Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

Summary

Qui presentiamo un protocollo di segnalazione in popolazioni di tipi delle cellule individuali alla giunzione neuromuscolare murino di calcio di immagine.

Abstract

L'attività elettrica delle cellule nei tessuti può essere monitorata da tecniche elettrofisiologiche, ma questi sono solitamente limitati all'analisi delle singole celle. Poiché un aumento di calcio intracellulare (Ca^{2 +}) nel citosol si verifica spesso a causa dell'attività elettrica, o in risposta ad una miriade di altri stimoli, questo processo può essere monitorato dall'imaging delle cellule caricati con fluorescente calcio sensibili coloranti.  Tuttavia, è difficile per questa risposta in un tipo di cella singola all'interno di intero tessuto di immagine perché questi coloranti sono presi da tutti i tipi di cellule all'interno del tessuto. Al contrario, codificato geneticamente calcio indicatori (GECIs) possono essere espresso da un tipo di cella singola e reagiscono in risposta ad un aumento di Ca intracellulare^{2 +}, permettendo così l'imaging del Ca^{2 +} segnalazione in intere popolazioni di tipi di cellule singole. Qui, applichiamo l'uso di GECIs GCaMP3/6 alla giunzione neuromuscolare del mouse, un tripartito sinapsi tra i neuroni di motore, muscolo scheletrico e terminal/perisinaptici in cellule di Schwann. Dimostriamo l'utilità di questa tecnica nelle preparazioni di tessuto classico ex vivo . Utilizzando un separatore ottico, eseguiamo imaging di doppio-lunghezza d'onda di Ca^{2 +} segnali dinamici e un'etichetta statica della giunzione neuromuscolare (NMJ) in un approccio che può essere facilmente adattato per monitorare due cellula-specifico GECI o tensione codificato geneticamente indicatori (GEVI) contemporaneamente. Infine, si discutono la routine utilizzate per acquisire mappe spaziali di intensità di fluorescenza. Insieme, queste tecniche ottiche, transgeniche e analitiche possono essere impiegate per studiare l'attività biologica delle sottopopolazioni distinte delle cellule alle NMJ in un'ampia varietà di contesti.

Introduction

La giunzione neuromuscolare, come tutte le sinapsi, è composto da tre elementi: un terminale presinaptico derivato da un neurone, una cellula postsynaptic neurone/effettrici, e un perisinaptici glial cell^1,2. Mentre gli aspetti fondamentali della trasmissione sinaptica in primo luogo sono stati dimostrati a questa sinapsi³, molti aspetti di questo processo rimangano sconosciuti, in parte a causa dell'espressione delle molecole stesse di distinti elementi cellulari di questa sinapsi. Ad esempio, ricevitori per sia l'acetilcolina (ACh) e del purina adenina nucleotide ATP che co-sono rilasciati dai neuroni di motore alle NMJ vertebrati, sono espresse da muscolo, cellule di Schwann e neuroni di motore, così che complica l'interpretazione di qualsiasi funzionale effetto esercitato da queste sostanze (ad es., rilascio del trasmettitore o risposta, generazione di forza muscolare)⁴. Inoltre, sebbene i componenti tripartiti della giunzione neuromuscolare sono semplici rispetto a, per esempio, i neuroni nel sistema nervoso centrale che spesso esibiscono più input sinaptico, se motoneuroni, cellule muscolari o cellule di Schwann variano in risposta a stimoli basato il loro intrinseca eterogeneità (ad es., derivazione embrionale, sottotipo di fibra, morfologia) è poco chiaro. Al fine di affrontare ciascuno di questi problemi, sarebbe vantaggioso per monitorare simultaneamente la risposta di molte cellule all'interno di un elemento sinaptica, così come traccia, allo stesso tempo, tale risposta in uno degli altri elementi separati. Le strategie convenzionali utilizzando coloranti chimici per misurare la segnalazione del calcio non possono raggiungere questi due obiettivi, perché applicati a vasca di tintura è occupata da più tipi di cella dopo l'applicazione del tessuto e tintura intracellulare caricata può essere utilizzata solo per visualizzare coorti di individui o piccoli delle cellule. Qui, utilizzando topi transgenici esprimenti GECIs progettato per misurare la segnalazione del calcio cellula-specifico, insieme a specific Imaging, imaging e software strumenti⁵, dimostriamo il primo di questi due obiettivi globali e discutere come l'aggiunta di nuovi strumenti transgenici aiuterebbe a raggiungere il secondo. Questa tecnica sarà utile per chiunque sia interessato a rilevamento dinamica del calcio o altri cellulari osservabile di eventi di segnalazione attraverso sensori ottici gene-codificato in più popolazioni di cellule allo stesso tempo.

