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Neuroscience

पूर्व वीवो सेल-विशिष्ट कैल्शियम के त्रिपक्षीय Synapse में सिग्नलिंग माउस डायाफ्राम की इमेजिंग

Published: October 4, 2018 doi: 10.3791/58347
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Physiology and Cell Biology, School of Medicine, University of Nevada, 2Department of Pharmacology, Larner College of Medicine, University of Vermont

Summary

यहां हम छवि कैल्शियम के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद murine neuromuscular जंक्शन पर व्यक्तिगत कोशिका प्रकार की आबादी में संकेत दे ।

Abstract

ऊतकों में कोशिकाओं की विद्युत गतिविधि electrophysiological तकनीक द्वारा निगरानी की जा सकती है, लेकिन ये आमतौर पर व्यक्तिगत कोशिकाओं के विश्लेषण तक ही सीमित हैं । intracellular कैल्शियम की वृद्धि के बाद से (Ca2 +) cytosol में अक्सर क्योंकि विद्युत गतिविधि, या अन्य उत्तेजनाओं के असंख्य के जवाब में होता है, इस प्रक्रिया फ्लोरोसेंट कैल्शियम के साथ भरी हुई कोशिकाओं की इमेजिंग के प्रति संवेदनशील द्वारा निगरानी की जा सकती रंगों.  हालांकि, यह पूरे ऊतक के भीतर एक अलग कक्ष प्रकार में इस प्रतिक्रिया छवि के लिए मुश्किल है क्योंकि इन रंगों ऊतक के भीतर सभी प्रकार के सेल द्वारा लिया जाता है । इसके विपरीत, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECIs) एक व्यक्ति के सेल प्रकार और intracellular ca2 +की वृद्धि के जवाब में fluoresce द्वारा व्यक्त किया जा सकता है, इस प्रकार के इमेजिंग की अनुमति ca2 + की पूरी आबादी में संकेतन व्यक्तिगत कक्ष प्रकार । यहां, हम माउस neuromuscular जंक्शन, मोटर न्यूरॉन्स, कंकाल की मांसपेशी, और टर्मिनल/perisynaptic Schwann कोशिकाओं के बीच एक त्रिपक्षीय synapse के लिए GECIs GCaMP3/6 का उपयोग लागू होते हैं । हम क्लासिक पूर्व vivo ऊतक की तैयारी में इस तकनीक की उपयोगिता प्रदर्शित करता है । एक ऑप्टिकल अलगानेवाला का उपयोग करना, हम गतिशील सीए2 + संकेतों और neuromuscular जंक्शन (NMJ) के एक स्थैतिक लेबल की एक स्थाई की तरंग दैर्ध्य इमेजिंग प्रदर्शन एक दृष्टिकोण है कि आसानी से दो सेल विशेष GECI या आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग वोल्टेज की निगरानी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है संकेतक (GEVI) एक साथ । अंत में, हम प्रतिदीप्ति तीव्रता के स्थानिक नक्शे पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल दिनचर्या पर चर्चा । साथ में, इन ऑप्टिकल, ट्रांसजेनिक, और विश्लेषणात्मक तकनीक संदर्भों की एक विस्तृत विविधता में NMJ में विशिष्ट कोशिका उपआबादी की जैविक गतिविधि का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है ।

Introduction

NMJ, सभी synapses की तरह, तीन तत्वों से बना है: एक presynaptic एक ंयूरॉन से व्युत्पंन टर्मिनल, एक postsynaptic ंयूरॉन/प्रभाव सेल, और एक perisynaptic glial सेल1,2। जबकि synaptic संचरण के बुनियादी पहलुओं पहले इस synapse3पर प्रदर्शन किया गया, इस प्रक्रिया के कई पहलुओं अज्ञात रहते हैं, इस synapse के विशिष्ट सेलुलर तत्वों द्वारा एक ही अणुओं की अभिव्यक्ति के कारण भाग में । उदाहरण के लिए, दोनों प्यूरीन adenine न्यूक्लियोटाइड एटीपी और acetylcholine (के लिए रिसेप्टर्स), जो सह रहे हैं हड्डीवाला NMJ पर मोटर न्यूरॉन्स द्वारा जारी, मांसपेशी द्वारा व्यक्त कर रहे हैं, Schwann कोशिकाओं, और मोटर न्यूरॉन्स, इस प्रकार किसी की व्याख्या उलझी कार्यात्मक इन पदार्थों (जैसे, ट्रांसमीटर रिलीज या प्रतिक्रिया, मांसपेशी बल पीढ़ी)4द्वारा लागू प्रभाव । इसके अलावा, हालांकि NMJ के त्रिपक्षीय घटकों की तुलना में सरल कर रहे हैं, उदाहरण के लिए, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में न्यूरॉन्स जो अक्सर कई synaptic आदानों प्रदर्शन, चाहे मोटर न्यूरॉन्स, मांसपेशी कोशिकाओं, या Schwann कोशिकाओं आधारित उत्तेजनाओं के जवाब में बदलती उनके आंतरिक विविधता पर (जैसे, भ्रूण व्युत्पत्ति, फाइबर उपप्रकार, आकृति विज्ञान) अस्पष्ट है । आदेश में इन मुद्दों में से प्रत्येक को संबोधित करने के लिए, यह एक साथ एक synaptic तत्व के भीतर कई कोशिकाओं की प्रतिक्रिया को ट्रैक करने के लिए लाभप्रद होगा, साथ ही ट्रैक, एक ही समय में, इस तरह के अंय अलग तत्वों में से किसी में या तो एक प्रतिक्रिया । पारंपरिक रणनीति रासायनिक रंगों का उपयोग करने के लिए कैल्शियम संकेतन इन दो लक्ष्यों को प्राप्त नहीं कर सकते हैं, क्योंकि स्नान लागू डाई ऊतक के लिए आवेदन के बाद कई प्रकार के सेल द्वारा लिया जाता है, और intracellularly भरी हुई डाई केवल कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता व्यक्तिगत या कोशिकाओं के छोटे साथियों । यहां, ट्रांसजेनिक के उपयोग के लिए सेल विशिष्ट कैल्शियम संकेतन, विशिष्ट इमेजिंग और सॉफ्टवेयर उपकरण5के साथ एक साथ उपाय डिजाइन GECIs व्यक्त चूहों, हम इन दो समग्र लक्ष्यों के पहले प्रदर्शन और कैसे नए के अलावा चर्चा ट्रांसजेनिक उपकरण दूसरे को प्राप्त करने में मदद मिलेगी । इस तकनीक को कैल्शियम गतिशीलता या अंय सेलुलर जीन के माध्यम से अवलोकन की घटनाओं एक ही समय में कई कोशिका आबादी में ऑप्टिकल सेंसर इनकोडिंग ट्रैकिंग में रुचि किसी के लिए उपयोगी हो जाएगा ।

