Ex Vivo Avbildning av Cell-specifika Calcium signalering vid trepartsavtal synapsen av mus membranet

Summary

Här presenterar vi ett protokoll till bild calcium signalering i populationer av enskilda celltyper vid neuromuskulär murint korsningen.

Abstract

Den elektriska aktiviteten hos celler i vävnader kan övervakas av elektrofysiologiska tekniker, men dessa är vanligtvis begränsad till analysen av enskilda celler. Eftersom en ökning av intracellulärt kalcium (Ca^{2 +}) i cytosolen uppstår ofta på grund av den elektriska aktiviteten eller svar på en myriad av andra stimuli, kan denna process övervakas av laddad bildtagning av celler med fluorescerande kalcium känsliga färgämnen.  Det är dock svårt att bild detta svar i en enskild celltyp inom hela vävnad eftersom dessa färgämnen tas upp av alla celltyper i vävnaden. Däremot genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs) kan uttryckas genom en enskild celltyp och fluorescerar i svar på en ökning av intracellulära Ca^{2 +}, därför tillåter avbildning av Ca^{2 +} signalering i hela populationer av enskild celltyper. Här tillämpar vi användningen av den GECIs GCaMP3/6 till den mus neuromuskulära förbindelsen, en tredelad synapsen mellan motoriska nervceller, skelettmuskel och terminal/perisynaptic Schwann celler. Vi visar nyttan av denna teknik i klassiska ex vivo vävnad preparat. Använder en optisk splitter, utför vi dual-våglängd avbildning av dynamiska Ca^{2 +} signaler och statiska etikett av den neuromuskulära förbindelsen (NMJ) i en strategi som kunde anpassas enkelt övervaka två-specifika GECI eller genetiskt kodade spänning indikatorer (GEVI) samtidigt. Slutligen diskuterar vi de rutiner som används för att fånga rumsliga kartor över fluorescensintensiteten. Tillsammans, kan dessa optiska, transgena och analytiska tekniker användas för att studera den biologiska aktiviteten av distinkta cell subpopulations på NMJ i en mängd olika sammanhang.

Introduction

NMJ, som alla synapser, består av tre delar: en presynaptiska terminal härrör från en neuron, en postsynaptiska neuron/effektor cell, och en perisynaptic glial cell^1,2. Medan de grundläggande aspekterna av synaptisk transmission visades först på denna synaps³, många aspekter av denna process är fortfarande okända, delvis på grund av uttrycket av samma molekyler av de distinkta cellulära element av denna synaps. Till exempel uttrycks receptorer för både purin adenin-nukleotid ATP och acetylkolin (ACh), som släpps tillsammans av motoriska nervceller på den vertebrate NMJ, av muskel, Schwann celler och motoriska nervceller, vilket komplicerar tolkningen av någon funktionell påverkan utövas av dessa ämnen (t.ex., sändare release eller svar, muskel styrkebidrag)⁴. Dessutom, även om trepartsavtal komponenterna i NMJ är enkla jämfört, exempelvis nervceller i det centrala nervsystemet som ofta uppvisar flera synaptic ingångar, om motoriska nervceller, muskelceller eller Schwann celler varierar som svar på stimuli baserat på deras inneboende heterogenitet (e.g.embryonala härledning, fiber subtyp, morfologi) är oklart. För att ta upp alla dessa frågor, skulle det vara fördelaktigt att samtidigt spåra svaren av många celler inom en synaptic element, samt track, på samma gång, sådant svar antingen andra separata element. Konventionella strategier använder kemiska färgämnen för att mäta Kalciumsignalering kan inte uppnå dessa två mål, eftersom bad-tillämpad färgämnet tas upp av flera celltyper efter ansökan till vävnad, och intracellulärt laddade färgämne kan endast användas för att visualisera enskilda eller små kohorter av celler. Här, utnyttja transgena möss att uttrycka GECIs utformat för att mäta cell-specifika Kalciumsignalering, tillsammans med särskilda imaging och programvara verktyg⁵, vi visar först av dessa två övergripande mål och diskutera hur tillägg av nya transgena verktyg skulle bidra till att uppnå andra. Denna teknik kommer att vara användbar för alla som är intresserade av att spåra kalcium dynamics eller andra cellulär signalering händelser observeras genom gen-kodade optiska sensorer i flera cellpopulationer samtidigt.