Protocol

Zootecnia e gli esperimenti sono stati effettuati conformemente alla istituti nazionali di salute Guida per la cura e uso di animali da laboratorio e il IACUC presso l'Università del Nevada.

1. preparazione dei diaframmi e nervi frenici da topi transgenici

1. Acquisto di topi transgenici e iniettori del oligonucleotide di genotipo questi topi.
   Nota: Gli iniettori sono elencati nella pagina "Informazioni" per ciascuno di questi topi.
   1. Allevare un mouse di 3-6 mesi esprimendo una copia dell'allele appropriato transgenici/knock-in Cre-driver e zero copie dell'allele GCaMP3/6 condizionale con un secondo mouse della stessa età che esprime una o due copie del condizionale GCaMP3 / 6 allele e zero copie dell'allele Cre-driver.
   2. Genotipo i cuccioli e mark quelli che hanno condizionato GCaMP3/6 alleli e Cre — questi sarà d'ora in poi chiamati topi transgenici doppio (ad es., Myf5-Cre, GCaMP3 condizionale)⁶.
      Nota: In questo modo, tutti i dati deriverà da topi che esprimono una copia del condizionale GCaMP3/6 alleli e Cre. Ciò è particolarmente importante quando l'aggiunta di queste croci in altri topi mutanti (ad es., Ko).
2. Quando i topi transgenici doppio sono di età adeguata (ad es., postnatale giorno 0 o 5 [P0 o P5] o adulto), eutanasia i topi di decapitare loro con le forbici (per topi più giovane di P10) o inserendoli in una camera di inalazione isoflurane — quando sono non è più reattivo a pizzicare la coda con un paio di pinze, sono pronti per il sacrificio.
3. Sacrificare l'animale per decapitazione con un paio di forbici.
4. Trasversalmente sezione attraverso l'intero animale appena sotto il fegato e appena sopra il cuore ed i polmoni con le forbici iridectomy.
5. Via sezionare il fegato, il cuore e i polmoni, facendo attenzione a mantenere una lunghezza del nervo frenico che è sufficientemente lungo per essere disegnata in un elettrodo di aspirazione (cioè, 1-2 cm).
   Nota: Il nervo frenico sinistro può essere identificato come un pezzo di tessuto che entra la porzione mediale del diaframma sinistro bianco. Esso non deve essere tagliato quando si rimuovono i polmoni. Il nervo frenico di destra viene eseguito all'interno di un pezzo della fascia che inoltre contiene la vena cava superiore ed è più sottile e più bianca di vena cava. Insieme, entrambi riescono a penetrare il diaframma mediale di destra.
6. Più ulteriormente rimuovere la gabbia toracica e la colonna vertebrale, fatta eccezione per la cresta sottile intorno al diaframma.
7. Posizionare il diaframma e il campione del nervo frenico in un tubo di microfuge con la soluzione di Krebs-soneria con 594-αBTX di 1 µ g/mL per 10 min al buio.
   Nota: Questa concentrazione di 594-αBTX etichette recettori ACh (AChR) senza bloccare la loro funzione (osservazione personale).