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Protocol

पशुपालन और प्रयोगों के अनुसार राष्ट्रीय स्वास्थ्य गाइड के संस्थानों की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए और नेवादा विश्वविद्यालय में IACUC के साथ प्रदर्शन किया गया ।

1. ट्रांसजेनिक चूहों से डायाफ्राम और Phrenic नसों की तैयारी

  1. इन चूहों को जीनोटाइप करने के लिए ट्रांसजेनिक चूहों और oligonucleotide प्राइमरों की खरीद करें ।
    नोट: प्राइमर इन चूहों में से प्रत्येक के लिए "जानकारी" पृष्ठ पर सूचीबद्ध हैं ।
    1. नस्ल एक 3-6-माह-पुराने माउस की एक प्रति व्यक्त करना उचित ट्रांसजेनिक/नॉक-इन Cre-ड्राइवर एलील और शून्य प्रतियों के साथ सशर्त GCaMP3/6 एलील की एक दूसरे चूहे के साथ एक या दो प्रतियां व्यक्त सशर्त GCaMP3/ 6 एलील और Cre-ड्राइवर एलील की शूंय प्रतियां ।
    2. जीनोटाइप पिल्ले और है कि दोनों Cre और सशर्त GCaMP3/6 alleles है-ये इसके बाद के डबल बुलाया जाएगा-ट्रांसजेनिक चूहों (जैसे, Myf5-Cre, सशर्त GCaMP3)6।
      नोट: इस तरह, सभी डेटा Cre और सशर्त GCaMP3/6 alleles की एक प्रति व्यक्त चूहों से प्राप्त होगा । यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब इन पार करने के लिए अंय उत्परिवर्ती चूहों (जैसे, नॉकआउट) में जोड़ने ।
  2. जब डबल ट्रांसजेनिक चूहों उपयुक्त उंर के होते है (जैसे, जन्मोत्तर दिन 0 या 5 [P0 या P5] या वयस्क), euthanize द्वारा चूहों उंहें कैंची के साथ decapitating (P10 से छोटे चूहों के लिए) या उंहें एक isoflurane सांस लेना चैंबर में रखकर-जब वे कर रहे है अब संदंश की एक जोड़ी के साथ पूंछ चुटकी करने के लिए उत्तरदायी, वे बलिदान के लिए तैयार हैं ।
  3. एक जोड़ी कैंची के साथ decapitation द्वारा पशु बलिदान ।
  4. बस जिगर के नीचे और iridectomy कैंची के साथ दिल और फेफड़ों के ऊपर सिर्फ पूरे जानवर के पार Transversely अनुभाग ।
  5. काटना दूर जिगर, दिल, और फेफड़ों, phrenic तंत्रिका कि पर्याप्त लंबा है एक चूषण इलेक्ट्रोड (यानी, 1-2 सेमी) में तैयार किया जा करने के लिए एक लंबाई बनाए रखने के लिए सावधान किया जा रहा है ।
    नोट: बाएं phrenic तंत्रिका ऊतक के एक सफेद टुकड़ा है कि बाईं डायाफ्राम के औसत दर्जे का भाग में प्रवेश करती है के रूप में पहचाना जा सकता है । फेफड़ों को निकालते समय इसे काटना नहीं चाहिए । सही phrenic तंत्रिका प्रावरणी के एक टुकड़े के भीतर चलाता है कि भी बेहतर वेना कावा शामिल है और पतले और वेना कावा से कण है । एक साथ, वे दोनों सही औसत दर्जे का डायाफ्राम घुसना ।
  6. इसके अलावा ribcage और कशेरुका स्तंभ, डायाफ्राम के आसपास पतली रिज को छोड़कर निकालें ।
  7. डायाफ्राम और phrenic तंत्रिका नमूना एक microfuge ट्यूब में Krebs-घंटी समाधान के साथ 1 µ g/mL ५९४-αBTX के लिए अंधेरे में 10 मिनट के लिए प्लेस ।
    नोट: ५९४ के इस एकाग्रता-αBTX उनके समारोह (व्यक्तिगत अवलोकन) को अवरुद्ध बिना (AChRs) लेबल

