לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול סידן התמונה איתות באוכלוסיות של סוגי תאים בודדים באזור צומת עצב-שריר מאתר.

Abstract

ניתן לנטר את הפעילות החשמלית של תאי ברקמות בטכניקות אלקטרופיזיולוגיות, אך אלה הם בדרך כלל מוגבל לניתוח של תאים בודדים. מאז עלייה של תאיים סידן (Ca^{2 +}) ציטוזול מתרחש לעיתים קרובות בגלל הפעילות החשמלית, או בתגובה מספר עצום של גירויים אחרים, תהליך זה יכול להיות במעקב על ידי ההדמיה של תאים נטען עם פלורסנט סידן רגיש צבענים.  עם זאת, קשה תמונה תגובה זו בסוג של תא בודד בתוך רקמת כל כי צבע אלה נתפסות על ידי כל סוגי תאים בתוך הרקמה. לעומת זאת, סידן מקודדים גנטית אינדיקטורים (GECIs) יכול לבוא לידי ביטוי על ידי סוג של תא בודד, לזרוח בתגובה לעליה של תאיים Ca^{2 +}, וכך מאפשר ההדמיה של Ca^{2 +} איתות של אוכלוסיות שלמות של סוגי תאים בודדים. כאן, אנו מיישמים את השימוש של GECIs GCaMP3/6 לצומת neuromuscular העכבר, תאי שוואן סינפסה התלת-צדדי בין מוטורי לגלוקוז, שרירי השלד מסוף/perisynaptic. נדגים את התועלת של טכניקה זו קלאסי שמחוץ רקמות ההכנות. שימוש של הפיצול אופטי, אנו מבצעים הדמיה כפולה באורך הגל של Ca דינמי^{2 +} אותות ותווית סטטי של צומת עצב-שריר (NMJ) בגישה זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לפקח על שני GECI תא ספציפי או מתח מקודדים גנטית אינדיקטורים (GEVI) בו זמנית. לבסוף, נדון את רוטינות המשמש ללכידה מפות מרחביות של עוצמת קרינה פלואורסצנטית. יחד, טכניקות אלו אופטי, מהונדס, אנליטית יכול להיות מועסק ללמוד את הפעילות הביולוגית של subpopulations תאים נפרדים ב- NMJ במגוון רחב של הקשרים.

Introduction

NMJ, כמו כל הסינפסות, מורכב משלושה אלמנטים: מסוף presynaptic נגזר תא עצב, תא נוירון postsynaptic/אפקטור, ותא perisynaptic גליה^1,2. בעוד ההיבטים הבסיסיים של ההעברה הסינאפסית היו שהראו-זה סינפסה³, היבטים רבים של תהליך זה נשאר לא ידוע, בחלקו בשל הביטוי של מולקולות אותו על ידי אלמנטים הסלולר ברורים של סינפסה הזה. לדוגמה, קולטני פורין אדנין נוקלאוטיד ATP והן אצטילכולין (ACh), אשר פורסם במשותף על ידי מנוע נוירונים ב- NMJ חוליות, באים לידי ביטוי על ידי שריר, תאי שוואן מוטורי לגלוקוז, ובכך שמסבך את הפירוש של כל השפעה תפקודית שהופעל על ידי אלה חומרים (למשל, משדר השחרור או תגובה, יצירת כח השריר)⁴. יתר על כן, למרות NMJ מרכיבי ה-tripartite פשוטים בהשוואה, לדוגמה, נוירונים במערכת העצבים המרכזית אשר לעתים קרובות להפגין תשומות סינפטית מרובים, אם המנוע נוירונים, תאי שריר או תאי שוואן להשתנות בתגובה לגירויים מבוסס על מהותי שלהם הטרוגניות (למשל, נגזרת עובריים, סוג של סיבים, מורפולוגיה) אינו ברור. על מנת לטפל בכל הבעיות הללו, זה יהיה יתרון לאתר בו זמנית את התגובה של תאים רבים בתוך אחד רכיב סינפטית, כמו גם מסלול, באותו הזמן, תגובה כזו גם שאר הרכיבים נפרדים. אסטרטגיות המקובלת באמצעות צבעם למדוד סידן איתות לא יכול להשיג שתי מטרות אלה, בגלל צבע שהוחל אמבטיה הוא נלקח על ידי סוגי תאים מרובים לאחר היישום לרקמות, צבע טעון intracellularly יכול לשמש רק לדמיין גדודים נפרדים או קטן של תאים. כאן, ניצול העכברים הטרנסגניים לבטא GECIs תוכנן כדי למדוד סידן לתא ספציפי איתות, יחד עם הדמיה ספציפית, כלי תוכנה⁵, אנחנו מדגימים הראשון של אלה שתי מטרות הכוללת ונדון כיצד התוספת של חדש כלים הטרנסגניים יעזור להשיג השני. טכניקה זו יהיה שימושי עבור מי שמעוניין מעקב אחר הדינמיקה סידן או אחרים הסלולר איתות האירועים נצפות דרך גן מקודד חיישנים אופטיים אוכלוסיות תאים מרובים בו-זמנית.