2. stimolazione e la registrazione dei potenziali d'azione muscolare

1. Utilizzando minutien perni, immobilizzare il diaframma da appuntare e su un piatto di 6 cm rivestiti con silicone gel dielettrico e pieno di ~ 8 mL di soluzione di Krebs-soneria ossigenato e posizionatelo sopra il tavolino del microscopio. Irrorare il diaframma con più soluzione di Krebs-soneria (8 mL/min) per 30 min.
   Nota: Questo risciacqua il 594-αBTX non associato, nonché equilibra il tessuto dopo la dissezione.
2. Rendere un elettrodo di aspirazione secondo i metodi stabiliti⁷.
   1. Con un ingrandimento 4x, utilizzando un micromanipolatore, spostare l'elettrodo aspirazione sopra il nervo frenico sinistro e aspirare tirando fuori la canna di una siringa 5 mL collegata al tubo che è collegato all'elettrodo di aspirazione.
      Nota: Quando correttamente disegnato nell'elettrodo di aspirazione, il nervo frenico è teso. Accendere lo stimolatore e stimolare il frenico nervo lanciando il manuale passare 1x.
   2. Assicurarsi che il diaframma si contrae in risposta alla stimolazione 1-Hz esaminando visivamente con illuminazione a campo chiaro. In caso contrario, regolare la tensione ruotando la manopola di tensione in modo incrementale per ottenere un impulso agonistica, che può essere verificato da un esame visivo della contrazione muscolare. Se ancora non è visibile, soffiare il nervo con la siringa e tentare di trarre nuovo applicando l'aspirazione.
3. Disattivare la perfusione e aggiungere la miosina del muscolo-specifico inibitore BHC⁶ o la tensione-gated del sodio canale antagonista µ-conotossina⁸ ad una concentrazione finale di 100 µM.
   1. Per rendere 100 µM BHC, 4 µ l di stock di 200 mM in DMSO e prediluire esso in 1 mL di soluzione di Krebs-soneria.
   2. Rimuovere 1 mL di soluzione di Krebs-soneria dal piatto.
   3. Aggiungere il BHC prediluito, al piatto.
      Nota: Questa prediluizione consente di impedire l'induzione di DMSO non diluito di una risposta fluorescente non transitorio in cellule che esprimono GCaMP3.
   4. Attendere 30 min e quindi attivare la perfusione di soluzione di Krebs-soneria fresca per un altro 20-30 min.
4. Preparare l'elettrodo di registrazione.
   1. Indossando guanti, inserire un vetro di borosilicato filamentato con un diametro esterno (OD) di 1 mm e un diametro interno (ID) di 0,4 mm un estrattore micropipetta e serrare le manopole per bloccarlo in posizione. Chiudere lo sportello di estrattore.
   2. Utilizzando un estrattore P-97, programmare la seguente impostazione: calore a 900, pull a 120, velocità a 75, tempo a 250, pressione a 500 e senza ulteriori cicli.
      Nota: Resistance (R) è misurata utilizzando il software di controllo dell'amplificatore: il software di acquisizione dati conferma la resistenza risolvendo la formula V = IR Il controller software passa una corrente nota (I) (in genere 1 nA) attraverso l'elettrodo e misura la variazione di tensione (V), consentendoci così di risolvere per R.
   3. Per membrane embrionali, assicurarsi che la resistenza sia vicino a 60 MΩ e per i più anziani diaframmi, 10-20 MΩ. Caricare l'elettrodo di registrazione con 3M KCl.
5. Ingrandimento 10x, abbassare l'elettrodo nel muscolo, utilizzando un micromanipolatore secondo sul lato opposto del palco come un elettrodo stimolante.
6. Utilizzando software di acquisizione dati elettrofisiologici, attendere che il potenziale di membrana di riposo cambia da 0 a -65 mV o qui sotto.
7. Stimolare a 1 Hz e verificare la presenza di un potenziale di azione muscolare controllando un grande potenziale che esibisce un modesto superamento (potenziale che si erge sopra 0 mV quando inizia il a -65 mV o qui sotto). Non confondere artefatto di stimolazione con un potenziale di azione.
   Nota: Potenziali sono significativamente più lunghi durata (~ 5 ms) di manufatti di stimolazione.