Protocol

Djurhållning och experiment utfördes i enlighet med den nationella institut för hälsa Guide för vård och användning av laboratoriedjur och i IACUC på vid University of Nevada.

1. beredning av membraner och Phrenic nerver från transgena möss

1. Köpa transgena möss och oligonukleotiden primers till genotyp dessa möss.
   Obs: Primers listas på sidan ”Information” för var och en av dessa möss.
   1. Föder upp en 3 - till 6-månad-gammal mus som uttrycker en kopia av den lämpliga transgen/inpressning Cre-driver allelen och noll kopior av den villkorliga GCaMP3/6 -allelen med andra musen i samma ålder att uttrycka en eller två kopior av villkorliga GCaMP3 / 6 allel och noll kopior av Cre-driver-allelen.
   2. Genotyp den pups och mark de som har både Cre och villkorlig GCaMP3/6 alleler — dessa kommer hädanefter att kallas dubbel-transgena möss (t.ex., Myf5-Cre, villkorlig GCaMP3)⁶.
      Obs: Detta sätt alla data kommer att härleda från möss som uttrycker en kopia av både Cre och villkorlig GCaMP3/6 alleler. Detta är särskilt viktigt när du lägger i andra muterade möss (t.ex., knockouts) till dessa kors.
2. När dubbel-transgena möss är i lämplig ålder (t.ex., postnatal dag 0 eller 5 [P0 eller P5] eller vuxen), eutanasi möss genom halshugger dem med sax (för möss yngre än P10) eller genom att placera dem i en isofluran inandning kammare — när de är inte längre mottaglig för klämmande svansen med ett par pincett, de är redo för offer.
3. Offra djur genom halshuggning med en sax.
4. Tvären avsnitt över hela djuret bara under levern och strax ovanför hjärtat och lungorna med iridektomi sax.
5. Dissekera bort levern, hjärtat och lungorna, vara noga med att upprätthålla en längd av phrenic nerv som är tillräckligt lång att dras in i en sug elektrod (dvs, 1-2 cm).
   Obs: Den vänstra phrenic nerven kan identifieras som en vit bit vävnad som anger den mediala delen av vänstra membranet. Det måste inte klippas när du tar bort lungorna. Den rätt phrenic nerven körs inom en lappa av fascia som också innehåller den överlägsna vena cava och är tunnare och vitare än vena cava. Tillsammans, de båda tränger igenom höger mediala membranet.
6. Ytterligare ta bort bröstkorgen och kotpelare, utom tunna åsen runt membranet.
7. Placera membranet och phrenic nerv provet i ett mikrofugrör med Krebs-Ringer-lösning med 1 µg/mL 594-αBTX i 10 min i mörker.
   Obs: Denna koncentration av 594-αBTX etiketter ACh-receptorer (AChRs) utan att blockera deras funktion (personlig observation).