2. उत्तेजना और मांसपेशी कार्रवाई क्षमता की रिकॉर्डिंग

  1. minutien पिन का उपयोग करना, यह एक 6 सेमी सिलिकॉन अचालक जेल के साथ लेपित पकवान पर लगाए और oxygenated Krebs-घंटी समाधान के ~ 8 मिलीलीटर के साथ भरा है और यह माइक्रोस्कोप मंच पर जगह से डायाफ्राम स्थिर । Perfuse अधिक Krebs-घंटी समाधान के साथ डायाफ्राम (8 मिलीलीटर/30 मिनट के लिए/
    नोट: यह ५९४ असीम αBTX कुल्ला, के रूप में अच्छी तरह के रूप में विच्छेदन के बाद ऊतक equilibrates ।
  2. स्थापित तरीकों7के अनुसार एक चूषण इलेक्ट्रोड बनाओ ।
    1. 4x आवर्धन पर, एक micromanipulator का उपयोग कर, बाईं phrenic तंत्रिका पर चूषण इलेक्ट्रोड ले जाएं और एक 5-एमएल के प्रति बैरल बाहर खींच द्वारा चूषण लागू करने टयूबिंग कि चूषण इलेक्ट्रोड से जुड़ा है करने के लिए जुड़ा हुआ सिरिंज ।
      नोट: जब सफलतापूर्वक चूषण इलेक्ट्रोड में खींचा, phrenic तंत्रिका तना हुआ है. उत्तेजितकर्ता पर बारी और मैनुअल स्विच 1x flipping द्वारा phrenic तंत्रिका उत्तेजित ।
    2. यह brightfield रोशनी के साथ नेत्रहीन की जांच द्वारा 1 हर्ट्ज उत्तेजना के जवाब में डायाफ्राम अनुबंध सुनिश्चित करें. यदि नहीं, वोल्टेज घुंडी वृद्धिशील एक supramaximal पल्स, जो मांसपेशियों के संकुचन का एक दृश्य परीक्षा द्वारा सत्यापित किया जा सकता है को प्राप्त करने के लिए मोड़ द्वारा वोल्ट समायोजित करें । अगर फिर भी दिखाई नहीं, सिरिंज के साथ तंत्रिका बाहर उड़ा और चूषण लागू करने से फिर से आकर्षित करने का प्रयास.
  3. छिड़काव बंद करें और मांसपेशी-विशिष्ट मायोसिन अवरोधक BHC6 या वोल्टेज-gated सोडियम चैनल विरोधी µ-conotoxin8 १०० µ एम के अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ें ।
    1. बनाने के लिए १०० µ एम BHC, DMSO में २०० mM शेयर की पिपेट 4 µ एल और Krebs-रिंगर समाधान की 1 मिलीलीटर में यह बहुत पतला ।
    2. डिश से Krebs-घंटी समाधान की 1 मिलीलीटर निकालें ।
    3. इस डिश के लिए, पतला BHC जोड़ें ।
      नोट: इस कमजोर पड़ने में मदद करता है GCaMP3-एक्सप्रेस कोशिकाओं में एक गैर क्षणिक फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया के undilute DMSO द्वारा प्रेरण को रोकने के ।
    4. 30 मिनट रुको और फिर, एक और 20-30 मिनट के लिए ताजा Krebs-घंटी समाधान के छिड़काव पर बारी ।
  4. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड तैयार करें ।
    1. दस्ताने पहने हुए, एक micropipette खींचने में एक बाहरी व्यास (आयुध डिपो) के 1 मिमी और एक भीतरी व्यास (०.४ मिमी की आईडी) के साथ एक borosilicate रेशा गिलास जगह और डायल करने के लिए यह स्थिति में दबाना । खींचने का दरवाजा बंद करें ।
    2. एक पी ९७ खींचने का प्रयोग, निंनलिखित सेटिंग कार्यक्रम: हीट ९०० पर, १२०, वेग पर ७५, समय २५० पर पुल, ५०० पर दबाव, और कोई अतिरिक्त छोरों ।
      नोट: प्रतिरोध (R) एम्पलीफायर के सॉफ्टवेयर नियंत्रण का उपयोग कर मापा जाता है: डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर फॉर्मूला V = आईआर को हल करके प्रतिरोध की पुष्टि. सॉफ्टवेयर नियंत्रक इलेक्ट्रोड के माध्यम से एक ज्ञात वर्तमान (I) (आमतौर पर 1 ना) गुजरता है और वोल्टेज में परिवर्तन के उपाय (V), इस प्रकार हमें आर के लिए हल करने के लिए सक्षम.
    3. भ्रूण डायाफ्राम के लिए, प्रतिरोध ६० MΩ के पास है कि सुनिश्चित करें, और पुराने डायाफ्राम, 10-20 MΩ के लिए । 3 एम KCl के साथ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड लोड.
  5. 10x इज़ाफ़ा पर, मांसपेशियों में इलेक्ट्रोड कम, एक उत्तेजक इलेक्ट्रोड के रूप में मंच के विपरीत पक्ष पर एक दूसरे micromanipulator का उपयोग कर.
  6. electrophysiological डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, शेष झिल्ली संभावित परिवर्तन से 0 में-६५ एमवी या नीचे तक प्रतीक्षा करें ।
  7. 1 हर्ट्ज पर उत्तेजित और एक बड़ी क्षमता है कि एक मामूली overshoot प्रदर्श (क्षमता है कि 0 एमवी ऊपर उगता है जब यह-६५ एमवी या नीचे) में शुरू होता है की जांच करके एक मांसपेशी कार्रवाई क्षमता की उपस्थिति की पुष्टि । एक कार्रवाई की क्षमता के साथ उत्तेजना विरूपण साक्ष्य भ्रमित मत करो ।
    नोट: संभावितों की अवधि में काफी अधिक है (~ 5 ms) उत्तेजना कलाकृतियों से ।