3. formazione immagine di fluorescenza del campione

1. 20 ingrandimenti, individuare il gruppo della piastra laterale al centro del muscolo cercando NMJs 594-αBTX – etichettato sotto eccitazione luce giallo/verde (550 nm). Passare per l'eccitazione di luce blu (470 nm) a immagine Ca^{2 +} risposte nel muscolo, motoneurone o cellule di Schwann.
2. Se lo si desidera, impostare la barra di divisione di immagine con filtri passa-banda e un filtro dicroico tagliente per l'imaging di doppio-lunghezza d'onda.
3. Al fine di calcolare la fluorescenza massima (Fmax) esposta dal tessuto GCaMP3/6-esprimendo, aggiungere 12 µ l 3 M di cloruro di potassio (KCl) per le preparazioni di diaframma⁶.
   1. Esperimenti con la barra della luminosità sulla barra di tabella di ricerca impostato al 110% del livello al quale il tessuto GCaMP3/6-esprimendo esibisce saturazione a 20 ingrandimenti, senza binning in risposta al KCl.
4. Registra a 20 fotogrammi al secondo per non perdere alcun evento veloce.
5. Stimolare con s 1-45 di 20-40 Hz di stimolazione del nervo fornendo un treno di impulsi utilizzando l'elettrodo aspirazione o aggiungere agonisti farmacologici da bagno applicazione o mediante perfusione e raccogliere fluorescente Ca^{2 +} risposte dinamiche nel sottotipo di una cella insieme al segnale NMJ statico 594-αBTX.
   Nota: Se tessuto-specifica rossi o da' GECI o GEVI topi diventano disponibili per l'utilizzo alle NMJ, può essere utilizzati per raccogliere due segnali dinamici che riflettono due distinti elementi cellulari alle NMJ.
6. Quando gli esperimenti elettrofisiologici o di imaging sono finiti perché sono stati raggiunti i risultati desiderati, irrorare d'acqua attraverso le linee di perfusione e succhiare l'acqua 2 x - 3 x attraverso l'elettrodo aspirazione per garantire che i sali non accumulano.

4. esportazione e analisi dei dati di una mappa con deviazione Standard di intensità di fluorescenza (SD_iu16)

1. Registrare sequenze di immagini registrate come pile TIFF 16 bit e caricarli nel sistema di analisi dati di imaging desiderato per l'analisi.
2. Nel menu file del software 8D selezionare la serie di immagini di interesse e fare clic per caricare.
   1. Una volta caricato il video, la scansione attraverso il tempo per identificare una sezione che non ha alcuna attività cellulare fluorescente.
      Nota: Questa regione verrà essere utilizzata per creare un esempio di sfondo.
   2. Tenere premuto MAIUSC e fare clic per disegnare un'area di casella di interesse (ROI) nella zona identificata come l'area del campione di sfondo.
   3. Dopo aver creato la casella, premere la barra spaziatrice per generare un grafico di cambiamento di attività di sfondo.
   4. Pulsante destro del mouse la traccia e selezionare l'opzione assortiti per presentare l'opzione per Eseguire il Dump di ROI come testo per rendere la traccia come file di testo delle coordinate xy.
3. Tornando al video di interesse, rieseguire la scansione per identificare l'area di tempo dove è in corso l'attività di interesse.
   1. Utilizzare il pulsante centrale del mouse, selezionare questa regione di tempo nella casella gialla ora.
   2. Fare clic destro sul video e selezionare Stack OPS e poi Stat mappa opzione 5.
      Nota: Questo genererà una mappa di deviazione standard (SD mappa) nella finestra di sinistra.
   3. Clicca sulla mappa SD e quindi premere il ] tasto 19 x per applicare la mappa di calore del colore appropriato.
   4. Pulsante destro del mouse la mappa SD e selezionare STM caricare e salvare, che presenterà l'opzione salvare stm come tiff per salvare la mappa di SD.
   5. Poi, premere il [ chiave 19 x per tornare alla mappa di colore in scala di grigi.
   6. Premere C e poi D per richiamare strumenti di mappatura di densità. Utilizzando il pulsante sinistro del mouse e il pulsante del mouse di centro, regolare la soglia per includere tutte le attività fluorescente mostrata nella mappa SD.
   7. Premere C per chiudere gli strumenti di densità, mantenendo le impostazioni di soglia.
   8. Pulsante destro del mouse la mappa SD e selezionare STM particelle e quindi Trovare PTCLS.
      Nota: Questo identificherà singole cellule che esprimono attività fluorescente.
   9. Pulsante destro del mouse la mappa SD ancora una volta e selezionare Creare particelle ROIs.
      Nota: Questo a sovrapporre le celle selezionate il video originale di interesse.
   10. Tenendo premuto MAIUSC, fare clic destro su uno qualsiasi della particella ora identificato ROIs il video originale.
   11. Selezionare indicatore ROI e misura Int in ROI.
       Nota: Questo genererà trame attività fluorescente individuale per ogni ROI identificati nel video di interesse. Questi può essere salvati facendo clic destro su uno qualsiasi di questi e selezionando assortiti, seguiti da Dump ROI come testo.
4. Per dettagliate logica alla base di queste operazioni, vedere il file di codice sorgente⁹.