2. stimulering och registrering av de muskel handlingspänningar

1. Använder minutien stift, immobilisera membranet genom att fästa den på en 6-cm skålen belagd med silikon dielektriskt gel och fylld med ~ 8 mL syresatt Krebs-ringsignalen och placera den på Mikroskop scenen. BEGJUTA membranet med mer Krebs-Ringer-lösning (8 mL/min) för 30 min.
   Obs: Detta sköljer den obundna 594-αBTX, samt balanserar vävnaden efter dissektion.
2. Göra en sug elektrod enligt den etablerade metoder⁷.
   1. På 4 X förstoring, med hjälp av en micromanipulator, flytta sug elektroden över den vänstra phrenic nerven och tillämpa sug genom att dra ut trumman av en 5 mL spruta ansluten till slangen som är kopplad till sug elektroden.
      Obs: När framgångsrikt dras in i sug elektroden, den phrenic nerven är spända. Slå på stimulatorn och stimulera den phrenic nerv genom att vända det manuellt växlar 1 x.
   2. Se till att membranet kontrakt som svar på den 1-Hz stimuleringen genom att visuellt undersöka det med brightfield belysning. Om inte, justera spänningen genom att vrida reglaget spänning stegvis för att uppnå en supramaximal puls, som kan verifieras genom en visuell undersökning av muskelkontraktion. Om fortfarande inte synliga, blåsa ut nerven med sprutan och försöker rita det igen genom att tillämpa sug.
3. Stäng av perfusionen och lägga till den muskel-specifika myosin hämmare BHC⁶ eller de spänningskänsliga natriumkanaler kanal antagonist µ-conotoxin⁸ till en slutlig koncentration på 100 µM.
   1. För att göra 100 µM BHC, Pipettera 4 µL av 200 mM lager i DMSO och predilute det i 1 mL Krebs-ringsignalen lösning.
   2. Ta bort 1 mL Krebs-ringsignalen lösning från skålen.
   3. Lägg till den prediluted BHC, till skålen.
      Obs: Denna förspädningen förhindrar induktion av outspädd DMSO av ett icke-övergående fluorescerande svar i GCaMP3-uttryckande celler.
   4. Vänta 30 minuter och slå sedan på perfusionen av färska Krebs-Ringer-lösning för en annan 20-30 min.
4. Förbereda inspelning elektroden.
   1. Bär handskar, placera en filamented borosilikatglas med en ytterdiameter (OD) 1 mm och en inre diameter (ID) av minst 0,4 mm i en mikropipett avdragare och dra åt rattarna för att klämma det in i position. Stäng luckan till avdragare.
   2. Med hjälp av P-97 avdragare, programmera följande inställning: värme vid 900, pull vid 120, hastighet på 75, tid på 250, trycket på 500, och ingen ytterligare slingor.
      Obs: Resistance (R) mäts med hjälp av programvara kontroller av förstärkaren: data förvärv programvaran bekräftar motstånd genom att lösa formeln V = IR. Den programvara controller passerar en känd ström (I) (typiskt 1 nA) genom elektroden och mäter förändringar i spänning (V), vilket gör det möjligt för oss att lösa för R.
   3. För embryonala membraner, se till att motståndet är nära 60 MΩ, och för äldre membraner, 10-20 MΩ. Ladda inspelning elektroden med 3 M KCl.
5. Vid 10 X förstoring, lägre elektroden i muskel, med en andra micromanipulator på motsatt sida av scenen som en stimulerande elektrod.
6. Med hjälp av elektrofysiologiska data förvärv programvara, vänta tills vilande membranpotentialen ändras från 0 till -65 mV eller lägre.
7. Stimulera på 1 Hz och kontrollera förekomsten av en muskel aktionspotential genom att kontrollera en stor potential som uppvisar en blygsam överskridande (potential som stiger över 0 mV när det börjar på -65 mV eller lägre). Förväxla inte stimulering artefakt med en aktionspotential.
   Obs: Potentialer är betydligt längre varaktighet (~ 5 ms) än stimulering artefakter.