Protocol

גידול בעלי חיים, ניסויים בוצעו על פי מוסדות לאומיים של בריאות המדריך עבור הטיפול, השימוש של חיות מעבדה, את IACUC-האוניברסיטה של נבאדה.

1. הכנת דיאפרגמות ועצבים הסרעפת מן העכברים הטרנסגניים

1. לרכוש העכברים הטרנסגניים לנוקלאוטידים גנוטיפ אלו עכברים.
   הערה: תחל מפורטים בדף "מידע" עבור כל אחד אלו עכברים.
   1. מתרבים עכבר 3 ל 6-בן חודש לבטא עותק אחד של המתאים הטרנסגניים/דפיקה-ב Cre-הנהג אלל ועותקים אפס של אלל GCaMP3/6 מותנה עם עכבר השניה, באותו הגיל לבטא אחד או שני עותקים של תנאי GCaMP3 / 6 אלל ועותקים אפס של אלל נהג-Cre.
   2. גנוטיפ הגורים ומארק אלה שיש להם Cre והן מותנה אללים GCaMP3/6 – אלה ייקרא מעתה העכברים הטרנסגניים-כפול (למשל, Myf5-Cre, GCaMP3 מותנה)⁶.
      הערה: בדרך זו, כל הנתונים תפיק מן עכברים המבטאים עותק אחד של Cre והן מותנה אללים GCaMP3/6. הדבר חשוב במיוחד בעת הוספת בעכברים המוטנטים אחרים (למשל, הסתרה) הצלבים.
2. מתי העכברים הטרנסגניים-כפול של הגיל המתאים (למשל, כמחנכת יום 0 או 5 [P0 או P5] או למבוגרים), המתת חסד העכברים על-ידי עריפת ראשו אותם עם מספריים (עבור עכברים צעיר יותר P10) או על-ידי הצבתם תא שאיפה איזופלוריין — כאשר הם כבר לא מגיבים צובט את הזנב עם זוג מלקחיים, הם מוכנים להקריב.
3. להקריב את החיה על ידי עריפת ראש עם זוג מספריים.
4. מדור באופן רוחבי על פני החיה כולו מתחת הכבד, מעל הלב והריאות במספריים iridectomy.
5. לנתח הכבד, הלב, הריאות, וישתדלו לשמור על אורך עצב הסרעפת היא ארוכה דיה להיגרר אלקטרודה היניקה (קרי, 1-2 ס מ).
   הערה: ניתן לזהות את עצב הסרעפת השמאלית כמו פיסת רקמה שמזין את החלק המדיאלי של הסרעפת השמאלית לבן. זה בטח לא לחתוך בעת הסרת הריאות. עצב הסרעפת נכון פועל בתוך פיסת fascia כי גם מכיל את הווריד הנבוב העליון הוא דק, לבן יותר הווריד הנבוב. יחד, הם שניהם לחדור הסרעפת נכון המדיאלי.
6. נוסף להסיר את בית החזה של עמוד השדרה, למעט הרכס דק סביב הסרעפת.
7. הכנס צינור microfuge עם פתרון קרבס-חיזוק עם µg 1/mL 594-αBTX 10 דקות בחושך על הסרעפת ועל המדגם עצב הסרעפת.
   הערה: בריכוז זה של 594-αBTX תוויות ACh קולטנים (AChRs) בלי לחסום את תפקידם (תצפית אישי).