Representative Results

Diversi esempi di cambiamenti di intensità di fluorescenza, mediate da un aumento di Ca intracellulare^{2 +} all'interno di tipi di cella definita della giunzione neuromuscolare, dimostrano l'utilità di questo approccio. Questi risultati sono presentati come mappe di intensità di fluorescenza spaziale, che forniscono la posizione delle cellule risponde, così come l'intensità delle loro risposte, consentendo in tal modo la valutazione di quante cellule rispondono e quanto ogni cella risponde ad un particolare stimolo. Ad esempio, come illustrato nella Figura 1, abbiamo preso video delle risposte Ca^{2 +} in una popolazione di terminal/perisinaptici Schwann cellule (TPSCs) presso la NMJs del diaframma di un P7 Wnt1-Cre; GCaMP3 condizionale-esprimendo il mouse in risposta alla stimolazione del nervo frenico e identificato le sottopopolazioni delle cellule risponde da mappe di intensità di fluorescenza spaziale. Queste mappe di intensità di fluorescenza sono presentate come calore mappe e color-coded secondo una tabella di ricerca di colore di fuoco (Fire CLUT). Abbiamo registrato questi video con e senza dividere l'immagine per visualizzare contemporaneamente i grappoli di AChR α-BTX-etichetta al centro del diaframma (video 1 e 2), un approccio che potrebbe essere facilmente adattato per catturare GECI dinamico o GEVI le risposte da due distinte delle cellule tipi, purché ciascuno di essi presenta eccitazione non sovrapposte e spettri di emissione.

Nella Figura 2, abbiamo effettuato lo stesso esperimento di stimolazione del nervo sul diaframma di un P4 Myf5-Cre; GCaMP3 condizionale-esprimendo il mouse e ripreso il Ca^{2 +} le risposte nelle cellule muscolari. È interessante notare che, quando abbiamo usato il blocker di miosina BHC o il muscolo scheletrico-specific tensione-gated sodio canale (Na_v1.4) blocco µ-conotossina (Figura 2A e Video 3 o Figura 2B e Video 4, rispettivamente) , abbiamo visualizzato Ca^{2 +} transitori che percorrono l'intera lunghezza della fibra muscolare, che rappresenta l'azione potenziale e mediata dal rilascio di Ca^{2 +} dal reticolo sarcoplasmatico, o semplicemente la lunghezza della banda della piastra laterale, che rappresenta il Piastra terminale potenziali e mediata da afflusso Ca^{2 +} extracellulare attraverso l'aggiunta di AChR.In all'identificazione di sottopopolazioni di cellule risponde con l'intensità di fluorescenza spaziale maps (SD mappe), come illustrato nella Figura 1, inoltre abbiamo misurato il cambiamento mapping di fluorescenza nel tempo in una popolazione di queste cellule muscolari con spatiotemporal (ST). Ognuno di questi esperimenti rappresenta un tipo di cella diversa, un'altra epoca, un trattamento diverso (stimolazione vs nervo stimolazione nervosa in presenza di diversi farmaci) e diversi tipi di analisi (spaziale vs spatiotemporal mappe di intensità di fluorescenza). Queste cifre illustrano anche una delle caratteristiche più utili di topi transgenici che esprimono GCaMP, vale a dire la capacità di stimolare ripetutamente e immagine per il campione stesso e, pertanto, verificare l'effetto delle diverse condizioni di trattamento.