3. avbildning av fluorescensen av provet

1. Leta upp endplate bandet i mitten av muskeln vid 20 X förstoring, genom att leta 594-αBTX – märkt NMJs under grön/gul ljus excitation (550 nm). Byta till blå ljus excitation (470 nm) till bild Ca^{2 +} svaren i muskel, motor neuron eller Schwann celler.
2. Om du vill ställa in image splitter med bandpass filter och singel-kant dikroiskt filter för den dubbla-våglängd avbildning.
3. För att beräkna den maximala fluorescens (Fmax) ut av GCaMP3/6-uttryckande vävnad, lägga 12 µL 3 M kaliumklorid (KCl) till membran preparat⁶.
   1. Utföra experiment med ljusstyrkefältet på baren sökning tabell anges till 110% av den nivå vid vilken GCaMP3/6-uttryckande vävnaden uppvisar mättnad på 20 X förstoring, utan binning svar på KCl.
4. Registrera på 20 bildrutor per sekund för att inte missa några snabba händelser.
5. Stimulera med 1-45 s 20-40 Hz av nervstimulering genom att leverera ett tåg av impulser med sug elektroden eller lägga till farmakologiska agonister av bad program eller av perfusion och samla in dynamiska fluorescerande Ca^{2 +} svar i en cell subtyp tillsammans med statisk 594-αBTX NMJ signalen.
   Obs: Om vävnadsspecifika röd eller mån GECI eller GEVI möss blir tillgängliga för användning på NMJ, de kan användas att samla två dynamiska signaler återspeglar två distinkta cellulära element på NMJ.
6. När imaging eller elektrofysiologiska experimenten är klar eftersom önskat resultat har uppnåtts, BEGJUTA vatten genom raderna perfusion och suga vatten 2 x - 3 x genom sug elektroden att säkerställa att salter inte bygga.

4. export och analys av Data genom en standardavvikelse karta av fluorescensintensiteten (SD_iu16)

1. Spela in bildsekvenser som registrerats som 16-bitars TIFF stackar och ladda in dem i den önskade data analys bildsystem för analys.
2. I programvarans 8d Arkiv-menyn, Välj bildstapel av intresse och klicka för att ladda.
   1. När videon laddar, skanna igenom tid att identifiera ett avsnitt som har ingen cellulär fluorescerande aktivitet.
      Obs: Denna region kommer att användas att skapa en bakgrund prov.
   2. Håll ned SKIFT och klicka på Rita en region av intresse (ROI) rutan i området identifieras som provet bakgrundsområdet.
   3. Efter att skapa rutan, tryck på mellanslagstangenten för att generera en tomt på bakgrund aktivitet förändring.
   4. Högerklicka på tracen och blandade väljer att presentera alternativet Dumpa ROI som text att göra tracen som en xy samordna textfil.
3. Flytta tillbaka till video av intresse, skanna igen för att identifiera regionen tid var aktiviteten av intresse uppstår.
   1. Markera med mittenmusknappen denna tid region i rutan gul.
   2. Högerklicka på videon och välj Stack OPS och sedan Stat karta alternativ 5.
      Obs: Detta genererar kartan standardavvikelsen (SD karta) i det vänstra fönstret.
   3. Klicka på kartan för SD och sedan tryck på de ] knappa 19 x att tillämpa lämplig färg stresskartan.
   4. Högerklicka i SD kartan och välj STM Ladda och spara, som kommer att presentera alternativet Spara stm som tiff Spara SD kartan.
   5. Sedan, tryck på den [ nyckel 19 x att återgå till en gråskala färgkarta.
   6. Tryck C och sedan D för att få upp densitet kartläggning verktyg. Använda vänster musknapp och center musknappen, justera tröskeln för att inkludera alla fluorescerande aktivitet visas i SD kartan.
   7. Tryck C för att stänga de density verktyg samtidigt som inställningen tröskelvärde.
   8. Högerklicka i SD kartan och välj STM partiklar och sedan Hitta PTCLS.
      Obs: Detta kommer att identifiera enskilda celler som uttrycker fluorescerande aktivitet.
   9. Högerklicka på SD kartan en gång till och välj Skapa partikel ROIs.
      Obs: Detta kommer ovanpå de markerade cellerna på den ursprungliga videon av intresse.
   10. Håll SKIFToch högerklicka på någon av de nu identifierade partikeln ROIs på den ursprungliga videon.
   11. Välj ROI markör och mått Int i ROI.
       Obs: Detta kommer att generera individuella fluorescerande aktivitet tomter för varje identifierad ROI i videon av intresse. Dessa kan sparas genom att högerklicka på någon av dessa och välja Assorted, följt av Dumpa ROI som text.
4. För detaljerad logiken dessa operationer, se källa koden fil⁹.

