Summary

बड़े पैमाने पर समानांतर एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए वयस्क रीढ़ की हड्डी नाभिक के अलगाव

Published: October 12, 2018
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Summary

यहाँ, हम तेजी से बहाव बड़े पैमाने पर समानांतर आरएनए अनुक्रमण के लिए ताजा या जमे हुए ऊतकों से उच्च गुणवत्ता नाभिक को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । हम डिटर्जेंट-यांत्रिक और hypotonic यांत्रिक ऊतक व्यवधान और कोशिका lysis विकल्प, दोनों जिनमें से नाभिक के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता शामिल हैं ।

Abstract

एक व्यक्ति कोशिका की जीन अभिव्यक्ति की जांच सेल प्रकार और सेल राज्य की पहचान को सक्षम बनाता है । एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र जैसे विषम ऊतकों में, विशेष रूप से कोशिकाओं के transcriptional प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है । हालांकि, पृथक्करण एकल सेल अनुक्रमण के लिए आवश्यक तरीकों जीन अभिव्यक्ति और कोशिका मृत्यु में प्रयोगात्मक परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, इन तरीकों को आम तौर पर ताजा ऊतक के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं, इस प्रकार अभिलेखीय और जैव बैंक सामग्री पर अध्ययन सीमित । एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण (snRNA-Seq) transcriptional अध्ययन के लिए एक आकर्षक विकल्प है, यह देखते हुए कि यह सही सेल प्रकार की पहचान करता है, ऊतक के अध्ययन की अनुमति देता है कि जमे हुए या अलग कर देना करने के लिए मुश्किल है, और पृथक्करण प्रेरित कम कर देता है प्रतिलेखन. यहां, हम बहाव snRNA-Seq के लिए नाभिक के तेजी से अलगाव के लिए एक उच्च प्रवाह प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस विधि ताजा या जमे हुए रीढ़ की हड्डी के नमूनों से नाभिक के अलगाव को सक्षम बनाता है और दो बड़े पैमाने पर समानांतर छोटी बूंद encapsulation प्लेटफार्मों के साथ जोड़ा जा सकता है ।

Introduction

तंत्रिका तंत्र कोशिकाओं के heterogenous समूहों है कि रूपात्मक की एक विविध सरणी, जैव रासायनिक, और electrophysiological गुण प्रदर्शित शामिल है । जबकि बल्क आरएनए अनुक्रमण विभिन्न परिस्थितियों में जीन अभिव्यक्ति में ऊतक चौड़ा परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए उपयोगी हो गया है, यह एकल कोशिका स्तर पर transcriptional परिवर्तन का पता लगाने precludes. एकल सेल transcriptional विश्लेषण में हाल के अग्रिमों कार्यात्मक समूहों में अपने आणविक प्रदर्शनों की जांच के आधार पर heterogenous कोशिकाओं के वर्गीकरण को सक्षम किया है और भी ंयूरॉंस कि हाल ही में सक्रिय किया गया था के सेट का पता लगाने के लिए leveraged किया जा सकता है । 1 , 2 , 3 , 4 पिछले दस वर्षों में, एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण (scRNA-Seq) के विकास ने कोशिका-प्रकार की विविधता में एक दृश्य प्रदान करते हुए, व्यक्तिगत कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन को सक्षम किया है । 5

ऐसे बड़े पैमाने पर समानांतर scRNA-Seq के रूप में स्केलेबल दृष्टिकोण के उद्भव, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के कई क्षेत्रों सहित विषम ऊतकों अनुक्रम के लिए प्लेटफार्मों प्रदान की गई है । 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 हालांकि, एकल सेल पृथक्करण तरीकों कोशिका मृत्यु के साथ ही जीन अभिव्यक्ति में प्रयोगात्मक परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । 16 हाल ही में काम अंतर्जात transcriptional प्रोफाइल के संरक्षण को सक्षम करने के लिए एकल सेल अनुक्रमण तरीकों को अनुकूलित किया है । 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 इन रणनीतियों संवेदी उत्तेजना या व्यवहार के बाद तत्काल जल्दी जीन (IEG) अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है । 3 , 4 भविष्य में, इस रणनीति भी रोग राज्यों में या तनाव के जवाब में ऊतकों में गतिशील परिवर्तन का अध्ययन किया जा सकता है । इन विधियों में से एक नाभिक आरएनए sequencing (snRNA-Seq) तनाव उत्प्रेरण सेल पृथक्करण शामिल नहीं है और अलग कर देना ऊतक (जैसे रीढ़ की हड्डी के रूप में) के लिए मुश्किल पर इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही जमे हुए ऊतक एक आशाजनक दृष्टिकोण है । 4 , 17 , 18 , 19 पिछले नाभिक अलगाव तरीकों से अनुकूलित,20,21,22,23,25 snRNA-Seq आम तौर पर तेजी से ऊतक व्यवधान और सेल का इस्तेमाल lysis ठंड की स्थिति, केंद्रापसारक के तहत, और सेलुलर मलबे से नाभिक की जुदाई । 4 नाभिक कई microfluidic छोटी बूंद encapsulation प्लेटफार्मों पर बहाव अगली पीढ़ी अनुक्रमण के लिए अलग किया जा सकता है । 4 , 7 , 24 , 25 इस विधि समय में एक पल में कोशिकाओं के हजारों की transcriptional गतिविधि का एक स्नैपशॉट के लिए अनुमति देता है ।

