt1-grobunn; conditionalGCaMP3/6 mus mislykkes å nervestimulering eller agonist-indusert Ca2 + svar i Schwann cellene etter P15 - P20. Men Sox10-grobunn; betinget GCaMP3/6 mus fortsetter å vise disse svarene minst så sent som P56, den eldste aldersgruppen som vi har undersøkt. I motsetning utstilling Myf5-betinget GCaMP3/6 mus svar like gammel som ett år, den eldste aldersgruppen undersøkt.
GECI-uttrykke mus gir unike muligheter for imaging Ca2 + svar i hele populasjoner av celler med en bestemt undertypen, er det noen begrensninger, som manglende evne til å utføre ratiometric bildebehandling, og dermed trekke ut kvantitative Ca 2 + målinger. Det er også begrensninger på hvor mye dybde av vev som disse svarene kan avbildes bruker widefield fluorescens mikroskopi (dvs.i motsetning til benytter AC confocal eller multiphoton mikroskopi). Derfor, mens thinness av membranen er mottakelig for anvendelse av teknikker som presenteres her, fange celle-spesifikke Ca2 + svar i celletyper NMJ i andre muskler som tykkere kan kreve sub disseksjon eller annen av fluorescens mikroskopi.
Verktøyene genetiske og optisk representerer en betydelig fremgang over forrige Ca2 + imaging teknikker, som bare flere celletyper eller noen individuelle celler i én celle type kan bli avbildet. En ekstra fordel er at Ca2 + svar kan repeatably avbildes i lange perioder fra de samme cellene med GECI mus, mens dette ikke er enkelt mulig å bruke tradisjonelle kjemiske Ca2 +-bindende fluorescerende fargestoffer. Endelig bruker et bilde splitter, vi utføre dual-bølgelengde avbildning av et dynamisk signal i én celle type (Schwann celler) og en bestemt etikett innen andre (muskelceller), og dermed viser hvordan flere celle-spesifikke kalsium eller spenningen svar kan bli evaluert) f.eksSchwann celle grobunn-kjøring mus krysset til betinget grobunn-avhengige GCaMP mus som rapportert her, krysset til transgene grobunn-uavhengig mus uttrykke en muskel celle-spesifikke GECI eller GEVI med ikke-overlappende fluorescens eksitasjon / utslipp spectra10, ville tillate samtidig sporing av dynamiske Ca2 + og/eller spenning endringer i både Schwann og muskel celler). Slike verktøy kan bidra til å vurdere om svaret av én celle type en bestemt stimulans, som purine ATP eller dens sammenbrudd produktet adenosin, er direkte eller indirekte mediert av direkte innvirkning på en annen celle type på NMJ.
Hovedmålet med disse studiene var å evaluere spatiotemporal Ca2 + svar mønsteret av celle undergrupper på nervestimulering, men teknikkene å oppnå dette kan distribueres mot andre mål. For eksempel, de kan brukes til å analysere Ca2 + svar i nærvær av visse antagonister eller i visse mutant bakgrunner, som i bestemte dyremodeller motor neuron sykdom, muskeldystrofi eller Charcot-Marie-Tooth sykdom, analysere den Ca2 + response til bestemte agonister evaluere reseptor uttrykk, å vurdere heterogenitet av Ca2 + svar innen en celle undertype til en stimulans eller sammenligne Ca2 + svar i en celle undertype til andre funksjonelle svar innen denne typen (electrophysiologically registrert muskel endplate eller potensialer, optisk fotografert muskel forkortelse, kraft-svinger-innspilte muskelspenninger, etc.) eller andre parametere (f.eks, legge hoc evaluering av nerve/muskel Schwann celle morfologi eller molekylær uttrykk via immunohistochemistry). Sammen disse studiene viser hvordan celle-spesifikk GECI eller GEVI mus kan brukes til å belyse et bredt spekter av fysiologiske prosesser på en synapse består av genetisk identifiserbar, celle-spesifikke innganger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med midler fra National Institutes of Health (NIH) GM103554 og GM110767 til (T.W.G.) og National Center for forskning 5P20RR018751 og National Institute of General Medical Sciences 8P 20 GM103513 (til G.W.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Myf5-Cre mice | Jax | #007893 | Drives muscle cell expression as early as E136 |
| Wnt1-Cre mice | Jax | #003829 | Drives expression into all Schwann cells at E13 but not P209 |
| Sox10-Cre mice | Jax | #025807 | Drives Schwann cell expression at older ages |
| Conditional GCaMP3 mice | Jax | #029043 | Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion |
| Conditional GCaMP6f mice | Jax | #024105 | Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion |
| BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one) | Hit2Lead | #5102862 | Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6 |
| CF594-α-BTX | Biotium | #00007 | Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ |
| µ-conotoxin GIIIb | Peptides Int'l | #CONO20-01000 | Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8 |
| Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard | Ellswoth Adhesives | # Sil Dielec Gel .9KG | Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins |
| Minutien pins (0.1mm diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel |
| Eclipse FN1 upright microscope | Nikon | MBA74100 | Allows staging and observation of specimen |
| Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator | Autom8 | MXMScr | Allows movement of specimen |
| Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | Holds recording and stimulating electrodes |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Axoclamp 900A | Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording |
| Microelectrode low-noise data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1550 | Allows electrophysiological data acquisition |
| Microelectrode data analysis system | Molecular Devices | PCLAMP 10 Standard | Performs electrophysiological data analysis |
| Square wave stimulator | Grass | S48 | Stimulates nerve to excite muscle |
| Stimulus Isolation Unit | Grass | PSIU6 | Reduces stimulation artifacts |
| Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter | Sutter | FG-GBF100-50-15 | Impales and records nerve-evoked muscle potentials |
| Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter | Sutter | BF150-117-15 | Lengthened and used for suction electrode |
| Micropipette Puller | Sutter | P-97 | Pulls and prepares recording electrodes |
| 1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera | Photometrics | Prime 95b | Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging |
| Light Source | Lumencor | Spectra X | Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation |
| Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm | Nikon | CFI60 | Provide long working distances for visualization of specimen |
| Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp | Sumita | LS-DWL-N | Provides illumination for brightfield observation |
| W-View Gemini Image Splitter | Hamamatsu | A12801-01 | Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera |
| Single-band Bandpass Filters (512/25-25 and 630/92-25) | SemRock | FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 | Permits dual band imaging |
| 560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter | Sem Rock | FF560-FDi01-25x36 | Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging |
| Imaging data acquisition system | Nikon | NIS Elements - MQS31000 | Allows imaging data acquisition |
| Wavelength control module | Nikon | MQS41220 | Module for imaging data acqusiition |
| Emission splitter hardware module | Nikon | MQS41410 | Module for imaging data acqusiition |
| Imaging data analysis system | NA | Volumetry 8D5, Fiji | Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).
- Fatt, P., Katz, B. An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode. Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).
- Todd, K. J., Robitaille, R. Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction. Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).
- Hennig, G. W., et al. Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon. Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).
- Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology. Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).
- Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).
- Hong, S. J., Chang, C. C. Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse. British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).
- Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue. Elife. 7, e30839 (2018).
- Cho, J. H., et al. The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