Representative Results

Flera exempel på fluorescens intensitet förändringar, medieras av ökningar av intracellulära Ca^{2 +} inom definierade celltyper av NMJ, visar nyttan av detta synsätt. Dessa resultat presenteras som rumsliga fluorescens intensitet kartor, som ger platsen för reagerande celler, liksom intensiteten av deras svar, vilket möjliggör utvärdering av hur många celler svarar och hur mycket varje cell reagerar på ett visst stimulanser. Till exempel, som visas i figur 1, tog vi videor av Ca^{2 +} svaren i en population av terminal/perisynaptic Schwann celler (TPSCs) på NMJs av membranen av en P7 Wnt1-Cre; villkorlig GCaMP3-uttrycker mus som svar på stimulering av phrenic nerv och subpopulationer av de reagerande cellerna av rumsliga fluorescens intensitet kartor. Dessa kartor över fluorescensintensiteten presenteras som värme kartor och färgkodade enligt en brand färgtabellen (brand CLUT). Vi spelade in dessa filmer med och utan uppdelning på bilden för att samtidigt Visa kluster av α-BTX-märkt AChRs mitt i mellangärdet (video 1 och 2), en strategi som kunde enkelt anpassas till fånga dynamiska GECI eller GEVI Svaren från två olika cell typer, förutsatt att var och en av dem uppvisar icke-överlappande excitation och utsläpp spektra.

I figur 2, vi utfört samma nerv stimulering experiment på membranen av en P4 Myf5-Cre; villkorlig GCaMP3-uttrycker mus och avbildas Ca^{2 +} svaren i muskelcellerna. Intressant, när vi använde antingen av myosin blockerare BHC eller den skeletal muscle-specifika spänningskänsliga natrium kanal (Na_v1.4) blockerare µ-conotoxin (figur 2A och Video 3 eller figur 2B och Video 4, respektive) , vi visualiseras Ca^{2 +} transienter som reser hela längden av muskelfibern, som motsvarar åtgärder potentiella och medierad av frisläppandet av Ca^{2 +} från det sarkoplasmatiska retiklet, eller bara längden på endplate bandet, som representerar den endplate potentiella och medierad av extracellulära Ca^{2 +} inflödet genom AChR.In tillägg till identifiera subpopulations av reagerande celler med rumsliga fluorescensintensiteten kartor (SD), enligt figur 1, Vi mätte även förändringen i fluorescens över tid i en population av dessa muskelceller med spatiotemporal (ST) kartor. Var och en av dessa experiment representerar en annan celltyp, en annan tidsålder, en annan behandling (nerv stimulering vs. nervstimulering i närvaro av olika droger) och olika typer av analyser (rumsliga vs. spatiotemporal fluorescensintensiteten kartor). Dessa siffror illustrerar också en av de mest användbara funktionerna i transgena GCaMP-uttryckande möss, nämligen möjligheten att stimulera upprepade gånger och bild samma prov och, därför, testa effekten av olika behandling villkor.