2. גירוי ורישום של פוטנציאל פעולה שריר

1. באמצעות סיכות minutien, לשתק את הסרעפת על-ידי הצמדת אותם על צלחת 6 ס מ מצופה סיליקון ג'ל מבודד, מלא ~ 8 מ"ל של פתרון קרבס-צלצולים יותר מחומצן ולמקם אותו לבמה מיקרוסקופ. Perfuse את הסרעפת עם פתרון קרבס-חיזוק נוסף (8 מ לדקה) למשך 30 דקות.
   הערה: זה ומעכלת את לא מאוגד 594-αBTX, וכן equilibrates את הרקמה לאחר ניתוח.
2. הפוך אלקטרודה היניקה לפי שיטות הוקמה⁷.
   1. בהגדלה X 4, שימוש micromanipulator, זוז האלקטרודה היניקה עצב הסרעפת השמאלית ולהחיל שאיבה על-ידי הוצאת הקנה של מזרק 5-mL מחובר לאורך צינור שאליו מחובר האלקטרודה היניקה.
      הערה: כאשר בהצלחה נמשכים אל האלקטרודה היניקה, עצב הסרעפת הוא מתוח. להפעיל את ממריץ ולעורר את הסרעפת עצב על ידי flipping את ידני לעבור 1 x.
   2. ודא כי הסרעפת חוזים בתגובה הגירוי 1-הרץ על ידי חזותית בודק אותה עם תאורה brightfield. אם לא, להתאים את המתח על-ידי הפעלת הידית מתח מצטבר להשגת דופק supramaximal, אשר ניתנת לאימות כמקורית על-ידי בדיקה ויזואלית של התכווצות שרירים. אם עדיין לא גלוי, לכבות את העצב עם המזרק ולנסות לצייר אותה שוב על-ידי החלת שאיבה.
3. כבה את זלוף ולהוסיף את מעכב BHC שרירים ספציפיים צולבות הקישור חוטים שרירן⁶ או ממוצע-conotoxin⁸ אנטגוניסט ערוץ נתרן ממותגת מתח ריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
   1. 100 מיקרומטר BHC, פיפטה µL 4 של מניות 200 מ מ של דימתיל סולפוקסיד ולחצו predilute זה ב 1 מ"ל של פתרון קרבס-צלצול.
   2. הסר 1 מ"ל של פתרון קרבס-הצלצול של המנה.
   3. הוסף את BHC prediluted, למנה.
      הערה: predilution זו מסייעת למנוע את אינדוקציה על ידי דימתיל סולפוקסיד מדולל של היענות פלורסנט לא ארעי בתאים המבטאים GCaMP3.
   4. המתן 30 דקות ולאחר מכן, הפעל את זלוף בפתרון קרבס-צלצול טריים למשך עוד 20-30 דקות.
4. להכין את האלקטרודה הקלטה.
   1. להשתמש בכפפות, מניחים על filamented זכוכית בורוסיליקט בקוטר חיצוני (OD) של 1 מ מ, קוטר פנימי (ID) של 0.4 מ מ פולר micropipette והדק את החוגה כדי. תהדק את זה למקומו. סגור את הדלת פולר.
   2. שימוש של פולר P-97, לתכנת את ההגדרה הבאה: חום-900, ברגע האחרון 120, מהירות ב-75, הפעם 250, הלחץ 500, וכן אין לולאות נוספים.
      הערה: Resistance (R) נמדד באמצעות פקדי תוכנה של המגבר: התוכנה רכישת נתונים מאשר התנגדות על ידי פתירת הנוסחה V = IR. הבקר תוכנה עובר זרם ידוע (I) (בדרך כלל 1 nA) דרך האלקטרודה, מודד את השינוי במתח (V), ובכך מאפשר לנו למציאת המהירות
   3. עבור דיאפרגמות עובריים, ודא כי ההתנגדות היא ליד 60 MΩ, ובשביל דיאפרגמות בוגרים, 10-20 MΩ. לטעון את האלקטרודה הקלטה עם 3 מ' אשלגן כלורי.
5. בהגדלה X 10, להוריד את האלקטרודה לתוך שריר, באמצעות micromanipulator השנייה מעברו האחר של הבמה כמו אלקטרודה מגרה.
6. באמצעות תוכנה רכישת נתונים אלקטרופיזיולוגיות, המתן עד פוטנציאל ממברנה המנוחה משתנה מ- 0 ל-65 mV או בהמשך.
7. לעורר 1 הרץ ואמת הנוכחות של פוטנציאלי פעולה השריר על-ידי בדיקת פוטנציאל גדול זה מוצגים להחטיא צנוע (פוטנציאל המתנשא מעל 0 mV כשזה מתחיל ב-65 mV או בהמשך). אל תבלבל החפץ גירוי עם פוטנציאל הפעולה.
   הערה: פוטנציאל הם באופן משמעותי יותר משך (~ 5 ms) מאשר גירוי חפצים.