3. नमूने के प्रतिदीप्ति की इमेजिंग

  1. 20X आवर्धन पर, ५९४-αBTX के लिए देख कर मांसपेशी के केंद्र में endplate बैंड का पता लगाने-हरे रंग के तहत NMJs लेबल/ नीले प्रकाश उत्तेजना करने के लिए स्विच (४७० एनएम) छवि Ca करने के लिए2 + प्रतिक्रियाएं मांसपेशी, मोटर ंयूरॉन, या Schwann कोशिकाओं में ।
  2. यदि वांछित, bandpass फिल्टर और दोहरे तरंग दैर्ध्य इमेजिंग के लिए एक dichroic एकल बढ़त फिल्टर के साथ छवि अलगानेवाला सेट ।
  3. GCaMP3/6-व्यक्त ऊतक द्वारा प्रदर्शित अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति (Fmax) की गणना करने के लिए, डायाफ्राम6तैयार करने के लिए 3 एम पोटेशियम क्लोराइड (KCl) के 12 µ एल जोड़ें ।
    1. GCaMP3/6-व्यक्त ऊतक 20X आवर्धन पर संतृप्ति प्रदर्शित करता है जो स्तर के ११०% करने के लिए लुकअप तालिका पट्टी पर चमक पट्टी के साथ प्रयोग करें प्रदर्शन KCl के जवाब में बिन्नी के बिना ।
  4. 20 फ्रेम प्रति सेकंड में रिकॉर्ड किसी भी तेजी से घटनाओं को याद नहीं है ।
  5. 1-45 s के साथ उत्तेजित करें 20-40 हर्ट्ज तंत्रिका उत्तेजना के आवेगों का एक ट्रेन पहुंचाने से सक्शन इलेक्ट्रोड का उपयोग कर या स्नान आवेदन या छिड़काव द्वारा औषधीय एगोनिस्ट जोड़ सकते हैं और एक सेल उपप्रकार में गतिशील फ्लोरोसेंट सीए2 + प्रतिक्रियाएं इकट्ठा स्थिर ५९४-αBTX NMJ संकेत के साथ एक साथ ।
    नोट: यदि ऊतक-विशिष्ट लाल या दूर-लाल GECI या GEVI चूहे NMJ पर उपयोग के लिए उपलब्ध हो जाते हैं, तो वे NMJ पर दो विशिष्ट सेलुलर तत्वों को प्रतिबिंबित करने वाले दो गतिशील संकेतों को एकत्र करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  6. जब इमेजिंग या electrophysiological प्रयोगों को समाप्त कर रहे हैं, क्योंकि वांछित परिणाम प्राप्त किया गया है, छिड़काव लाइनों के माध्यम से पानी perfuse और चूषण इलेक्ट्रोड के माध्यम से पानी चूसना-3x सुनिश्चित करें कि लवण का निर्माण नहीं करते ।

4. निर्यात और प्रतिदीप्ति तीव्रता (एसडीiu16) के एक मानक विचलन नक्शा द्वारा डेटा का विश्लेषण

  1. रिकॉर्ड छवि 16-bit झगड़ा ढेर के रूप में दर्ज अनुक्रम और विश्लेषण के लिए इच्छित इमेजिंग डेटा विश्लेषण प्रणाली में लोड ।
  2. सॉफ्टवेयर के 8d फ़ाइल मेनू में, चुनें छवि ब्याज की ढेर और लोड करने के लिए क्लिक करें ।
    1. एक बार वीडियो लोड, समय के माध्यम से स्कैन करने के लिए एक अनुभाग है कि कोई सेलुलर फ्लोरोसेंट गतिविधि की पहचान है ।
      नोट: इस क्षेत्र का उपयोग पृष्ठभूमि नमूना बनाने के लिए किया जाएगा ।
    2. shift दबाए रखें और पृष्ठभूमि नमूना क्षेत्र के रूप में पहचाने गए क्षेत्र में रुचि के क्षेत्र (ROI) बॉक्स आरेखित करने के लिए क्लिक करें.
    3. बॉक्स बनाने के बाद, पृष्ठभूमि गतिविधि परिवर्तन की एक साजिश उत्पन्न करने के लिए अंतरिक्ष पट्टी दबाएँ.
    4. ट्रेस राइट-क्लिक करें और विकल्प के रूप में एक xy निर्देशांक पाठ फ़ाइल ट्रेस करने के लिए पाठ के रूप में डंप करने के लिए विकल्पों को प्रस्तुत करने के लिए मिश्रित विकल्प का चयन करें ।
  3. ब्याज की वीडियो को वापस ले जाने, समय क्षेत्र जहां ब्याज की गतिविधि हो रही है की पहचान करने के लिए फिर से स्कैन ।
    1. मध्य माउस बटन का उपयोग कर, पीले समय बॉक्स में इस समय क्षेत्र का चयन करें ।
    2. वीडियो पर राइट-क्लिक करें और चुनें स्टैक ऑप्स और फिर स्टेट मानचित्र विकल्प 5 ।
      नोट: यह एक मानक विचलन नक्शा (एसडी नक्शा) बाईं विंडो में उत्पन्न होगा.
    3. एसडी मानचित्र पर क्लिक करें और उसके बाद ] कुंजी 19x उपयुक्त रंग हीट मैप लागू करने के लिए दबाएँ ।
    4. एसडी नक्शा राइट-क्लिक करें और चयन STM लोड और बचानेके लिए, झगड़ा के रूप में STM बचाने के विकल्प पेश करेंगे जो एसडी नक्शा बचाने के लिए ।
    5. फिर, [ कुंजी 19x ग्रेस्केल रंग मैप करने के लिए वापस जाने के लिए दबाएँ ।
    6. प्रेस सी और फिर डी को घनत्व मानचित्रण उपकरण लाने के लिए । बाईं माउस बटन और केंद्र माउस बटन का उपयोग करना, सीमा को समायोजित सभी फ्लोरोसेंट एसडी नक्शे में दिखाया गतिविधि शामिल हैं ।
    7. सीमा सेटिंग्स को बनाए रखते हुए घनत्व उपकरण बंद करने के लिए C दबाएँ ।
    8. राइट-क्लिक करें SD मानचित्र और का चयन करें STM कणों और तब ढूंढें PTCLS।
      नोट: यह फ्लोरोसेंट गतिविधि व्यक्त व्यक्तिगत कोशिकाओं की पहचान करेगा ।
    9. SD मानचित्र पर एक बार और राइट-क्लिक करें और कण ROIs बनाएंका चयन करें ।
      नोट: यह ब्याज की मूल वीडियो पर चयनित कक्षों को मिलाना करेगा ।
    10. Shiftदबाए रखते हुए, मूल वीडियो पर अब पहचाने गए कण ROIs में से किसी एक पर राइट-क्लिक करें ।
    11. रॉय पर roi मार्कर और माप Intचुनें.
      नोट: यह ब्याज की वीडियो में प्रत्येक की पहचान की रॉय के लिए व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट गतिविधि भूखंड पैदा करेगा । इन राइट-क्लिक इन में से किसी एक को और मिश्रितका चयन करके सहेजा जा सकता है, पाठ के रूप में डंप रॉय केबाद ।
  4. विस्तृत तर्क अंतर्निहित इन कार्रवाइयों के लिए, कृपया स्रोत कोड फ़ाइल9देखें ।