Figur 1: Mätning av aktivitet-inducerad Schwann cell Ca^{2 +} svaren i diafragma och phrenic nerv av P7 Wnt1-Cre; villkorlig GCaMP3 möss. (A) (vänster) en genomsnittlig fluorescens intensitet bild, visar bakgrundsnivåer av fluorescens i Schwann celler längs phrenic nerv grenarna och vid den neuromuskulära förbindelsen (NMJ), fångades innan nervstimulering (Prestim). Värdena för denna bakgrund fluorescens var subtraheras från fluorescens värden erhålls efter nervstimulering. (Höger) En geografisk karta över standardavvikelsen för 16-bitars fluorescens intensitet enheter (SDiu₁₆) av Ca^{2 +} Svaren genereras efter 30 s 40 Hz av phrenic nervstimulering (Stim karta eller SD-karta) visar en robust svar i den terminal/perisynaptic Schwann celler (TPSCs) på NMJ. Brand CLUT heatmap är i SDiu₁₆ och skalstapeln är i mikron. Alla bilder i paneler B - E är samma förstoring som i panel A. (B) (vänster) samma membranet var märkt med 594-konjugerad α-bungarotoxin (α-BTX), som binder till och etiketter acetylkolinreceptorer (AChRs), och upphetsad med grön/gult ljus att identifiera NMJ. (Höger) Denna panel visar en brightfield bild av samma membranet, visar spetsen av en intracellulär inspelning elektrod (pil), som kan styras till en NMJ, baserat på α-BTX märkning. (C), Ca^{2 +} övergående funktioner (t.ex., intensitet, debut efter stimulering, varaktighet) av enskilda celler eller grupper av celler kan utvärderas av avgränsar enskilda regioner i rumsliga intensitet kartan som partiklar (vänster), som företräder dem som färgkodade områden av intresse (ROIs) och (D) rita sin intensitet över tid. (E), denna panel visar dual-våglängd bilder av GCaMP3-medierad fluorescerande Ca^{2 +} svaren och 594-α-märkt NMJs i samma membranen med Gemini image splitter efter nervstimulering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video 1: film utan bild dela av aktivitet-inducerad Schwann cell Ca ^{2 +} svar på P7, som beskrivs i detalj i den Figur 1 legend. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Video 2: film med bild dela av aktivitet-inducerad Schwann cell Ca ^{2 +} svaren och 594- Α-BTX-märkt AChRs på P7, som beskrivs i detalj i den Figur 1 legend. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Figur 2: Mätning av aktivitet-inducerad muskel cell Ca^{2 +} svaren i membranen av P4 Myf5-Cre; villkorlig GCaMP3 möss. (A) (vänster) Nicotinic AChR kluster av centralt belägna endplate bandet av membranet är märkta med 594-α-BTX. (Mitten) En geografisk karta över Ca^{2 +} övergående stödnivåer (SD karta), genereras efter 30 s 40 Hz av phrenic nervstimulering i närvaro av den myosin-hämmaren BHC, visar ett svar i hela regionen av alla membran muskelceller. (Höger) Däremot en SD-karta som genereras från samma membranet efter samma stimulering, men i närvaro av den Na_v1.4 antagonist µ-conotoxin (µ-CTX), uppvisar en rumsligt begränsade svar i regionen mediala i alla membranet muskel celler som motsvarar AChR kluster-berikad endplate bandet. Brand CLUT heatmap är i SDiu₁₆ och skalstapeln är i mikron. (B) denna panel visar spatiotemporal kartor över Ca^{2 +} övergående stödnivåer över tiden (ST kartor) i en population av muskelceller (y-axeln) följs över tid (x-axeln). Skalstapeln är i sekunder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video 3: film av aktivitet-inducerad muskelcellen Ca ^{2 +} svaren i närvaro av myosin blockeraren BHC på P4, som beskrivs i detalj i den Figur 2A legend. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Video 4: film av aktivitet-inducerad muskelcellen Ca ^{2 +} svaren i närvaro av Na _v 1.4 antagonist µ-conotoxin på P4, som beskrivs i detalj i den Figur 2B legend. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Discussion