3. הדמיה של זריחה המדגם

1. בהגדלה X 20, לאתר הלהקה endplate במרכז של השריר על-ידי חיפוש 594-αBTX – שכותרתו ' NMJs תחת עירור אור ירוק/צהוב (550 ננומטר). לעבור עירור אור כחול (470 ננומטר) התמונה Ca^{2 +} תגובות שריר, נוירון מוטורי או תאי שוואן.
2. אם רצונך בכך, להגדיר המפצל תמונה עם מסננים bandpass ומסנן קצה חד ודיקרואיק זוהר עבור ההדמיה כפולה באורך הגל.
3. על מנת לחשב פלורסצנטיות מקסימלי (Fmax) הוצגו על ידי רקמת GCaMP3/6-הבעת ', להוסיף µL 12 3 מ' אשלגן כלורי (אשלגן) ההכנות של הסרעפת⁶.
   1. לבצע ניסויים עם הבר בהירות על הבר טבלת בדיקת מידע מוגדר כ- 110% של רמת שבו הרקמה GCaMP3/6-הבעת ' מוצגים רוויה בהגדלה X 20, מבלי binning בתגובה אשלגן כלורי.
4. שיא 20 מסגרות לשנייה לא תפספס שאירועים מהר.
5. לעורר עם s 1-45 של 20-40 הרץ של גירוי עצבי על-ידי אספקת רכבת של דחפים באמצעות האלקטרודה יניקה או להוסיף אגוניסטים תרופתי על ידי יישום אמבט או זלוף ולאסוף דינמי פלורסנט Ca^{2 +} תגובות בסוג של תא אחד יחד עם האות NMJ 594 סטטי-αBTX.
   הערה: אם רקמות ספציפיות אדום או מרחיקת אדום GECI או GEVI עכברים הופכים לזמינים לשימוש ב- NMJ, הם יכולים לשמש כדי לאסוף שני אותות דינמי המשקף את שני הרכיבים הסלולר ב- NMJ.
6. כאשר הניסויים הדמיה או אלקטרופיזיולוגיות גמורים כי היה להשיג את התוצאות הרצויות, perfuse המים דרך הקווים זלוף ולמצוץ מים 2 x - x 3 דרך האלקטרודה שאיבה על מנת להבטיח כי מלחי לא לבנות.

4. ייצוא וניתוח של הנתונים באינטנסיביות סטיית תקן מפה של קרינה פלואורסצנטית (SD_iu16)

1. רצפי תמונות הרשומה רשמה 16 סיביות TIFF ערימות ולטעון אותן למערכת הרצויה הדמיה נתונים ניתוח לניתוח.
2. בתפריט קובץ 8 קבוצו של התוכנה, בחר תמונה הערימה עניין ולחץ כדי לטעון.
   1. ברגע הוידאו נטען, יסרוק הזמן כדי לזהות סעיף זה אין פעילות פלורסנט הסלולר.
      הערה: אזור זה ישמש כדי ליצור מדגם רקע.
   2. החזק את מקש Shift ולחץ כדי לצייר אזור התיבה שנוספה (ROI) באזור מזוהה אזור הדגימה רקע.
   3. לאחר יצירת תיבת, לחצו על הרווח כדי ליצור חלקת רקע פעילות שינוי.
   4. המעקב באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר באפשרות מגוון להציג את האפשרות לזרוק רועי כטקסט כדי להפוך את האיתור כקובץ טקסט קואורדינטות xy.
3. חוזרת הוידאו של הריבית, לסרוק שוב כדי לזהות את אזור הזמן שבו מתרחשת הפעילות של ריבית.
   1. באמצעות הכפתור האמצעי של העכבר, בחר באזור הזמן בתיבה זמן צהוב.
   2. לחץ לחיצה ימנית על הסרטון ובחר מחסנית OPS ולאחר מכן אפשרות למפות Stat 5.
      הערה: פעולה זו תיצור מפת סטיית תקן (SD מפה) בחלון השמאלי.
   3. לחץ על המפה SD ולאחר מכן הקש ] מפתח x 19 כדי להחיל את המפה חום הצבע המתאים.
   4. המפה SD באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר STM טען ושמור, אשר יציג את האפשרות לשמור את ה-stm כמו tiff לשמור את המפה SD.
   5. אז, הקש [ מפתח x 19 לשוב אל מפת צבע בגווני אפור.
   6. הקש C ולאחר מכן D כדי להעלות את צפיפות כלי מיפוי. באמצעות לחצן העכבר השמאלי ואת לחצן העכבר במרכז, להתאים את סף כדי לכלול כל פעילות פלורסנט שמוצג במפת ה-SD.
   7. הקש C כדי לסגור את הכלים צפיפות תוך שמירה על הגדרות הסף.
   8. המפה SD באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר חלקיקי ה-STM , ולאחר מכן למצוא את PTCLS.
      הערה: זה יהיה לזהות תאים בודדים לבטא פעילות פלורסנט.
   9. לחץ לחיצה ימנית על המפה SD פעם נוספת ובחר ליצור חלקיקים ROIs.
      הערה: זה להרכיב את התאים שנבחרו על הוידאו המקורי של עניין.
   10. תוך החזקת מקש shift לחוץ, לחץ לחיצה ימנית על כל אחד של החלקיק מזוהה עכשיו ROIs בסרטון המקורי.
   11. בחר סמן רועי ו- Int מידה ב- ROI.
       הערה: פעולה זו תיצור חלקות פעילויות פלורסנט נפרדים עבור כל רועי מזוהה בסרטון של ריבית. אלה יכולים להיות נשמר על-ידי לחיצה ימנית על כל אחד מאלו, בחירת Assorted, ואחריו לזרוק רועי כטקסט.
4. לקבלת נתונים היסטוריים ההיגיון שבבסיס פעולות אלה, נא עיין קובץ קוד מקור⁹.