Figura 1: Misurazione di attività risposte indotte da Schwann cella Ca^{2 +} nel diaframma e del nervo frenico di P7 Wnt1-Cre; topi condizionali GCaMP3 . (A) (a sinistra) un'immagine di intensità di fluorescenza media, mostrando livelli di fondo di fluorescenza in Schwann cellule lungo i rami del nervo frenico e alla giunzione neuromuscolare (NMJ), è stata catturata prima di stimolazione del nervo (Prestim). I valori di questa fluorescenza di fondo sono stati sottratti da valori di fluorescenza ottenuti dopo stimolazione del nervo. (A destra) Una mappa spaziale della deviazione standard di unità di intensità di fluorescenza di 16 bit (SDiu₁₆) di Ca^{2 +} risposte generate dopo 30 s di 40 Hz di stimolazione del nervo frenico (Stim o la SD mappa) Mostra una risposta forte nel terminal/perisinaptici Schwann cellule (TPSCs) alla giunzione neuromuscolare. Il fuoco CLUT heatmap è in SDiu₁₆ e la barra della scala è nell'ordine dei micron. Tutte le immagini in pannelli B - E sono lo stesso ingrandimento come quelli nel pannello A. (B) (a sinistra) il diaframma stesso è stato etichettato con 594-coniugato α-bungarotossina (α-BTX), che associa a etichette i ricevitori dell'acetilcolina (AChR) ed eccitati con luce giallo/verde per identificare le NMJ. (A destra) Questo pannello mostra un'immagine di campo chiaro del diaframma stesso, mostrando la punta di un elettrodo di registrazione intracellulare (freccia), che può essere guidato per un NMJ, basato sull'etichettatura di α-BTX. (C), il Ca^{2 +} caratteristiche transitorie (ad es., l'intensità, insorgenza dopo stimolazione, durata) delle singole celle o gruppi di cellule possono essere valutate dal che delimitano le singole regioni nella mappa intensità spaziale come particelle (a sinistra), che li rappresentano come color-coded regioni di interesse (ROI) e (D) tramando loro intensità nel tempo. (E), questo pannello mostra le immagini di dual-lunghezza d'onda di GCaMP3-mediata fluorescente Ca^{2 +} risposte e 594-α-labeled NMJs del diaframma stesso utilizzando lo splitter di immagine Gemini dopo stimolazione del nervo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: film senza immagine scissione dell'attività-indotta delle cellule di Schwann Ca ^{2 +} risposte alle P7, come descritto in dettaglio nella Figura 1 leggenda. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Video 2: film con immagine spaccare di attività-indotta delle cellule di Schwann Ca ^{2 +} risposte e 594- Α-BTX-labeled AChR a P7, come descritto in dettaglio nella Figura 1 leggenda. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Figura 2: Misura di indotta da attività muscolare Ca^{2 +} le risposte delle cellule nel diaframma della P4 Myf5-Cre; topi condizionali GCaMP3 . (A) (a sinistra) nicotinici AChR cluster della band in una posizione centrale della piastra laterale del diaframma sono etichettati con 594-α-BTX. (Centrale) Mappa spaziale di Ca^{2 +} transitoria intensità (SD mappa), generata dopo 30 s di 40 Hz di stimolazione del nervo frenico in presenza dell'inibitore di miosina BHC, Mostra una risposta in tutta la regione di tutte le cellule di muscolo del diaframma. (A destra) Al contrario, una SD mappa generata dal diaframma stesso dopo la stimolazione stessa, ma in presenza di Na_v1.4 antagonista µ-conotossina (µ-CTX), esibisce un spazialmente limitata risposta nella zona mediale del muscolo diaframma tutte le cellule che corrisponde alla band AChR cluster-arricchita della piastra laterale. Il fuoco CLUT heatmap è in SDiu₁₆ e la barra della scala è nell'ordine dei micron. (B), questo pannello mostra le mappe spatiotemporal del Ca^{2 +} intensità transitoria nel tempo (ST mappe) in una popolazione delle cellule di muscolo (y-asse) seguiti nel tempo (x-axis). La barra della scala è in secondi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 3: film della cellula muscolare indotta da attività Ca ^{2 +} risposte in presenza il blocker di miosina BHC di P4, come descritto in dettaglio nella Figura 2A leggenda. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Video 4: film della cellula muscolare indotta da attività Ca ^{2 +} risposte in presenza di Na _v antagonista 1,4 µ-conotossina a P4, come descritto in dettaglio nella Figura 2B leggenda. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Discussion