Här ger vi några exempel på mätning Ca^{2 +} svaren i särskilda celler i intakt neuromuskulära vävnad med hjälp av GECI-uttryckande möss. För att kunna utföra dessa experiment, är det viktigt att inte skada den phrenic nerven under dissektion. För att bild Ca^{2 +} svaren i Schwann celler vid antingen låg eller hög effekt (dvs.20 X eller 60 X), är det nödvändigt att använda antingen BHC eller µ-conotoxin block rörlighet. För lågenergi-avbildning av Ca^{2 +} svaren i muskelcellerna är det möjligt att mäta dem i avsaknad av dessa droger, således tillåter samtidiga förvärvet av muskel Ca^{2 +} övergående stödnivåer och muskel längd förändringar under hög frekvens nerv stimulering⁶. När du utför flera experiment på samma prov, är det nödvändigt att skilja var och en av minst 15 minuter, under vilken tid provet kan vara perfusion. Så här tillåter upprepad bildtagning av stimulering-inducerad Ca^{2 +} svar från samma synfält i samma prov i minst 3-5 timmar. Det är också kritisk till predilute droger upplöst i DMSO som beskrivs för BHC, som DMSO appliceras direkt på GCaMP-uttryckande vävnad framkallar irreversibla, stimulans-oberoende fluorescens svaren.

Vi fann att för oklara skäl, Wnt1-Cre; conditionalGCaMP3/6 möss inte uppvisar nervstimulering eller agonist-inducerad Ca^{2 +} svaren i Schwann celler efter P15 - P20. Dock Sox10-Cre; villkorlig GCaMP3/6 möss fortsätter att uppvisa dessa svar åtminstone så sent som P56, den äldsta tidsåldern som vi har undersökt. Myf5-villkorad GCaMP3/6 möss uppvisar däremot Svaren lika gammal som ett år, den äldsta ålder undersöktes.

Medan GECI-uttryckande möss ger unika möjligheter för imaging Ca^{2 +} svaren i hela populationer av celler av en specifik undertyp, finns det vissa begränsningar, såsom oförmåga att utföra proportionerlig imaging och, således, extrahera kvantitativ Ca ^{2 +} mätningar. Det finns också begränsningar till beloppet av djup vävnad varifrån dessa svar kan avbildas med widefield fluorescensmikroskopi (dvs.i motsats till använda confocal eller multiphoton mikroskopi). Medan tunnhet av membranet är mottaglig för tillämpningen av de tekniker som presenteras här, fånga-specifika Ca^{2 +} svaren i celltyper av NMJ i andra muskler som är tjockare kan därför kräva sub dissektion eller andra typer av fluorescensmikroskopi.

Dessa genetiska och optiska verktyg utgör ett betydande framsteg över tidigare Ca^{2 +} avbildningstekniker, som endast flera celltyper eller några enskilda celler inom en celltyp kunde avbildas. En ytterligare fördel är att Ca^{2 +} Svaren kan repeatably avbildas för längre tid från samma celler med hjälp av GECI möss, detta är inte enkelt möjligt med traditionella kemiska Ca^{2 +}-bindande fluorescerande färgämnen. Slutligen använder en bild-splitter kan vi utföra dual-våglängd avbildning av en dynamisk signal inom en celltyp (Schwann celler) och en fast etikett inom en sekund (muskelceller) och, således, visar hur flera-specifika kalcium eller spänning Svaren kan vara utvärderas) t.ex., en Schwann cell Cre-driving mus korsade till en villkorlig Cre-beroende GCaMP mus som redovisas här, korsade till en transgen Cre-oberoende mus som uttrycker en muskel cell-specifika GECI eller GEVI med icke-överlappande fluorescens excitation / utsläpp spectra¹⁰, skulle tillåta samtidig spårning av dynamiska Ca^{2 +} och/eller spänning förändringar i både Schwann och muskel celler). Sådana verktyg kan bidra till att utvärdera om en celltyp svar till ett specifikt stimulus, såsom purin ATP eller dess nedbrytnings produkt adenosin, är direkt eller indirekt medierad av en direkt effekt på en annan celltyp på NMJ.

