Ex Vivo Beeldvorming van cel-specifieke Calcium signalering in de tripartiete Synaps van het middenrif muis

Summary

Hier presenteren we een protocol bij afbeelding calcium signalering bij populaties van individuele celtypes op de lymfkliertest motorische eindplaat.

Abstract

De elektrische activiteit van cellen in weefsels door elektrofysiologische technieken kan worden gecontroleerd, maar deze zijn meestal beperkt tot de analyse van afzonderlijke cellen. Aangezien een verhoging van intracellulair calcium (Ca^{2 +}) in het cytosol wordt vaak door de elektrische activiteit veroorzaakt, of in antwoord op een groot aantal andere stimuli, dit proces kan worden gecontroleerd door de beeldvorming van cellen geladen met fluorescerende calcium-gevoelige kleurstoffen.  Het is echter moeilijk om het imago van deze reactie in een afzonderlijke celtype binnen hele weefsel, omdat deze kleurstoffen worden overgenomen door alle celtypes in het weefsel. In tegenstelling, genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) kunnen worden uitgedrukt in een afzonderlijke celtype en lichten in antwoord op een verhoging van intracellulaire Ca^{2 +}, dus de beeldvorming van Ca^{2 +} signalering in hele bevolkingen van het toelaat individuele celtypes. Hier, wij het gebruik van de GECIs GCaMP3/6 van toepassing op de muis motorische eindplaat, een tripartiete SYNAPS tussen motorische neuronen, skeletspieren en terminal/perisynaptic cellen van Schwann. We tonen het nut van deze techniek in klassieke ex vivo weefsel preparaten. Met behulp van een optische splitter, voeren wij dual-golflengte beeldvorming van dynamische Ca^{2 +} signalen en een statische label van de motorische eindplaat (NMJ) in een benadering die kan gemakkelijk aangepast worden aan twee cel-specifieke GECI of genetisch gecodeerde spanning controleren indicatoren (GEVI) tegelijk. Tot slot bespreken we de routines gebruikt voor het vastleggen van ruimtelijke kaarten van de intensiteit van de fluorescentie. Samen kunnen deze optische, transgene en analytische technieken worden toegepast om te bestuderen van de biologische activiteit van afzonderlijke cel subpopulaties op de NMJ in een breed scala van contexten.

Introduction

De NMJ, zoals alle synapsen, bestaat uit drie elementen: een presynaptische terminal afgeleid van een neuron, een postsynaptisch neuron/effector cel, en een perisynaptic gliale cel^1,2. Terwijl de basisaspecten van synaptische transmissie werden eerst gedemonstreerd op deze synapse³, blijven vele aspecten van dit proces onbekend, gedeeltelijk als gevolg van de expressie van de dezelfde moleculen door de verschillende cellulaire elementen van deze synapsen. Bijvoorbeeld, worden receptoren voor zowel de purine adenine nucleotide ATP en acetylcholine (ACh), die mede door motorische neuronen bij de gewervelde NMJ zijn vrijgegeven, uitgedrukt door spieren, cellen van Schwann en motorische neuronen, dus de interpretatie van een complicerende functioneel effect uitgeoefend door deze stoffen (b.v., zender release of reactie, spier strijdkrachtgeneratie)⁴. Bovendien, hoewel de tripartiete componenten van de NMJ eenvoudig zijn in vergelijking met, bijvoorbeeld neuronen in het centrale zenuwstelsel die vaak meerdere synaptic ingangen vertonen, of motorische neuronen, spiercellen, of cellen van Schwann in reactie op stimuli op basis verschillen op hun intrinsieke heterogeniteit (bijvoorbeeldembryonale afleiding, vezel subtype, morfologie) is onduidelijk. Om elk van deze kwesties, zou het voordelig voor het gelijktijdig het bijhouden van de reactie van veel cellen binnen één synaptic element, evenals spoor, op hetzelfde moment, een dergelijk antwoord op een van de andere afzonderlijke elementen. Conventionele strategieën door middel van chemische kleurstoffen te meten calcium signalering niet kunnen deze twee doelen, bereiken omdat Bad-toegepast kleurstof in beslag door meerdere celtypen na toepassing aan weefsel genomen wordt, en intracellulair geladen kleurstof kan alleen worden gebruikt om te visualiseren individuele of kleine cohorten van cellen. Hier, met behulp van transgene muizen uiting van GECIs ontworpen voor de meting van de cel-specifieke calcium signalering, samen met specifieke imaging en software tools⁵, we tonen de eerste van deze twee algemene doelstellingen en bespreken hoe de toevoeging van nieuwe transgene hulpmiddelen zou helpen met het bereiken van de tweede. Deze techniek zal zitten nuttig voor iedereen die geïnteresseerd is in het bijhouden van calcium dynamics of andere cellulaire gebeurtenissen waarneembare signalering via gen gecodeerde optische sensoren in meerdere cel populaties op hetzelfde moment.