Representative Results

מספר דוגמאות של שינויים בעוצמה פלורסצנטיות, מתווכת על-ידי עליות של תאיים Ca^{2 +} בתוך התא מוגדרים סוגי NMJ, להראות את התועלת של גישה זו. תוצאות אלו מוצגים כמו זריחה המרחבי בעוצמה מפות, אשר מספקים את מיקומו של תאים מגיבה, כמו גם את עוצמת התגובות שלהם, ובכך מאפשר על ההערכה של כמה תאים מגיב ומגיב כמה כל תא מסוים גירוי. לדוגמה, כפי שמוצג באיור1, לקחנו סרטונים של ההיענויות^{2 +} Ca אוכלוסיה של מסוף/perisynaptic שוואן תאים (TPSCs)-NMJs של הסרעפת של P7 Wnt1-Cre; GCaMP3 מותנה-הבעת העכבר בתגובה גירוי של עצב הסרעפת וזיהה את subpopulations של התאים מגיבה על-ידי קרינה פלואורסצנטית המרחבי בעוצמה מפות. מפות אלה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית מוצגים כמו חום ומפות מקודדים לפי טבלת בדיקת מידע צבע אש (אש טבלת צבעים). הקלטנו את סרטי הווידאו האלה עם או בלי פיצול התמונה כדי להציג בו-זמנית האשכולות של α-BTX-שכותרתו ' AChRs באמצע הסרעפת (קטעי וידאו 1 ו- 2), גישה יכול בקלות להיות מותאם כדי ללכוד דינמי GECI או GEVI תגובות בשתי שפות התא סוגי, בתנאי כי כל אחד מהם מוצגים עירור שאינם חופפים, ספקטרום הפליטה.

איור 2, ביצענו על אותו ניסוי גירוי העצב על הסרעפת של a P4 Myf5-Cre; GCaMP3 מותנה-הבעת העכבר, צילמו את התגובות^{2 +} Ca בתאי השריר. מעניין, כאשר השתמשנו את החוסם צולבות הקישור חוטים שרירן BHC או את השלד השרירים ספציפיים ממותגת מתח ערוץ נתרן (Na_v1.4) חוסם ממוצע-conotoxin (איור 2A ווידאו 3 או איור 2B ו- וידאו 4, בהתאמה) , אנו דמיינו Ca^{2 +} תופעות מעבר לנוע באורך מלא של סיבי השריר, המייצג את הפעולה הפוטנציאליים, מתווכת על ידי השחרור של Ca^{2 +} את רשת sarcoplasmic, או רק את האורך של הלהקה endplate, המייצגים endplate פוטנציאליים, מתווכת על ידי Ca^{2 +} זרם חוץ-תאית באמצעות התוספת AChR.In לזיהוי subpopulations של תאים מגיבה בעוצמה פלורסצנטיות המרחבי מפות (מפות SD), כמו באיור 1, מדדנו גם את השינוי בזריחה לאורך זמן בקרב אוכלוסיה של תאי שריר אלה עם ייתכן (רח') מפות. כל אחד הניסויים מייצג סוג תאים שונים, לגיל שונה, טיפול שונה (גירוי לעומת עצבי גירוי עצבי בנוכחות תרופות שונות), סוגים שונים של ניתוח (המרחבי לעומת זמן-מרחבי עוצמת קרינה פלואורסצנטית מפות). נתונים אלה גם ממחישים את אחת התכונות השימושיות ביותר של ביטוי GCaMP העכברים הטרנסגניים, כלומר היכולת שוב ושוב מעוררים, תמונה באותה דגימת זרע, לכן, לבחון את ההשפעה של תנאי טיפול שונה.