Det huvudsakliga målet med dessa studier var att utvärdera spatiotemporal Ca^{2 +} svar mönstret av cell undertyper till nervstimulering, men de tekniker som används för att uppnå detta kan distribueras mot andra mål. Till exempel, de kan användas för att analysera Ca^{2 +} svaren i närvaro av vissa antagonister eller i vissa muterade bakgrunder, såsom i specifika djurmodeller av motorneuron sjukdom, muskeldystrofi eller Charcot-Marie-Tooth sjukdom, att analysera den Ca^{2 +} svar på specifika agonister att utvärdera receptoruttryck, att bedöma heterogena Ca^{2 +} svar funktioner inom en cell undertyp för ett stimulus, eller att jämföra Ca^{2 +} svar i en cell undertyp till andra funktionella svar inom den typen (elektrofysiologiskt inspelade muskel endplate eller åtgärd potentialer, optiskt avbildad muskel förkorta, kraft-givare-inspelade muskelspänningar, etc.) eller till andra parametrar (t.ex., post hoc utvärdering av nerv/muskel Schwann cellmorfologi eller molekylär uttryck via immunohistokemi). Tillsammans, dessa studier visar hur cell-specifika GECI eller GEVI möss kan användas för att belysa ett brett spektrum av fysiologiska processer på en synaps som består av genetiskt identifierbar, cell-specifika ingångar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myf5-Cre mice	Jax	#007893	Drives muscle cell expression as early as E136
Wnt1-Cre mice	Jax	#003829	Drives expression into all  Schwann cells at E13 but not P209
Sox10-Cre mice	Jax	#025807	Drives Schwann cell expression at older ages
Conditional GCaMP3 mice	Jax	#029043	Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion
Conditional GCaMP6f mice	Jax	#024105	Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion
BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)	Hit2Lead	#5102862	Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ
µ-conotoxin GIIIb	Peptides Int'l	#CONO20-01000	Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8
Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel .9KG	Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins
Minutien pins (0.1mm diameter)	Fine Science Tools	26002-10	Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel
Eclipse FN1 upright microscope	Nikon	MBA74100	Allows staging and observation of specimen
Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator	Autom8	MXMScr	Allows movement of specimen
Manual micromanipulator	Narishige	M-152	Holds recording and stimulating electrodes
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Axoclamp 900A	Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording
Microelectrode low-noise data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1550	Allows electrophysiological data acquisition
Microelectrode data analysis system	Molecular Devices	PCLAMP 10 Standard	Performs electrophysiological data analysis
Square wave stimulator	Grass	S48	Stimulates nerve to excite muscle
Stimulus Isolation Unit	Grass	PSIU6	Reduces  stimulation artifacts
Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter	Sutter	FG-GBF100-50-15	Impales and records nerve-evoked muscle potentials
Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter	Sutter	BF150-117-15	Lengthened and used for suction electrode
Micropipette Puller	Sutter	P-97	Pulls and prepares recording electrodes
1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera	Photometrics	Prime 95b	Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging
Light Source	Lumencor	Spectra X	Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation
Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm	Nikon	CFI60	Provide long working distances for visualization of specimen
Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp	Sumita	LS-DWL-N	Provides illumination for brightfield observation
W-View Gemini Image Splitter	Hamamatsu	A12801-01	Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera
Single-band Bandpass Filters  (512/25-25 and 630/92-25)	SemRock	FF01-512/25-25; FF01-630/92-25	Permits dual band imaging
560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging
Imaging data acquisition system	Nikon	NIS Elements - MQS31000	Allows imaging data acquisition
Wavelength control module	Nikon	MQS41220	Module for imaging data acqusiition
Emission splitter hardware module	Nikon	MQS41410	Module for imaging data acqusiition
Imaging data analysis system	NA	Volumetry 8D5, Fiji	Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data