Protocol

Veeteelt en experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de nationale instituten van gezondheid gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en de IACUC bij de Universiteit van Nevada.

1. bereiding van het pessarium en de Phrenic van de zenuwen van transgene muizen

1. Aankoop transgene muizen en oligonucleotide inleidingen te genotype deze muizen.
   Opmerking: De inleidingen zijn vermeld op de pagina 'Informatie' voor elk van deze muizen.
   1. Fokken van een 3 - tot 6-maand-oude muis uiting van één exemplaar van de passende transgene/knock-in Cre-driver allel en nul kopieën van het voorwaardelijke GCaMP3/6 -allel met een tweede muis van dezelfde leeftijd uiting geven aan een of twee exemplaren van de voorwaardelijke GCaMP3 / 6 -allel en nul kopieën van het Cre-driver-allel.
   2. Genotype de pups en mark degene die zowel Cre en voorwaardelijke GCaMP3/6 allelen — deze zullen voortaan worden genoemd dubbel-transgene muizen (bijvoorbeeld Myf5-Cre, voorwaardelijke GCaMP3)⁶.
      Opmerking: Op deze manier alle gegevens zal ontlenen muizen uiting van één exemplaar van de Cre zowel voorwaardelijke GCaMP3/6 allelen. Dit is vooral belangrijk als in andere mutant muizen (b.v., uitsparingen) toe te voegen aan deze kruizen.
2. Wanneer de dubbele-transgene muizen zijn van de juiste leeftijd (bv, postnatale dag 0 of 5 [P0 of P5] of volwassen), de muizen gewoon door het onthoofden van hen met een schaar (voor muizen jonger dan P10) of door ze te plaatsen in een zaal van de inademing Isofluraan euthanaseren — wanneer ze zijn niet langer inspelen op de staart met een paar pincet te knijpen, ze zijn klaar voor offer.
3. Het dier offeren door onthoofding met een schaar.
4. Sectie dwars over het gehele dier net onder de lever en net boven het hart en de longen met een iridectomy schaar.
5. Ontleden weg de lever, het hart en de longen, voorzichtig om een lengte van de phrenic zenuw die voldoende lang is om te worden getrokken in het een zuiging-elektrode (d.w.z., 1-2 cm).
   Opmerking: De linker phrenic zenuw kan worden geïdentificeerd als een wit stukje weefsel waarmee u invoert van de mediale gedeelte van het linker diafragma. Het moet niet worden verminderd bij het verwijderen van de longen. De juiste phrenic zenuw loopt in een stuk van de fascia die ook bevat de superieure vena cava en dunner en witter dan de vena cava. Samen, doordringen ze allebei het recht mediale middenrif.
6. Verder de ribbenkast en de wervelkolom, met uitzondering van de dunne rand rond het middenrif te verwijderen.
7. Plaats het middenrif en de phrenic zenuw monster in een microfuge buis met Krebs-Ringer-oplossing met 1 µg/mL 594-αBTX voor 10 min in het donker.
   Opmerking: Deze concentratie van 594-αBTX etiketten ACh-receptoren (AChRs) zonder hun functie (persoonlijke observatie) blokkeren.