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Representative Results

प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तन के कई उदाहरण, intracellular Ca की वृद्धि द्वारा मध्यस्थता+ के भीतर परिभाषित कोशिका प्रकार NMJ, इस दृष्टिकोण की उपयोगिता दिखाएँ. इन परिणामों को स्थानिक प्रतिदीप्ति तीव्रता नक्शे के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, जो कोशिकाओं प्रतिक्रिया के स्थान प्रदान करते हैं, साथ ही उनकी प्रतिक्रियाओं की तीव्रता, इस प्रकार के मूल्यांकन के लिए अनुमति कितनी कोशिकाओं का जवाब और कितना प्रत्येक कोशिका के लिए एक विशेष प्रतिक्रिया उत्तेजना. उदाहरण के लिए, चित्र 1में दिखाए गए के रूप में, हम एक P7 Wnt1-Creके डायाफ्राम के NMJs पर टर्मिनल/perisynaptic Schwann कोशिकाओं (TPSCs) की आबादी में Ca2 + प्रतिक्रियाओं का वीडियो लिया; सशर्त GCaMP3-phrenic तंत्रिका की उत्तेजना के जवाब में व्यक्त माउस और स्थानिक प्रतिदीप्ति तीव्रता नक्शे से प्रतिक्रिया कोशिकाओं की उपआबादी की पहचान की । प्रतिदीप्ति तीव्रता के ये नक्शे गर्मी के नक्शे और रंग-कोडित के अनुसार एक आग रंग लुकअप टेबल (fire CLUT) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । हम के साथ और छवि बंटवारे के साथ इन वीडियो रिकॉर्ड α के समूहों-BTX-डायाफ्राम के बीच में AChRs लेबल (1 वीडियो और 2), एक दृष्टिकोण है कि आसानी से गतिशील GECI या GEVI पर कब्जा अनुकूलित किया जा सकता है देखने के लिए दो अलग सेल प्रकार से प्रतिक्रियाएं प्रदान की है कि उनमें से प्रत्येक गैर अतिव्यापी उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा प्रदर्शित करता है ।

चित्रा 2में, हम एक पी 4 Myf5-Cre के डायाफ्राम पर एक ही तंत्रिका उत्तेजना प्रयोग प्रदर्शन किया ; सशर्त GCaMP3-व्यक्त माउस और छवि सीए2 + प्रतिक्रियाएं मांसपेशी कोशिकाओं में । दिलचस्प है, जब हम या तो मायोसिन अवरोधक BHC या कंकाल मांसपेशी-विशिष्ट वोल्टेज-gated सोडियम चैनल (नv१.४) अवरोधक µ-conotoxin (चित्रा 2a और वीडियो 3 या चित्रा 2 बी और वीडियो 4, क्रमशः इस्तेमाल किया) , हम सीए2 + यात्रियों कि मांसपेशी फाइबर की पूरी लंबाई यात्रा, कार्रवाई की क्षमता का प्रतिनिधित्व करने और 2 सीए की रिहाई के द्वारा मध्यस्थता+ sarcoplasmic जालिका से, या केवल endplate बैंड की लंबाई, का प्रतिनिधित्व करने की कल्पना endplate संभावित और extracellular Ca द्वारा मध्यस्थता2 + AChR.In के माध्यम से स्थानिक प्रतिदीप्ति तीव्रता नक्शे (एसडी मैप्स) के साथ कोशिकाओं के जवाब की उपजनसंख्या की पहचान करने के लिए, चित्र 1के रूप में, हम भी परिवर्तन मापा spatiotemporal (ST) नक्शे के साथ इन मांसपेशियों की कोशिकाओं की आबादी में समय के साथ प्रतिदीप्ति में । इन प्रयोगों में से प्रत्येक एक अलग कोशिका प्रकार, एक अलग उम्र, एक अलग उपचार (तंत्रिका उत्तेजना बनाम विभिन्न दवाओं की उपस्थिति में नसों उत्तेजना) और विश्लेषण के विभिन्न प्रकार का प्रतिनिधित्व करता है (स्थानिक बनाम spatiotemporal प्रतिदीप्ति तीव्रता मैप्स) । ये आंकड़े भी ट्रांसजेनिक GCaMP-व्यक्त चूहों की सबसे उपयोगी सुविधाओं में से एक उदाहरण देकर स्पष्ट करना, अर्थात् करने के लिए अक्सर उत्तेजित और एक ही नमूना छवि और, इसलिए, विभिंन उपचार की स्थिति के प्रभाव का परीक्षण करने की क्षमता ।