Qui forniamo alcuni esempi di Ca^{2 +} risposte in celle specifiche in tessuto neuromuscolare intatto facendo uso dei topi che esprimono GECI di misura. Per eseguire correttamente questi esperimenti, è imperativo di non ferire il nervo frenico durante la dissezione. Per realizzare l'immagine Ca^{2 +} risposte in cellule di Schwann a potenza alto o basso (cioè, X 20 o 60 X), è necessario utilizzare BHC o µ-conotossina al blocco movimento. Per l'imaging di bassa potenza di Ca^{2 +} risposte nelle cellule muscolari, è possibile misurare loro in assenza di queste droghe, permettendo così l'acquisizione simultanea di muscolo e muscolo Ca^{2 +} transitoria intensità cambiamenti di lunghezza durante ad alta frequenza del nervo stimolazione⁶. Quando si esegue esperimenti multipli sullo stesso campione, è necessario separare ogni uno di almeno 15 minuti, durante i quali il campione può essere irrorato. Questa procedura consente per l'imaging ripetuto di stimolazione-Ca^{2 +} risposte indotte dallo stesso campo di vista nello stesso campione per almeno 3-5 ore. È anche fondamentale ai farmaci prediluiti dissolti in DMSO come descritto per BHC, come DMSO applicato direttamente sul tessuto GCaMP-esprimendo induce le risposte fluorescenza irreversibile, stimolo-indipendente.

Abbiamo trovato che per motivi che non sono chiare, Wnt1-Cre; conditionalGCaMP3/6 topi non esibiscono la stimolazione del nervo o indotta da agonista Ca^{2 +} risposte in cellule di Schwann dopo P15 - P20. Tuttavia, Sox10-Cre; condizionale GCaMP3/6 topi continuano ad esibire queste risposte almeno quanto più tardi P56, l'età più antica che abbiamo esaminato. Al contrario, Myf5-condizionale GCaMP3/6 topi mostrano risposte vecchie come un anno, la più antica età esaminati.

Mentre i topi che esprimono GECI forniscono opportunità uniche per l'imaging di Ca^{2 +} risposte in intere popolazioni delle cellule di un sottotipo specifico, ci sono alcune limitazioni, come l'incapacità di eseguire raziometrici imaging e, così, estrarre Ca quantitativa ^{2 +} misurazioni. Vi sono inoltre limiti alla quantità di profondità del tessuto da cui queste risposte possono essere imaged utilizzando la microscopia a fluorescenza widefield (cioè, rispetto all'utilizzo di microscopia confocale o multifotonica). Pertanto, mentre la magrezza del diaframma è favorevole per l'applicazione delle tecniche qui presentate, catturando cella-Ca^{2 +} risposte specifiche in tipi cellulari della giunzione neuromuscolare in altri muscoli che sono più spessi può richiedere Sub-dissezione o altri tipi di microscopia di fluorescenza.

Questi strumenti genetici ed ottici rappresentano un progresso significativo sulla precedente Ca^{2 +} tecniche, di cui solo più tipi di cellule o poche cellule individuali all'interno di tipo una cella potrebbero essere imaged di imaging. Un ulteriore vantaggio è che Ca^{2 +} le risposte possono essere ripetibile imaged per lunghi periodi di tempo dalle stesse cellule utilizzando topi GECI, considerando che questo non è facilmente possibile utilizzando tradizionali chimico Ca^{2 +}-associazione coloranti fluorescenti. Infine, utilizzando un'immagine splitter, eseguire l'imaging dual-lunghezza d'onda di un segnale dinamico all'interno tipo un cellulare (cellule di Schwann) e un'etichetta fissa all'interno di un secondo (cellule muscolari) e, quindi, mostrano come più cellula-specifico calcio o tensione le risposte possono essere valutati ( ad esempio, un mouse cellula di Schwann Cre-guida attraversato a un topo Cre-dipendente GCaMP condizionale come segnalato qui, attraversato a un topo transgenico Cre-indipendente esprimendo un muscolo-specifico GECI o GEVI con eccitazione di fluorescenza non sovrapposte / spettri di emissione¹⁰, consentirebbe il rilevamento simultaneo di Ca^{2 +} e/o tensione cambiamenti dinamici in cellule di muscolo e Schwann). Tali strumenti potrebbero aiutare a valutare se la risposta di una cellula tipo ad uno stimolo specifico, come la purina ATP o sua adenosina di prodotto di ripartizione, è diretto o indirettamente mediato da un effetto diretto su un altro tipo di cella a giunzione neuromuscolare.