2. stimulatie en opname van de spier-actie-mogelijkheden

1. Met behulp van minutien pinnen, het middenrif immobiliseren door vastzetten op een 6-cm schotel bedekt met diëlektrische siliconengel en gevuld met ~ 8 mL zuurstofrijk Krebs-Ringer-oplossing en plaatst u deze op het podium van de Microscoop. Perfuse het middenrif met meer Krebs-Ringer-oplossing (8 mL/min) voor 30 min.
   Opmerking: Dit rinses van de niet-afhankelijke 594-αBTX, evenals equilibrates van het weefsel na dissectie.
2. Het maken van een zuignap elektrode volgens de gevestigde methoden⁷.
   1. Op 4 X vergroting, met behulp van een micromanipulator, de zuig elektrode overgaan in de linker phrenic zenuw en afzuigen door te trekken uit het vat van een 5 mL-spuit verbonden met de slang die is gekoppeld aan de zuiging elektrode.
      Opmerking: Als u met succes tekenen in de zuig elektrode, de phrenic zenuw is strak. Zet de stimulator aan en stimuleren de phrenic zenuw door flipping de handmatige schakelaar 1 x.
   2. Zorg ervoor dat het middenrif in reactie op de 1-Hz-stimulatie contracten door visueel onderzoek van het met helderveld verlichting. Als dat niet het geval is, de kruisspanning door te draaien aan de knop spanning stapsgewijs om een puls-supramaximal, die door een visueel onderzoek van de spiercontractie kan worden geverifieerd. Als nog niet zichtbaar, de zenuw blazen met de spuit en proberen te trekken het opnieuw door het toepassen van zuiging.
3. Uitschakelen van de perfusie en de spier-specifieke myosin remmer BHC⁶ of de spanning-gated natrium kanaal antagonist µ-conotoxin⁸ toevoegen om een eindconcentratie van 100 µM.
   1. Om 100 µM BHC, Pipetteer 4 µL van 200 mM voorraad in DMSO en predilute het in 1 mL Krebs-Ringer-oplossing.
   2. 1 mL van Krebs-Ringer-oplossing verwijderen uit de schotel.
   3. De prediluted BHC, aan het gerecht toevoegen.
      Opmerking: Deze predilution voorkomt dat de inductie door onverdund DMSO van een niet-voorbijgaande fluorescerende antistofrespons uiting van GCaMP3 cellen.
   4. 30 min wachten en schakel vervolgens, op de perfusie van verse Krebs-Ringer-oplossing voor een ander 20-30 min.
4. De opname-elektrode voor te bereiden.
   1. Dragen handschoenen, een filamented borosilicaatglas met een buitendiameter (OD) van 1 mm en een binnendiameter (ID) van 0,4 mm plaats in een micropipet trekker en draai de wijzerplaten om klem het naar de gewenste positie. Sluit de deur van de trekker.
   2. De volgende instelling met behulp van een P-97 puller, program: warmte op 900, trek op 120, snelheid op 75, tijdstip 250, druk op 500, en geen extra lussen.
      Opmerking: Resistance (R) is gemeten met behulp van de besturingselementen van de software van de versterker: de data acquisitie software bevestigt weerstand door het oplossen van de formule V = IR. De controller software passeert een bekende stroom (I) (meestal 1 nA) door de elektrode en meet de verandering in spanning (V), zodat wij voor R. op te lossen
   3. Voor embryonale pessarium, ervoor zorgen dat de weerstand in de buurt van 60 MΩ en voor oudere pessarium, 10-20 MΩ. De opname-elektrode met 3 M KCl laden.
5. Op 10 X vergroting, verlaagt u de elektrode in de spier, met behulp van een tweede micromanipulator aan de andere kant van het werkgebied als een stimulerende elektrode.
6. Met behulp van elektrofysiologische data acquisitie software, wachten totdat de rustpotentiaal membraan van 0 in-65 verandert mV of lager.
7. Stimuleren van 1 Hz en controleer of de aanwezigheid van een actiepotentiaal spier door te controleren voor een groot potentieel, dat een bescheiden overschrijding vertoont (potentieel dat boven 0 stijgt mV wanneer bij-65 begint mV of lager). Verwar niet stimulatie artefact met een actiepotentiaal.
   Opmerking: Potentials zijn aanzienlijk langer in duur (~ 5 ms) dan stimulatie artefacten.