Figure 1
चित्रा 1: गतिविधि प्रेरित Schwann सेल सीए2 + प्रतिक्रियाओं का मापन डायाफ्राम और phrenic तंत्रिका P7 Wnt1-Creमें; सशर्त GCaMP3 चूहों । (एक) (बाएं) एक औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता छवि, phrenic तंत्रिका शाखाओं के साथ Schwann कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति की पृष्ठभूमि का स्तर दिखा रहा है और neuromuscular जंक्शन (NMJ) पर, तंत्रिका उत्तेजना (Prestim) से पहले कब्जा कर लिया गया था । इस पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के मूल्यों प्रतिदीप्ति तंत्रिका उत्तेजना के बाद प्राप्त मूल्यों से घटाया गया । सही 16 के मानक विचलन बिट प्रतिदीप्ति तीव्रता इकाइयों के एक स्थानिक नक्शा (SDiu16) के Ca2 + प्रतिक्रियाओं के 30 एस के बाद उत्पंन ४० phrenic तंत्रिका उत्तेजना (Stim नक्शा या एसडी मानचित्र) हर्ट्ज के टर्मिनल में एक मजबूत प्रतिक्रिया से पता चलता है/perisynaptic Schwann NMJ पर कक्ष (TPSCs) । फायर CLUT हीटमैप16 SDiu में है और स्केल बार माइक्रोन में है । पैनलों में सभी छवियां बी - ई पैनल में उन लोगों के रूप में एकही इज़ाफ़ा कर रहे हैं । (ख) (बाएं) एक ही डायाफ्राम ५९४-संयुग्मित α-bungarotoxin (α-BTX), जो करने के लिए बांध और लेबल acetylcholine रिसेप्टर्स (AChRs) के साथ लेबल किया गया था, और हरे रंग के साथ उत्साहित/NMJ की पहचान करने के लिए । सही इस पैनल के एक brightfield छवि एक ही डायाफ्राम दिखाता है, एक intracellular रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की नोक (तीर), जो एक NMJ के लिए निर्देशित किया जा सकता है, α-BTX लेबलिंग के आधार पर दिखा । (ग) सीए2 + क्षणिक सुविधाओं (जैसे, तीव्रता, उत्तेजना के बाद शुरू करने, अवधि) व्यक्तिगत कोशिकाओं या कोशिकाओं के समूहों के कणों के रूप में स्थानिक तीव्रता नक्शे में व्यक्तिगत क्षेत्रों demarcating द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता (बाएँ), उंहें रंग के रूप में प्रतिनिधित्व करने के हित के कोडित क्षेत्रों (ROIs), और (घ) समय के साथ अपनी तीव्रता की साजिश रचने । (ङ) इस पैनल GCaMP3 की दोहरी-तरंग दैर्ध्य छवियां दिखाता है फ्लोरोसेंट सीए2 + प्रतिक्रियाएं और ५९४-α-उसी डायाफ्राम में NMJs लेबल तंत्रिका उत्तेजना के बाद मिथुन छवि अलगानेवाला का उपयोग कर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Video 1
वीडियो 1: गतिविधि-प्रेरित Schwann सेल सीए की छवि बंटवारे के बिना फिल्म 2 + P7 पर प्रतिक्रियाएं, के रूप में विस्तार में वर्णित चित्रा 1 कथा. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video 2
वीडियो 2: गतिविधि प्रेरित Schwann सेल सीए की छवि बंटवारे के साथ फिल्म 2 + प्रतिक्रियाएं और ५९४- α-BTX-P7 में लेबल AChRs, के रूप में विस्तार में वर्णित चित्रा 1 कथा. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Figure 2
2 चित्रा: गतिविधि के माप-प्रेरित मांसपेशी सेल सीए2 + प्रतिक्रियाओं पी 4 Myf5-Creके डायाफ्राम में; सशर्त GCaMP3 चूहों । (A) (बाएं) कोर्टेक्स AChR के केंद्रीय स्थित endplate बैंड के क्लस्टर डायाफ्राम ५९४-α-BTX के साथ लेबल कर रहे हैं । मध्य सीए 2 के एक स्थानिक नक्शा+ क्षणिक तीव्रता (एसडी नक्शा), मायोसिन अवरोधक BHC की उपस्थिति में phrenic तंत्रिका उत्तेजना के ४० हर्ट्ज के 30 एस के बाद उत्पन्न, सभी डायाफ्राम मांसपेशी कोशिकाओं के पूरे क्षेत्र में एक प्रतिक्रिया से पता चलता है. सही इसके विपरीत, एक एसडी एक ही उत्तेजना के बाद एक ही डायाफ्राम से उत्पंन नक्शा है, लेकिन नv१.४ विरोधी µ की उपस्थिति में-conotoxin (µ-CTX), सभी डायाफ्राम मांसपेशी कोशिकाओं के औसत दर्जे का क्षेत्र में एक विशेष रूप से प्रतिबंधित प्रतिक्रिया दर्शाती है कि AChR क्लस्टर समृद्ध endplate बैंड से मेल खाती है । फायर CLUT हीटमैप16 SDiu में है और स्केल बार माइक्रोन में है । (ख) इस पैनल समय (x-अक्ष) के बाद मांसपेशियों की कोशिकाओं (y-अक्ष) की आबादी में सीए2 + क्षणिक तीव्रता के spatiotemporal नक्शे से पता चलता है. स्केल बार सेकंड में है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Video 3
3 वीडियो: गतिविधि प्रेरित मांसपेशी सेल सीए की मूवी 2 + मायोसिन अवरोधक BHC की उपस्थिति में पी 4 पर प्रतिक्रियाएं, के रूप में विस्तार में वर्णित चित्र 2a कथा. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video 4
वीडियो 4: गतिविधि की मूवी-प्रेरित मांसपेशी सेल Ca 2 + ना की मौजूदगी में प्रतिक्रियाएं वि १.४ विरोधी µ-पी 4 पर conotoxin, के रूप में विस्तार में वर्णित चित्र b कथा. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