अलगाव और अनुक्रमण से पहले कोशिकाओं से नाभिक जारी करने के लिए कई रणनीतियों, अपने स्वयं के फायदे और नुकसान के साथ प्रत्येक रहे हैं । यहां, हम वर्णन और दो प्रोटोकॉल की तुलना करने के लिए बहाव बड़े पैमाने पर समानांतर snRNA-Seq: डिटर्जेंट यांत्रिक lysis और hypotonic-यांत्रिक lysis के लिए वयस्क रीढ़ की हड्डी से नाभिक के अलगाव सक्षम करें । डिटर्जेंट-यांत्रिक lysis पूर्ण ऊतक विघटन और नाभिक के एक उच्च अंतिम उपज प्रदान करता है । Hypotonic यांत्रिक-lysis ऊतक विघटन के एक नियंत्रणीय डिग्री शामिल है, मात्रा और अंतिम परमाणु उपज की शुद्धता के बीच एक संतुलन का चयन करने के लिए एक अवसर प्रदान करते हैं । इन दृष्टिकोणों तुलनीय आरएनए उपज प्रदान करते हैं, नाभिक प्रति जीन की संख्या का पता चला, और सेल-प्रकार रूपरेखा और भी दोनों सफलतापूर्वक snRNA-Seq के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Protocol

सभी पशु काम एक राष्ट्रीय मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक पशु देखभाल और उपयोग समिति के नेशनल इंस्टीट्यूट द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया । पुरुष और महिला ICR/CD-1 वाइल्ड-टाइप चूहों ?…

Representative Results

यहाँ, हम बहाव बड़े पैमाने पर समानांतर आरएनए अनुक्रमण के लिए वयस्क माउस काठ रीढ़ की हड्डी से नाभिक का अलगाव प्रदर्शन किया । प्रोटोकॉल तीन मुख्य घटक शामिल: ऊतक व्यवधान और सेलुलर lysis, homogenization, और स?…

Discussion

इस प्रोटोकॉल का अंतिम लक्ष्य बहाव transcriptional विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए युक्त नाभिक को अलग करने के लिए है । हम snRNA-Seq तरीके अनुकूलित करने के क्रम में रीढ़ की हड्डी में कोशिका प्रकार के सभी प्रोफ़ाइल क?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम NINDS के अंदर प्रोग्राम (1 जिया NS003153 02) और NIDCD (1 जिया DC000059 18) के सहयोग से किया गया । हम अपनी तकनीकी सहायता और सहायक चर्चा के लिए एल ली और C.I. Dobrott धंयवाद, और सी. कठे पांडुलिपि की समीक्षा के लिए ।

Materials

Sucrose Invitrogen 15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0) Gibco 15630-080
CaCl2 Sigma Aldrich C1016-100G
MgAc Sigma Aldrich M1028-10X1ML
0.5 M EDTA (pH = 8.0) Corning MT-46034CI
Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 10197777001 Add DTT just prior to use
Triton-X Sigma Aldrich T8787
Nuclease-free water Crystalgen 221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4) Sigma Aldrich T2194
5 M NaCl Sigma Aldrich 59222C
1 M MgCl2 Sigma Aldrich M1028
Nonidet P40 Sigma Aldrich 74385
Hibernate-A Gibco A12475-01
Glutamax (100X) Gibco 35050-061
B27 (50X) Gibco 17504-044
1X PBS Crystalgen 221-133-10
0.04% BSA New England Biolabs B9000S
0.2 U/μL RNAse Inhibitor Lucigen 30281-1
Oak Ridge Centrifuge Tube Thermo Scientific 3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 ml) Kimble 885303-002
Glass large clearance pestle Kimble 885301-0002
Glass small clearance pestle Kimble 885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer IKA 3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G) IKA 3304000
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
40 μm cell strainer Falcon 352340
MACS SmartStrainers, 30 μm Miltenyi Biotec 130-098-458
Conical tubes Denville Scientific 1000799
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor Thermo Fisher Scientific 75003698
Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml Denville Scientific P7127
Hemocytometer Daigger Scientific EF16034F
Chemgenes Barcoding Beads Chemgenes Macosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) Corning 352235
MoFlo Astrios Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10X Genomics 120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns 10X Genomics 120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns 10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) Corning 353002

References

  1. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
  2. Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
  3. Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
  4. Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
  5. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
  6. Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
  7. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  8. Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
  9. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
  10. Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
  11. Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
  12. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
  13. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
  14. Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
  15. Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
  16. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022 (2016).
  17. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  18. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
  19. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  20. Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  21. Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  22. Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  23. Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
  24. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  25. . Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018)
  26. 10X Genomics. . Single Cell 3′ Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
  27. Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
  28. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
  29. Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
  30. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).

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Matson, K. J., Sathyamurthy, A., Johnson, K. R., Kelly, M. C., Kelley, M. W., Levine, A. J. Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58413, doi:10.3791/58413 (2018).

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