3. beeldvorming van de fluorescentie van het monster

1. Op 20 X vergroting, de eindplaat band in het midden van de spier te vinden door te zoeken naar 594-αBTX-label NMJs onder groen/geel licht excitatie (550 nm). Overschakelen naar de blauwe lichte excitatie (470 nm) naar afbeelding Ca^{2 +} antwoorden in de spier, motor neuron of cellen van Schwann.
2. Indien gewenst, instellen de afbeelding splitter met bandpass filters en een dichroïde single-rand-filter voor de beeldvorming van de dual-golflengte.
3. Oog op de berekening van de maximale fluorescentie (Fmax) tentoongesteld door GCaMP3/6-uiten weefsel, toevoegen u 12 µL van 3 M kaliumchloride (KCl) aan de middenrif preparaten⁶.
   1. Experimenten met de brightness-balk op de lookup tabel bar ingesteld op 110% van het niveau waarop het weefsel GCaMP3/6-uiten verzadiging op 20 X vergroting, vertoont zonder weggooien in reactie op KCl uitvoeren.
4. Een snelle gebeurtenissen registreren bij 20 kaders per seconde om niet missen.
5. Met 1-45 s van 20-40 Hz van zenuwstimulatie stimuleren door het leveren van een trein van impulsen met behulp van de zuiging elektrode of farmacologische agonisten toevoegen door Bad toepassing of door perfusie en dynamische fluorescerende Ca^{2 +} antwoorden in één cel subtype verzamelen samen met het statische 594-αBTX NMJ signaal.
   Opmerking: Als weefsel-specifieke rode of far-red GECI of GEVI muizen beschikbaar voor gebruik op de NMJ komen, ze kunnen worden gebruikt voor het verzamelen van twee dynamische signalen als gevolg van twee verschillende cellulaire elementen op de NMJ.
6. Wanneer de imaging of elektrofysiologische experimenten worden voltooid omdat de gewenste resultaten zijn bereikt, perfuse van water door de linies perfusie en zuigen water 2 x - 3 x door de zuigkracht elektrode om ervoor te zorgen dat zouten niet doen opbouwen.

4. uitvoer en analyse van de gegevens door een standaarddeviatie kaart van fluorescentie intensiteit (SD_iu16)

1. Record beeldsequenties opgenomen als 16-bits TIFF-stapels en laad ze in de gewenste beeldvorming gegevens analysesysteem voor analyse.
2. Selecteer afbeeldingsstapel van belang in de software van de 8d bestandsmenu, en klik om te laden.
   1. Zodra de video is geladen, scannen door de tijd om te identificeren van een sectie die geen cellulaire fluorescerende activiteit.
      Opmerking: Deze regio zal worden gebruikt om een monster van de achtergrond.
   2. Houd SHIFT ingedrukt en klik om het tekenen van een regio van belang (ROI) vak in het gebied aangewezen als het voorbeeldgebied achtergrond.
   3. Na het maken van het vak, druk op de SPATIEBALK voor het genereren van een perceel van achtergrond activiteit wijzigen.
   4. Met de rechtermuisknop op het spoor en de diverse optie de optie voorleggen Dump ROI tekstnotatie te maken van het spoor als een xy-coördinaat tekstbestand.
3. Terug naar de video van belang, scan opnieuw ter identificatie van de regio van de tijd waar de activiteit van belang plaatsvindt.
   1. Selecteer de regio van deze tijd met de middelste muisknop in het gele vak.
   2. Klik met de rechtermuisknop op de video en selecteer Stapel OPS en vervolgens Stat kaart optie 5.
      Opmerking: Dit zal genereren een standaarddeviatie-kaart (SD kaart) in het linker venster.
   3. Klik op de SD-kaart en vervolgens druk op de ] sleutel 19 x toepassen de gewenste kleur warmte-kaart.
   4. Met de rechtermuisknop op de SD-kaart en selecteer STM laden en opslaan, die de optie Opslaan als TIFF-stm te redden van de SD-kaart zal presenteren.
   5. Dan, druk op de [ sleutel 19 x terug te keren naar een kleurplan grijswaarden.
   6. Druk op C en vervolgens op D om dichtheid toewijzing hulpmiddelen. Gebruik de linker muisknop en muisknop in het midden, pas de drempel tot alle fluorescerende activiteit wordt weergegeven in de SD-kaart.
   7. Druk op C om de dichtheid tools met behoud van de drempel-instellingen te sluiten.
   8. Met de rechtermuisknop op de SD-kaart en selecteer STM deeltjes en dan Vinden PTCLS.
      Opmerking: Dit zal identificeren van afzonderlijke cellen uiten van fluorescerende activiteit.
   9. Nogmaals met de rechtermuisknop op de SD-kaart en selecteer Maken Particle ROIs.
      Opmerking: Dit zal de geselecteerde cellen op de oorspronkelijke video van belang superponeren.
   10. Houd SHIFT ingedrukten klik met de rechtermuisknop op een van de nu vastgestelde deeltje ROIs op de oorspronkelijke video.
   11. Selecteer ROI Marker en maatregel Int in ROI.
       Opmerking: Dit zal individuele fluorescerende activiteit percelen genereren voor elke geïdentificeerde ROI in de video van belang. Deze kunnen worden gered door met de rechtermuisknop op een van deze en selecteren Assorted, gevolgd door Dump ROI als tekst.
4. Raadpleeg voor gedetailleerde logica ten grondslag liggen aan deze operaties, de bron code bestand⁹.