यहाँ हम GECI-एक्सप्रेस चूहों का उपयोग कर बरकरार neuromuscular ऊतक में विशिष्ट कोशिकाओं में सीए2 + प्रतिक्रियाओं को मापने के कुछ उदाहरण प्रदान करते हैं । आदेश में सफलतापूर्वक इन प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए, यह अनिवार्य है कि विच्छेदन के दौरान phrenic तंत्रिका घायल नहीं है । छवि Ca करने के लिए2 + या तो कम या उच्च शक्ति (यानी, 20X या 60X) पर Schwann कोशिकाओं में प्रतिक्रियाओं, यह या तो BHC या µ-conotoxin का उपयोग करने के लिए आंदोलन ब्लॉक करने के लिए आवश्यक है । ca के कम पावर इमेजिंग के लिए2 + मांसपेशियों की कोशिकाओं में प्रतिक्रियाओं, यह इन दवाओं के अभाव में उन्हें मापने के लिए संभव है, इस प्रकार पेशी के एक साथ अधिग्रहण की अनुमति सीए2 + क्षणिक तीव्रता और मांसपेशियों की लंबाई में परिवर्तन के दौरान उच्च आवृत्ति तंत्रिका उत्तेजना6. एक ही नमूने पर एकाधिक प्रयोग करते समय, यह आवश्यक है कि हर एक को कम से 15 मिनट तक अलग किया जाए, जिसके दौरान नमूना perfused हो सकता है । इन कदमों उत्तेजना प्रेरित Ca के दोहराया इमेजिंग के लिए अनुमति2 + प्रतिक्रियाओं को देखने के एक ही नमूना में कम से 3-5 घंटे के लिए एक ही क्षेत्र से । यह भी BHC के लिए वर्णित के रूप में DMSO में भंग दवाओं को कमजोर करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में DMSO GCaMP पर सीधे लागू-व्यक्त ऊतक अपरिवर्तनीय, उत्तेजना स्वतंत्र प्रतिदीप्ति प्रतिक्रियाओं लाती है ।

हमने पाया है कि कारणों के लिए अस्पष्ट हैं, Wnt1-Cre; conditionalGCaMP3/6 चूहों P15-P20 के बाद तंत्रिका उत्तेजना या एगोनिस्ट-प्रेरित सीए2 + प्रतिक्रियाओं Schwann कोशिकाओं में प्रदर्शित करने के लिए असफल । तथापि, Sox10-Cre; सशर्त GCaMP3/ चूहों इन प्रतिक्रियाओं के रूप में देर से P56, सबसे पुरानी उम्र है कि हम की जांच की है के रूप में प्रदर्शन के लिए जारी रखें । इसके विपरीत, Myf5-सशर्त GCaMP3/6 चूहों एक वर्ष के रूप में पुराने के रूप में प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन, सबसे पुरानी उम्र की जांच की ।

जबकि GECI-व्यक्त चूहों इमेजिंग ca के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान2 + एक विशिष्ट उपप्रकार के कोशिकाओं की पूरी आबादी में प्रतिक्रियाओं, इस तरह के ratiometric इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए अक्षमता के रूप में कुछ सीमाएं हैं, और, इस प्रकार, मात्रात्मक Ca निकालने 2 + माप । वहां भी है जिसमें से इन प्रतिक्रियाओं widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (यानी, के रूप में फोकल या multiphoton माइक्रोस्कोप का उपयोग करने का विरोध) का उपयोग कर imaged जा सकता है की गहराई की मात्रा के लिए सीमाएं हैं । इसलिए, जबकि डायाफ्राम की ओट यहां प्रस्तुत तकनीकों के आवेदन के लिए उत्तरदायी है, सेल-विशिष्ट सीए पर कब्जा2 + प्रतिक्रियाओं अन्य मांसपेशियों में NMJ के कोशिका प्रकार में है कि मोटे हैं उप-विच्छेदन या अन्य प्रकार की आवश्यकता हो सकती है प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी.

इन आनुवंशिक और ऑप्टिकल उपकरण पिछले Ca2 + इमेजिंग तकनीक, जिसके द्वारा केवल एकाधिक सेल प्रकार या एक सेल प्रकार के भीतर कुछ व्यक्तिगत कोशिकाओं imaged जा सकता है पर एक महत्वपूर्ण उंनति का प्रतिनिधित्व करते हैं । एक अतिरिक्त लाभ यह है कि ca2 + प्रतिक्रियाओं GECI चूहों का उपयोग कर एक ही कोशिकाओं से समय की लंबी अवधि के लिए दोहराया जा सकता है, जबकि यह आसानी से पारंपरिक रासायनिक सीए 2 का उपयोग कर संभव नहीं है+-फ्लोरोसेंट रंजक बाध्यकारी । अंत में, एक छवि अलगानेवाला का उपयोग कर, हम एक गतिशील संकेत के दोहरे तरंग दैर्ध्य इमेजिंग प्रदर्शन एक कोशिका प्रकार (Schwann कोशिकाओं) और एक दूसरे के भीतर एक निश्चित लेबल (मांसपेशी कोशिकाओं) और, इस प्रकार, शो कैसे एकाधिक सेल-विशिष्ट कैल्शियम या वोल्टेज प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन किया जा सकता है ( उदाहरणके लिए, एक Schwann सेल Cre-ड्राइविंग माउस एक सशर्त Cre-निर्भर GCaMP माउस को पार के रूप में यहां की सूचना दी, एक ट्रांसजेनिक Cre-स्वतंत्र माउस को पार कर एक मांसपेशी कोशिका-विशिष्ट GECI व्यक्त या गैर अतिव्यापी GEVI प्रतिदीप्ति के साथ उत्तेजना/ उत्सर्जन स्पेक्ट्रा10, गतिशील Ca के एक साथ ट्रैकिंग की अनुमति होगी2 + और/या दोनों Schwann और मांसपेशी कोशिकाओं में वोल्टेज परिवर्तन) । ऐसे उपकरण यह मूल्यांकन करने में मदद कर सकते है कि क्या एक कक्ष प्रकार की प्रतिक्रिया किसी विशिष्ट उत्तेजना, जैसे कि प्यूरीन एटीपी या उसके ब्रेकडाउन उत्पाद adenosine, NMJ पर किसी अंय कक्ष प्रकार पर प्रत्यक्ष प्रभाव द्वारा प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से मध्यस्थता करने के लिए है ।