איור 1: מדידה של פעילות-induced שוואן תא Ca^{2 +} תגובות הסרעפת, עצב הסרעפת של P7 Wnt1-Cre; עכברים מותנה GCaMP3 . (א) (משמאל) תמונה עוצמת קרינה פלואורסצנטית הממוצע, מציג רקע רמות של זריחה בשוואן תאים לאורך הענפים עצב הסרעפת, בצומת neuromuscular (NMJ), נפל בשבי לפני גירוי עצבי (Prestim). הערכים של זריחה הרקע הזה היו המופחת פלורסצנטיות הערכים שהתקבלו לאחר גירוי עצבי. (מימין) המפה המרחבית של סטיית התקן של יחידות עוצמת קרינה פלואורסצנטית 16 סיביות (SDiu₁₆) של Ca^{2 +} תגובות שנוצר לאחר 30 s של 40 הרץ של גירוי עצב הסרעפת (מפת סאונד או SD מפה) מציג לתגובה חזקה המסוף/perisynaptic שוואן תאים (TPSCs) ב- NMJ. Heatmap טבלת צבעים האש הוא SDiu₁₆ , סרגל קנה מידה מיקרון. כל התמונות פאנלים B - E הינם ההגדלה זהה לאלה פאנל A. (B) (משמאל) הסרעפת באותו סומן עם מצומדת 594 α-bungarotoxin (α-BTX), אשר נקשר תוויות קולטני אצטילכולין (AChRs) ואני מתרגש עם אור ירוק/צהוב כדי לזהות את NMJ. (מימין) לוח זה מציג תמונת brightfield של הסרעפת אותו, מראה את הקצה של אלקטרודה הקלטה תאיים (חץ), אשר ניתן הנחיות של NMJ, בהתבסס על α-BTX תיוג. (ג) רשות האישורים^{2 +} ארעי תכונות (למשל, העוצמה, תחילת לאחר גירוי, משך) של תאים בודדים או קבוצות של תאים יכול להיות מוערך על ידי התוחם אזורים בודדים במפת בעוצמה המרחבי כחלקיקים (משמאל), ייצוג אותם אזורים כמו בצבעים של הריבית (ROIs) ו- (ד) התוויית עוצמות שלהם לאורך זמן. (E) לוח זה מציג תמונות כפולה באורך הגל של בתיווך GCaMP3 פלורסנט Ca^{2 +} תגובות NMJs 594-α-שכותרתו ' הסרעפת אותו באמצעות המפצל התמונה תאומים לאחר גירוי עצבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

וידאו 1: הסרט בלי תמונה פיצול של פעילות-induced תאי שוואן Ca ^{2 +} תגובות ב P7, כמתואר בפירוט רב איור 1 האגדה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

סרטון 2: סרט עם התמונה פיצול של פעילות-induced תאי שוואן Ca ^{2 +} תגובות ו- 594- Α-BTX-שכותרתו ' AChRs-P7, כמתואר בפירוט רב איור 1 האגדה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

איור 2: מדידה של שריר הנוצרות על-ידי פעילות תא Ca^{2 +} תגובות ב הסרעפת של P4 Myf5-Cre; עכברים מותנה GCaMP3 . (א) AChR (שמאל) Nicotinic אשכולות של הלהקה endplate במיקום מרכזי של הסרעפת מסומנים בכיתוב 594-α-BTX. (האמצעי) המפה המרחבית של Ca^{2 +} ארעי עוצמות (SD מפה), שנוצר לאחר 30 s של 40 הרץ של גירוי עצב הסרעפת בנוכחות החומר המדכא צולבות הקישור חוטים שרירן BHC, מראה תגובה ברחבי האזור כולו של כל תאי שריר הסרעפת. (מימין) לעומת זאת, מפה של SD המופקים הסרעפת אותו לאחר גירוי זהה, אך בנוכחות של נה_v1.4 אנטגוניסט ממוצע-conotoxin (ממוצע-אקס), תערוכות מוגבל לתגובה באזור המדיאלי של כל שריר הסרעפת תאים זה מקביל הלהקה endplate מועשרת אשכול AChR. Heatmap טבלת צבעים האש הוא SDiu₁₆ , סרגל קנה מידה מיקרון. (B) לוח זה מציג מפות זמן-מרחבי של Ca^{2 +} עוצמות ארעי לאורך זמן (סט מפות) אוכלוסיה של תאי שריר (y-ציר) אחריו לאורך זמן (x-ציר). סרגל קנה מידה היא בשניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

וידאו 3: סרט של תא השריר הנוצרות על-ידי פעילות Ca ^{2 +} תגובות בנוכחות החוסם צולבות הקישור חוטים שרירן BHC-P4, כמתואר בפירוט רב איור 2A האגדה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