Representative Results

Verschillende voorbeelden van fluorescentie intensiteit veranderingen, gemedieerd door verhogingen van intracellulaire Ca^{2 +} binnen de gedefinieerde celtypes van het NMJ, tonen het nut van deze aanpak. Deze resultaten worden gepresenteerd als ruimtelijke fluorescentie intensiteit kaarten, waarmee de locatie van de reagerende cellen, alsmede de intensiteit van hun antwoorden, zodat voor de beoordeling van hoeveel cellen reageren en hoeveel elke cel reageert op een bepaalde stimulans. Bijvoorbeeld, zoals in Figuur 1weergegeven, namen we video's van de Ca^{2 +} antwoorden in een populatie van terminal/perisynaptic Schwann cellen (TPSCs) op de NMJs van het middenrif van een P7 Wnt1-Cre; voorwaardelijke GCaMP3-uiten muis in reactie op de stimulatie van de phrenic zenuw en de subpopulaties van de reagerende cellen door ruimtelijke fluorescentie intensiteit kaarten zijn geïdentificeerd. Deze kaarten van de intensiteit van de fluorescentie worden gepresenteerd zoals warmte kaarten en volgens een brand kleur opzoektabel (brand CLUT vergelijkende). We registreerden deze video's met en zonder splitsing van de afbeelding tegelijk bekijken de clusters van α-BTX-label AChRs in het midden van het middenrif (video's 1 en 2), een aanpak die gemakkelijk aangepast worden kan aan het dynamische GECI of GEVI vastleggen reacties van twee verschillende cel typen, op voorwaarde dat elk van hen niet-overlappende excitatie en emissie spectra vertoont.

In Figuur 2, we het dezelfde zenuw stimulatie experiment uitgevoerd op het membraan van een P4 Myf5-Cre; voorwaardelijke GCaMP3-uiting van muis en beeld van de Ca^{2 +} antwoorden in spiercellen. Interessant is dat wanneer we gebruikten de myosin blocker BHC of de skeletal muscle-specifieke spanning-gated natrium kanaal (nb_v1.4) blocker µ-conotoxin (figuur 2A en 3 van de Video of figuur 2B en Video 4, respectievelijk) , we gevisualiseerd Ca^{2 +} transiënten die de volledige lengte van de spiervezel, reizen de actie potentieel en gemedieerde door het vrijkomen van Ca^{2 +} van het sarcoplasmic reticulum, of alleen de lengte van de band eindplaat vertegenwoordigen, vertegenwoordigen de eindplaat potentiële en gemedieerde door extracellulaire Ca^{2 +} toestroom via de AChR.In toevoeging aan het identificeren van de subpopulaties van reagerende cellen met ruimtelijke fluorescentie intensiteit kaarten (SD kaarten), zoals in Figuur 1, wij ook gemeten naar de verandering in fluorescentie na verloop van tijd van een populatie van deze spiercellen Spatio (ST) kaarten. Elk van deze experimenten vertegenwoordigt een verschillende celtype, een andere leeftijd, een andere behandeling (zenuw stimulatie vs. zenuwstimulatie in aanwezigheid van verschillende drugs) en verschillende soorten analyse (ruimtelijke vs. Spatio intensiteit van de fluorescentie kaarten). Deze cijfers illustreren ook één van de nuttigste eigenschappen van transgene muizen van de GCaMP-uiting, namelijk de mogelijkheid om herhaaldelijk stimuleren en beeld hetzelfde monster- en, dus, het testen van het effect van verschillende behandeling voorwaarden.