L'obiettivo principale di questi studi era di valutare il spatiotemporal Ca^{2 +} modello di risposta dei sottotipi di cella a stimolo del nervo, ma le tecniche impiegate per raggiungere questo obiettivo possono essere distribuite verso altri obiettivi. Per esempio, può essere utilizzati per analizzare il Ca^{2 +} le risposte in presenza di alcuni antagonisti o in determinati ambiti di provenienza mutante, come in specifici modelli animali di malattia del motoneurone, distrofia muscolare o malattia di Charcot-Marie Tooth, per analizzare il CA^{2 +} risposta agli agonisti specifici per valutare l'espressione del ricevitore, per valutare l'eterogeneità delle funzioni Ca^{2 +} risposta all'interno di un sottotipo di cellule ad uno stimolo, o per confrontare Ca^{2 +} risposte in un sottotipo di cella per altro funzionale risposte all'interno di quel tipo (potenziali di azione o della piastra laterale del muscolo electrophysiologically registrato, accorciamento muscolare imaged otticamente, la tensione muscolare forza-trasduttore-registrata, ecc.) o ad altri parametri (ad es., post hoc valutazione della morfologia delle cellule di Schwann del nervo/muscolo o espressione molecolare tramite immunoistochimica). Insieme, questi studi mostrano come cellula-specifico GECI o topi GEVI possono essere utilizzati per illuminare un ampio spettro di processi fisiologici ad una sinapsi composto da ingressi geneticamente identificabili, cellula-specifico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myf5-Cre mice	Jax	#007893	Drives muscle cell expression as early as E136
Wnt1-Cre mice	Jax	#003829	Drives expression into all  Schwann cells at E13 but not P209
Sox10-Cre mice	Jax	#025807	Drives Schwann cell expression at older ages
Conditional GCaMP3 mice	Jax	#029043	Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion
Conditional GCaMP6f mice	Jax	#024105	Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion
BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)	Hit2Lead	#5102862	Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ
µ-conotoxin GIIIb	Peptides Int'l	#CONO20-01000	Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8
Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel .9KG	Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins
Minutien pins (0.1mm diameter)	Fine Science Tools	26002-10	Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel
Eclipse FN1 upright microscope	Nikon	MBA74100	Allows staging and observation of specimen
Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator	Autom8	MXMScr	Allows movement of specimen
Manual micromanipulator	Narishige	M-152	Holds recording and stimulating electrodes
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Axoclamp 900A	Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording
Microelectrode low-noise data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1550	Allows electrophysiological data acquisition
Microelectrode data analysis system	Molecular Devices	PCLAMP 10 Standard	Performs electrophysiological data analysis
Square wave stimulator	Grass	S48	Stimulates nerve to excite muscle
Stimulus Isolation Unit	Grass	PSIU6	Reduces  stimulation artifacts
Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter	Sutter	FG-GBF100-50-15	Impales and records nerve-evoked muscle potentials
Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter	Sutter	BF150-117-15	Lengthened and used for suction electrode
Micropipette Puller	Sutter	P-97	Pulls and prepares recording electrodes
1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera	Photometrics	Prime 95b	Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging
Light Source	Lumencor	Spectra X	Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation
Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm	Nikon	CFI60	Provide long working distances for visualization of specimen
Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp	Sumita	LS-DWL-N	Provides illumination for brightfield observation
W-View Gemini Image Splitter	Hamamatsu	A12801-01	Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera
Single-band Bandpass Filters  (512/25-25 and 630/92-25)	SemRock	FF01-512/25-25; FF01-630/92-25	Permits dual band imaging
560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging
Imaging data acquisition system	Nikon	NIS Elements - MQS31000	Allows imaging data acquisition
Wavelength control module	Nikon	MQS41220	Module for imaging data acqusiition
Emission splitter hardware module	Nikon	MQS41410	Module for imaging data acqusiition
Imaging data analysis system	NA	Volumetry 8D5, Fiji	Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data