וידאו 4: סרט של תא השריר הנוצרות על-ידי פעילות Ca ^{2 +} תגובות בנוכחות Na _v אנטגוניסט 1.4 ממוצע-conotoxin-P4, כמתואר בפירוט רב איור 2B האגדה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Discussion

כאן אנו מספקים דוגמאות של מדידת Ca^{2 +} תגובות תאים מסוימים ברקמת עצב-שריר שלם, שימוש בעכברים לבטא GECI. על מנת לבצע בהצלחה ניסויים אלה, זה הכרחי כדי לא לפצוע את עצב הסרעפת בזמן. לשיקוף Ca^{2 +} תגובות בתאי שוואן בעוצמה נמוך או גבוה (כלומר, 20 X או 60 X), יש צורך להשתמש BHC או ממוצע-conotoxin חסום לתנועה. עבור צריכת חשמל נמוכה הדמיה של Ca^{2 +} תגובות בתאי השריר, זה ניתן למדוד אותם בהיעדרו של תרופות אלו, וכך מאפשר רכישה סימולטני של שריר Ca^{2 +} ארעי עוצמות ושרירים אורך שינויים במהלך גירוי עצבי בתדר גבוה⁶. בעת ביצוע ניסויים מרובים על הדגימה זהה, זה הכרחי להפריד בין כל אחד מהם על ידי לפחות 15 דקות, שבמהלכן ניתן perfused את הדגימה. שלבים אלה מאפשרים ההדמיה חוזרות ונשנות של גירוי-induced Ca^{2 +} תגובות של שדה הראייה באותו המדגם אותו לפחות 3-5 שעות. חשוב גם לסמים predilute מומס דימתיל סולפוקסיד כמתואר BHC, כמו דימתיל סולפוקסיד שהוחלו ישירות על גבי רקמות לבטא GCaMP מעוררת תגובות בלתי הפיך, גירוי תלויית קרינה פלואורסצנטית.

מצאנו כי מסיבות לא ברורות Wnt1-Cre; conditionalGCaMP3/6 עכברים להיכשל שהפגינו גירוי עצבי או אגוניסט-induced Ca^{2 +} תגובות בתאי שוואן לאחר P15 - P20. עם זאת, Sox10-Cre; עכברים GCaMP3 מותנה/6 ממשיך להציג תגובות אלה לפחות מאוחר ככל P56, העידן העתיק אשר בחנו. לעומת זאת, עכברים Myf5-מותנה GCaMP3/6 התערוכה תגובות בגילו של שנה אחת, העידן העתיק בחן.

בעוד עכברים המבטאים GECI לספק הזדמנויות ייחודיות הדמיה Ca^{2 +} תגובות כל האוכלוסיות של תאים של תת סוג ספציפי, ישנן כמה מגבלות, כגון חוסר היכולת לבצע הדמיה רציומטרי ולחלץ, לפיכך, Ca כמותיים ^{2 +} מדידות. ישנן גם מגבלות על כמות עומק של רקמות שממנו תגובות אלה יכולים לדימות באמצעות מיקרוסקופ זריחה widefield (כלומר, בניגוד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או multiphoton). לכן, בעוד דלילות הסרעפת לשכנוע היישום של טכניקות המובאת כאן, לכידת תא ספציפי Ca^{2 +} תגובות בסוגי תא NMJ של שרירים אחרים כי הם עבים עשויים לדרוש ניתוח תת או סוגים אחרים של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.

אלה כלים גנטיים אופטי מייצגות קידום משמעותי של מעל הקודם Ca^{2 +} הדמיה טכניקות, לפיו רק סוגי תאים מרובים או מספר תאים בודדים בתוך סוג תא אחד יכול לדימות. יתרון נוסף הוא כי Ca^{2 +} תגובות יכול repeatably לדימות במשך פרקי זמן ארוכים מתאי לאותו שימוש בעכברים GECI, ואילו הדבר אינו אפשרי בקלות שימוש מסורתי הכימי Ca^{2 +}-איגוד צבעי פלורסנט. בסופו של דבר, באמצעות הפיצול של התמונה, אנחנו לבצע הדמיה כפולה באורך הגל של אות דינאמיים בתוך תא אחד סוג (תאי שוואן) ותווית קבוע בתוך שנייה (תאי שריר), לפיכך, להראות איך מרובות תאים ספציפיים סידן או מתח תגובות יכול להיות מוערך ( למשל, עכבר תאי שוואן Cre-נהיגה חצה עכבר GCaMP תלויי-Cre מותנה כפי שדווח כאן, עבר עכבר שאינו תלוי-Cre לבטא שריר ספציפי תא GECI או GEVI עם עירור קרינה פלואורסצנטית שאינם חופפים / ספקטרום הפליטה¹⁰, תאפשר מעקב בו זמנית של Ca^{2 +} ו/או מתח שינויים דינמיים בתאי שוואן והן שריר). כלים כאלה יכול לעזור להעריך אם תגובת תא אחד מסוג גירוי ספציפי, כגון של פורין ATP או אדנוזין המוצר שלה התמוטטות, הוא ישיר או עקיף בתיווך על ידי השפעה ישירה על סוג אחר של התא ב- NMJ.