Figuur 1: Meting van de activiteit-geïnduceerde Schwann cel Ca^{2 +} antwoorden in het middenrif en de phrenic zenuw van de P7 Wnt1-Cre; voorwaardelijke GCaMP3 muizen. (A) (links) een gemiddelde fluorescentie intensiteit afbeelding, toont achtergrondniveaus van fluorescentie in Schwann cellen langs de phrenic zenuw takken en op de motorische eindplaat (NMJ), werd gevangen voordat zenuwstimulatie (Prestim). De waarden van deze achtergrond fluorescentie werden afgetrokken van fluorescentie verkregen na zenuwstimulatie waarden. (Rechts) Een ruimtelijke kaart van de standaarddeviatie van 16-bits fluorescentie intensiteit eenheden (SDiu₁₆) van Ca^{2 +} reacties gegenereerd na 30 s van 40 Hz van phrenic zenuwstimulatie (Stim kaart of SD-kaart) toont een robuuste reactie in de terminal/perisynaptic Schwann cellen (TPSCs) op de NMJ. De brand CLUT heatmap is in SDiu₁₆ en de schaal bar is in micron. Alle beelden in panelen B - E zijn de dezelfde vergroting als die in deelvenster A. (B) (links) het dezelfde middenrif was gelabeld met 594-geconjugeerde α-bungarotoxin (α-BTX), die zich bindt aan en etiketten van acetylcholine-receptoren (AChRs) en opgewonden met groen/geel licht om te identificeren van de NMJ. (Rechts) Dit paneel toont een helderveld beeld van de zelfde diafragma, tonen de tip van een intracellulair opname-elektrode (pijl), die kan worden geleid naar een NMJ, gebaseerd op het labelen van α-BTX. (C) de Ca^{2 +} tijdelijke functies (b.v., intensiteit, begin na stimulatie, duur) van afzonderlijke cellen of groepen cellen kan worden geëvalueerd door de afbakening van de afzonderlijke regio's in de ruimtelijke intensiteit kaart als deeltjes (links), die hen vertegenwoordigen als gekleurde gebieden van belang (ROIs) en (D) hun intensiteiten plotten na verloop van tijd. (E) dit paneel toont de dual-golflengte beelden van GCaMP3-gemedieerde fluorescerende Ca^{2 +} reacties en 594-α-label NMJs in de zelfde diafragma met behulp van de Gemini afbeelding splitter na zenuwstimulatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Video 1: film zonder afbeelding splitsen van activiteit-geïnduceerde Schwann cel Ca ^{2 +} reacties op P7, zoals in detail beschreven in de Figuur 1 legend. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Video 2: film met afbeelding splitsen van activiteit-geïnduceerde Schwann cel Ca ^{2 +} reacties en 594- Α-BTX-label AChRs op P7, zoals in detail beschreven in de Figuur 1 legend. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Figuur 2: Meting van de activiteit-geïnduceerde spier cel Ca^{2 +} antwoorden in het middenrif voor P4 Myf5-Cre; voorwaardelijke GCaMP3 muizen. (A) (links) nicotinerge AChR clusters van de centraal gelegen eindplaat band van het middenrif worden aangeduid met 594-α-BTX. (Midden) Een ruimtelijke kaart van Ca^{2 +} voorbijgaande intensiteit (SD kaart), gegenereerd na 30 s van 40 Hz van phrenic zenuwstimulatie in aanwezigheid van de myosin remmer BHC, toont een reactie in de hele regio van alle middenrif spiercellen. (Rechts) In tegenstelling, een SD-kaart gegenereerd op basis van het dezelfde middenrif na de dezelfde stimulatie, maar in het bijzijn van de nb_v1.4 antagonist µ-conotoxin (µ-CTX), vertoont een ruimtelijk beperkte reactie in de mediale regio van alle spieren van het middenrif cellen die komt overeen met de AChR cluster-verrijkt eindplaat band. De brand CLUT heatmap is in SDiu₁₆ en de schaal bar is in micron. (B) dit paneel toont Spatio kaarten van Ca^{2 +} voorbijgaande intensiteit na verloop van tijd (ST kaarten) in een populatie van spiercellen (y-as) gevolgd na verloop van tijd (x-as). De bar van de schaal is in seconden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Video 3: film van activiteit-geïnduceerde spier cel Ca ^{2 +} reacties in het bijzijn van de myosin blocker BHC op P4, zoals in detail beschreven in de Figuur 2A legend. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Video 4: film van activiteit-geïnduceerde spier cel Ca ^{2 +} reacties in het bijzijn van de waarde N.v.t. _v 1.4 antagonist µ-conotoxin op P4, zoals in detail beschreven in de Figuur 2B legend. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Discussion