इन अध्ययनों का मुख्य लक्ष्य तंत्रिका उत्तेजना के लिए सेल उपप्रकार के spatiotemporal Ca2 + प्रतिक्रिया पैटर्न का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था, लेकिन इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए कार्यरत तकनीकों अन्य लक्ष्यों की ओर तैनात किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, वे कुछ विरोधी या कुछ उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में, मोटर न्यूरॉन रोग, मांसल dystrophy, या Charcot-मैरी टूथ रोग के विशिष्ट पशु मॉडल के रूप में, का विश्लेषण करने के लिए की उपस्थिति में Ca2 + प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता ca 2 + प्रतिसाद करने के लिए विशिष्ट एगोनिस्ट रिसेप्टर अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए, एक उत्तेजना के लिए एक सेल उपप्रकार के भीतर ca2 + प्रतिक्रिया सुविधाओं के विविधता का आकलन करने के लिए, या अन्य कार्यात्मक करने के लिए एक सेल उपप्रकार में ca2 + प्रतिक्रियाओं की तुलना करने के लिए उस प्रकार के भीतर प्रतिक्रियाएं (electrophysiologically दर्ज की मांसपेशी endplate या कार्रवाई की क्षमता, ऑप्टिकली छवि की मांसपेशी छोटा, बल-transducer दर्ज की मांसपेशी तनाव, आदि) या अंय मापदंडों (जैसे, पोस्ट हॉक immunohistochemistry के माध्यम से तंत्रिका/मांसपेशी Schwann कोशिका आकृति विज्ञान या आणविक अभिव्यक्ति का मूल्यांकन). साथ में, इन अध्ययनों से पता चलता है कि कोशिका-विशिष्ट GECI या GEVI चूहों को आनुवंशिक रूप से पहचाने जाने योग्य, कोशिका-विशिष्ट निविष्टियों से बना synapse में शारीरिक प्रक्रियाओं की व्यापक स्पेक्ट्रम को रोशन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) GM103554 और GM110767 (T.W.G.) और अनुसंधान संसाधन 5P20RR018751 के लिए राष्ट्रीय केंद्र और जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान से धन के साथ समर्थित किया गया था 8P20 GM103513 (के लिए G.W.H.) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Myf5-Cre mice Jax #007893 Drives muscle cell expression as early as E136
Wnt1-Cre mice Jax #003829 Drives expression into all  Schwann cells at E13 but not P209
Sox10-Cre mice Jax #025807 Drives Schwann cell expression at older ages
Conditional GCaMP3 mice Jax #029043 Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion
Conditional GCaMP6f mice Jax #024105 Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion
BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one) Hit2Lead #5102862 Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6
CF594-α-BTX Biotium #00007 Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ
µ-conotoxin GIIIb Peptides Int'l #CONO20-01000 Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8
Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard Ellswoth Adhesives # Sil Dielec Gel .9KG  Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins
Minutien pins (0.1mm diameter) Fine Science Tools 26002-10 Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel
Eclipse FN1 upright microscope  Nikon MBA74100 Allows staging and observation of specimen
Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator  Autom8 MXMScr Allows movement of specimen
Manual micromanipulator  Narishige M-152 Holds recording and stimulating electrodes 
Microelectrode amplifier  Molecular Devices Axoclamp 900A Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording
Microelectrode low-noise data acquisition system Molecular Devices Digidata 1550  Allows electrophysiological data acquisition
Microelectrode data analysis system Molecular Devices PCLAMP 10 Standard Performs electrophysiological data analysis
Square wave stimulator Grass S48 Stimulates nerve to excite muscle
Stimulus Isolation Unit Grass PSIU6 Reduces  stimulation artifacts
Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter  Sutter FG-GBF100-50-15 Impales and records nerve-evoked muscle potentials
Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter  Sutter BF150-117-15 Lengthened and used for suction electrode
Micropipette Puller Sutter P-97  Pulls and prepares recording electrodes
1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera  Photometrics Prime 95b Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging
Light Source Lumencor Spectra X Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation
 Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm  Nikon CFI60 Provide long working distances for visualization of specimen
Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp Sumita LS-DWL-N Provides illumination for brightfield observation
W-View Gemini Image Splitter  Hamamatsu A12801-01 Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera
Single-band Bandpass Filters  (512/25-25 and 630/92-25)  SemRock FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 Permits dual band imaging
560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter Sem Rock FF560-FDi01-25x36 Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging
Imaging data acquisition system Nikon NIS Elements - MQS31000 Allows imaging data acquisition
Wavelength control module Nikon MQS41220 Module for imaging data acqusiition
Emission splitter hardware module  Nikon MQS41410 Module for imaging data acqusiition
Imaging data analysis system NA Volumetry 8D5, Fiji Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data

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References

  1. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
  2. Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).
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  4. Todd, K. J., Robitaille, R. Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction. Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).
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तंत्रिका विज्ञान अंक १४० कैल्शियम इमेजिंग आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक GCaMPs मांसपेशी Schwann सेल मोटर ंयूरॉन neuromuscular जंक्शन ट्रांसजेनिक डायाफ्राम
<em>पूर्व वीवो</em> सेल-विशिष्ट कैल्शियम के त्रिपक्षीय Synapse में सिग्नलिंग माउस डायाफ्राम की इमेजिंग
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Heredia, D. J., Hennig, G. W.,… More

Heredia, D. J., Hennig, G. W., Gould, T. W. Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm. J. Vis. Exp. (140), e58347, doi:10.3791/58347 (2018).

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