המטרה העיקרית של מחקרים אלה כדי להעריך את ייתכן Ca^{2 +} תגובה דפוס של תת תא כדי גירוי עצבי, אך הטכניקות שבהן משתמשים כדי להשיג זאת יכולה להיפרס לעבר מטרות אחרות. למשל, הם יכולים לשמש כדי לנתח Ca^{2 +} תגובות בנוכחות היריבים מסוימים או רקעים מוטציות מסוימות, כמו למשל במודלים של בעלי חיים מסוימים של מחלות נוירון מוטורי, ניוון שרירים או מחלת השן שארקו-מארי, כדי לנתח Ca^{2 +} בתגובה אגוניסטים ספציפיים כדי להעריך ביטוי הקולטן, כדי להעריך את הטרוגניות של תגובה^{2 +} Ca התכונות בתוך תת סוג התא לגירוי, או להשוות Ca^{2 +} תגובות בתת סוג התא אחרים פונקציונלי תגובות בתוך סוג זה (פוטנציאל endplate או פעולת השריר electrophysiologically המוקלט, לקיצור שרירים הדמיה אופטית, מתח שרירים כוח מתמר-מוקלטת, וכו ') או פרמטרים אחרים (למשל, פוסט הוק הערכה של עצב/שריר תאי שוואן מורפולוגיה או ביטוי מולקולרית באמצעות אימונוהיסטוכימיה). יחד, מחקרים אלה מראים כמה תאים ספציפיים GECI או עכברים GEVI יכול לשמש כדי להאיר על מגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים-סינפסה מורכב תשומות גנטית לזיהוי, תא ספציפי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myf5-Cre mice	Jax	#007893	Drives muscle cell expression as early as E136
Wnt1-Cre mice	Jax	#003829	Drives expression into all  Schwann cells at E13 but not P209
Sox10-Cre mice	Jax	#025807	Drives Schwann cell expression at older ages
Conditional GCaMP3 mice	Jax	#029043	Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion
Conditional GCaMP6f mice	Jax	#024105	Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion
BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)	Hit2Lead	#5102862	Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ
µ-conotoxin GIIIb	Peptides Int'l	#CONO20-01000	Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8
Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel .9KG	Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins
Minutien pins (0.1mm diameter)	Fine Science Tools	26002-10	Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel
Eclipse FN1 upright microscope	Nikon	MBA74100	Allows staging and observation of specimen
Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator	Autom8	MXMScr	Allows movement of specimen
Manual micromanipulator	Narishige	M-152	Holds recording and stimulating electrodes
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Axoclamp 900A	Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording
Microelectrode low-noise data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1550	Allows electrophysiological data acquisition
Microelectrode data analysis system	Molecular Devices	PCLAMP 10 Standard	Performs electrophysiological data analysis
Square wave stimulator	Grass	S48	Stimulates nerve to excite muscle
Stimulus Isolation Unit	Grass	PSIU6	Reduces  stimulation artifacts
Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter	Sutter	FG-GBF100-50-15	Impales and records nerve-evoked muscle potentials
Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter	Sutter	BF150-117-15	Lengthened and used for suction electrode
Micropipette Puller	Sutter	P-97	Pulls and prepares recording electrodes
1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera	Photometrics	Prime 95b	Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging
Light Source	Lumencor	Spectra X	Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation
Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm	Nikon	CFI60	Provide long working distances for visualization of specimen
Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp	Sumita	LS-DWL-N	Provides illumination for brightfield observation
W-View Gemini Image Splitter	Hamamatsu	A12801-01	Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera
Single-band Bandpass Filters  (512/25-25 and 630/92-25)	SemRock	FF01-512/25-25; FF01-630/92-25	Permits dual band imaging
560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging
Imaging data acquisition system	Nikon	NIS Elements - MQS31000	Allows imaging data acquisition
Wavelength control module	Nikon	MQS41220	Module for imaging data acqusiition
Emission splitter hardware module	Nikon	MQS41410	Module for imaging data acqusiition
Imaging data analysis system	NA	Volumetry 8D5, Fiji	Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data