Wij bieden hier enkele voorbeelden van het meten van Ca^{2 +} reacties in specifieke cellen in intact neuromusculaire weefsel met behulp van GECI-uiten muizen. Om deze experimenten uitvoeren, is het absoluut noodzakelijk niet te verwonden de phrenic zenuw tijdens de dissectie. Naar image Ca^{2 +} antwoorden in de cellen van Schwann op lage of hoge kracht (dat wil zeggen, 20 X of 60 X), moet het BHC of µ-conotoxin naar Blokverplaatsing gebruiken. Voor de beeldvorming van de spaarstand van Ca^{2 +} antwoorden in spiercellen is het mogelijk voor het meten van hen in de afwezigheid van deze drugs, de gelijktijdige overname van spier Ca^{2 +} voorbijgaande intensiteit en spier dus lengte wijzigingen tijdens het toelaat hoge-frequentie zenuw stimulatie⁶. Als u meerdere experimenten uitvoert op hetzelfde monster, is het noodzakelijk om te scheiden van elkaar door ten minste 15 minuten, gedurende welke tijd het monster kan worden geperfundeerd. Deze stappen kunt voor de herhaalde beeldvorming van stimulatie-geïnduceerde Ca^{2 +} antwoorden van het hetzelfde gezichtsveld in hetzelfde monster gedurende ten minste 3-5 uur. Het is ook cruciaal voor predilute medicijnen opgelost in DMSO als beschreven voor het BHC, zoals DMSO toegepast direct op GCaMP-uiten weefsel onomkeerbaar, stimulus-onafhankelijke fluorescentie reacties induceert.

We vonden dat om redenen die onduidelijk zijn, Wnt1-Cre; conditionalGCaMP3/6 muizen niet vertonen zenuwstimulatie of agonist-geïnduceerde Ca^{2 +} antwoorden in de cellen van Schwann na P15 - P20. Echter Sox10-Cre; voorwaardelijke GCaMP3/6 muizen blijven vertonen deze reacties ten minste zo laat als P56, de oudste leeftijd die we hebben onderzocht. In tegenstelling, vertonen Myf5-voorwaardelijke GCaMP3/6 muizen reacties zo oud als één jaar, de oudste leeftijd onderzocht.

Terwijl GECI-uiten muizen unieke mogelijkheden bieden voor imaging-Ca^{2 +} reacties in hele populaties van cellen van een specifiek subtype, zijn er enkele beperkingen, zoals het onvermogen te voeren ratiometric imaging, dus uitpakken kwantitatieve Ca ^{2 +} metingen. Er zijn ook beperkingen aan het bedrag van de diepte van het weefsel waaruit deze reacties kunnen worden beeld met behulp van widefield fluorescentie microscopie (dat wil zeggen, in tegenstelling tot het gebruik van de confocal of multiphoton microscopie). Dus, terwijl de dunheid van het middenrif vatbaar voor de toepassing van de technieken die hier gepresenteerd is, vastleggen van cel-specifieke Ca^{2 +} antwoorden in celtypes van het NMJ in andere spieren die dikker zijn voorschrijven sub dissectie of andere vormen van fluorescentie microscopie.

Deze genetische en optische hulpmiddelen vertegenwoordigen een aanzienlijke vooruitgang meer dan vorige Ca^{2 +} beeldvormende technieken, waarmee alleen meerdere celtypen of een paar individuele cellen binnen één celtype kon worden beeld. Een bijkomend voordeel is dat Ca^{2 +} reacties kunnen worden herhaalbaar beeld voor langere tijd uit de dezelfde cellen met behulp van GECI muizen, overwegende dat dit niet gemakkelijk mogelijk gebruik van traditionele chemische Ca^{2 +}-bindende fluorescente kleurstoffen. Ten slotte, met behulp van een afbeelding splitter, we dual-golflengte beeldvorming van een dynamische signaal binnen één celtype (cellen van Schwann) en een vaste label binnen een seconde (spiercellen) uitvoeren en, dus, Toon hoe meerdere cel-specifieke calcium of spanning reacties kunnen worden geëvalueerd) bijvoorbeeld, een cel van Schwann Cre-rijden muis stak een voorwaardelijke Cre-afhankelijke GCaMP-muis, zoals gemeld hier, gekruist een transgene Cre-onafhankelijke muis uiting van een spier cel-specifieke GECI of GEVI met niet-overlappende fluorescentie excitatie / emissie spectra¹⁰, zou gelijktijdige opvolging van dynamische Ca^{2 +} en/of spanning veranderingen in de cellen van Schwann zowel spier). Dergelijke instrumenten kunnen beoordelen of de reactie van één celtype op een bepaalde prikkel, zoals de purine ATP of de verdeling product adenosine, direct of niet indirect gemedieerde door een direct effect op een ander celtype op de NMJ.

Het voornaamste doel van deze studies was te evalueren van de spatio Ca^{2 +} responsverloop van cel subtypen te zenuwstimulatie, maar de technieken gebruikt om dit te bereiken kunnen worden gedistribueerd naar andere doelen. Bijvoorbeeld, ze kunnen worden gebruikt voor het analyseren van Ca^{2 +} reacties in de aanwezigheid van bepaalde antagonisten of in bepaalde mutant achtergronden, zoals specifieke diermodellen motor neuron disease, of muscular dystrophy, ziekte van Charcot-Marie-Tooth, voor het analyseren van de CA^{2 +} reactie op specifieke agonisten te evalueren receptor expressie, om te beoordelen van de heterogeniteit van Ca^{2 +} functies binnen een cel subtype op een prikkel, of om te vergelijken van Ca^{2 +} reacties in een cel subtype op andere functionele reacties binnen dat type (electrophysiologically opgenomen spier eindplaat of actie potentieel, optisch verbeelde spier verkorting, kracht-transducer-opgenomen spierspanning, enz.) of naar andere parameters (zoals, post hoc beoordeling van zenuw/spier cel van Schwann morfologie en moleculaire expressie via immunohistochemistry). Samen, deze studies tonen hoe cel-specifieke GECI of GEVI muizen kunnen worden gebruikt voor het verlichten van een breed spectrum van fysiologische processen in een synaps samengesteld uit genetisch herkenbaar, cel-specifieke ingangen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myf5-Cre mice	Jax	#007893	Drives muscle cell expression as early as E136
Wnt1-Cre mice	Jax	#003829	Drives expression into all  Schwann cells at E13 but not P209
Sox10-Cre mice	Jax	#025807	Drives Schwann cell expression at older ages
Conditional GCaMP3 mice	Jax	#029043	Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion
Conditional GCaMP6f mice	Jax	#024105	Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion
BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)	Hit2Lead	#5102862	Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ
µ-conotoxin GIIIb	Peptides Int'l	#CONO20-01000	Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8
Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel .9KG	Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins
Minutien pins (0.1mm diameter)	Fine Science Tools	26002-10	Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel
Eclipse FN1 upright microscope	Nikon	MBA74100	Allows staging and observation of specimen
Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator	Autom8	MXMScr	Allows movement of specimen
Manual micromanipulator	Narishige	M-152	Holds recording and stimulating electrodes
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Axoclamp 900A	Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording
Microelectrode low-noise data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1550	Allows electrophysiological data acquisition
Microelectrode data analysis system	Molecular Devices	PCLAMP 10 Standard	Performs electrophysiological data analysis
Square wave stimulator	Grass	S48	Stimulates nerve to excite muscle
Stimulus Isolation Unit	Grass	PSIU6	Reduces  stimulation artifacts
Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter	Sutter	FG-GBF100-50-15	Impales and records nerve-evoked muscle potentials
Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter	Sutter	BF150-117-15	Lengthened and used for suction electrode
Micropipette Puller	Sutter	P-97	Pulls and prepares recording electrodes
1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera	Photometrics	Prime 95b	Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging
Light Source	Lumencor	Spectra X	Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation
Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm	Nikon	CFI60	Provide long working distances for visualization of specimen
Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp	Sumita	LS-DWL-N	Provides illumination for brightfield observation
W-View Gemini Image Splitter	Hamamatsu	A12801-01	Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera
Single-band Bandpass Filters  (512/25-25 and 630/92-25)	SemRock	FF01-512/25-25; FF01-630/92-25	Permits dual band imaging
560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging
Imaging data acquisition system	Nikon	NIS Elements - MQS31000	Allows imaging data acquisition
Wavelength control module	Nikon	MQS41220	Module for imaging data acqusiition
Emission splitter hardware module	Nikon	MQS41410	Module for imaging data acqusiition
Imaging data analysis system	NA	Volumetry 8D5, Fiji	Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data