बड़े पैमाने पर समानांतर एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए वयस्क रीढ़ की हड्डी नाभिक के अलगाव
Summary
यहाँ, हम तेजी से बहाव बड़े पैमाने पर समानांतर आरएनए अनुक्रमण के लिए ताजा या जमे हुए ऊतकों से उच्च गुणवत्ता नाभिक को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । हम डिटर्जेंट-यांत्रिक और hypotonic यांत्रिक ऊतक व्यवधान और कोशिका lysis विकल्प, दोनों जिनमें से नाभिक के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता शामिल हैं ।
Abstract
एक व्यक्ति कोशिका की जीन अभिव्यक्ति की जांच सेल प्रकार और सेल राज्य की पहचान को सक्षम बनाता है । एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र जैसे विषम ऊतकों में, विशेष रूप से कोशिकाओं के transcriptional प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है । हालांकि, पृथक्करण एकल सेल अनुक्रमण के लिए आवश्यक तरीकों जीन अभिव्यक्ति और कोशिका मृत्यु में प्रयोगात्मक परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, इन तरीकों को आम तौर पर ताजा ऊतक के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं, इस प्रकार अभिलेखीय और जैव बैंक सामग्री पर अध्ययन सीमित । एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण (snRNA-Seq) transcriptional अध्ययन के लिए एक आकर्षक विकल्प है, यह देखते हुए कि यह सही सेल प्रकार की पहचान करता है, ऊतक के अध्ययन की अनुमति देता है कि जमे हुए या अलग कर देना करने के लिए मुश्किल है, और पृथक्करण प्रेरित कम कर देता है प्रतिलेखन. यहां, हम बहाव snRNA-Seq के लिए नाभिक के तेजी से अलगाव के लिए एक उच्च प्रवाह प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस विधि ताजा या जमे हुए रीढ़ की हड्डी के नमूनों से नाभिक के अलगाव को सक्षम बनाता है और दो बड़े पैमाने पर समानांतर छोटी बूंद encapsulation प्लेटफार्मों के साथ जोड़ा जा सकता है ।
Introduction
तंत्रिका तंत्र कोशिकाओं के heterogenous समूहों है कि रूपात्मक की एक विविध सरणी, जैव रासायनिक, और electrophysiological गुण प्रदर्शित शामिल है । जबकि बल्क आरएनए अनुक्रमण विभिन्न परिस्थितियों में जीन अभिव्यक्ति में ऊतक चौड़ा परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए उपयोगी हो गया है, यह एकल कोशिका स्तर पर transcriptional परिवर्तन का पता लगाने precludes. एकल सेल transcriptional विश्लेषण में हाल के अग्रिमों कार्यात्मक समूहों में अपने आणविक प्रदर्शनों की जांच के आधार पर heterogenous कोशिकाओं के वर्गीकरण को सक्षम किया है और भी ंयूरॉंस कि हाल ही में सक्रिय किया गया था के सेट का पता लगाने के लिए leveraged किया जा सकता है । 1 , 2 , 3 , 4 पिछले दस वर्षों में, एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण (scRNA-Seq) के विकास ने कोशिका-प्रकार की विविधता में एक दृश्य प्रदान करते हुए, व्यक्तिगत कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन को सक्षम किया है । 5
ऐसे बड़े पैमाने पर समानांतर scRNA-Seq के रूप में स्केलेबल दृष्टिकोण के उद्भव, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के कई क्षेत्रों सहित विषम ऊतकों अनुक्रम के लिए प्लेटफार्मों प्रदान की गई है । 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 हालांकि, एकल सेल पृथक्करण तरीकों कोशिका मृत्यु के साथ ही जीन अभिव्यक्ति में प्रयोगात्मक परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । 16 हाल ही में काम अंतर्जात transcriptional प्रोफाइल के संरक्षण को सक्षम करने के लिए एकल सेल अनुक्रमण तरीकों को अनुकूलित किया है । 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 इन रणनीतियों संवेदी उत्तेजना या व्यवहार के बाद तत्काल जल्दी जीन (IEG) अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है । 3 , 4 भविष्य में, इस रणनीति भी रोग राज्यों में या तनाव के जवाब में ऊतकों में गतिशील परिवर्तन का अध्ययन किया जा सकता है । इन विधियों में से एक नाभिक आरएनए sequencing (snRNA-Seq) तनाव उत्प्रेरण सेल पृथक्करण शामिल नहीं है और अलग कर देना ऊतक (जैसे रीढ़ की हड्डी के रूप में) के लिए मुश्किल पर इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही जमे हुए ऊतक एक आशाजनक दृष्टिकोण है । 4 , 17 , 18 , 19 पिछले नाभिक अलगाव तरीकों से अनुकूलित,20,21,22,23,25 snRNA-Seq आम तौर पर तेजी से ऊतक व्यवधान और सेल का इस्तेमाल lysis ठंड की स्थिति, केंद्रापसारक के तहत, और सेलुलर मलबे से नाभिक की जुदाई । 4 नाभिक कई microfluidic छोटी बूंद encapsulation प्लेटफार्मों पर बहाव अगली पीढ़ी अनुक्रमण के लिए अलग किया जा सकता है । 4 , 7 , 24 , 25 इस विधि समय में एक पल में कोशिकाओं के हजारों की transcriptional गतिविधि का एक स्नैपशॉट के लिए अनुमति देता है ।
अलगाव और अनुक्रमण से पहले कोशिकाओं से नाभिक जारी करने के लिए कई रणनीतियों, अपने स्वयं के फायदे और नुकसान के साथ प्रत्येक रहे हैं । यहां, हम वर्णन और दो प्रोटोकॉल की तुलना करने के लिए बहाव बड़े पैमाने पर समानांतर snRNA-Seq: डिटर्जेंट यांत्रिक lysis और hypotonic-यांत्रिक lysis के लिए वयस्क रीढ़ की हड्डी से नाभिक के अलगाव सक्षम करें । डिटर्जेंट-यांत्रिक lysis पूर्ण ऊतक विघटन और नाभिक के एक उच्च अंतिम उपज प्रदान करता है । Hypotonic यांत्रिक-lysis ऊतक विघटन के एक नियंत्रणीय डिग्री शामिल है, मात्रा और अंतिम परमाणु उपज की शुद्धता के बीच एक संतुलन का चयन करने के लिए एक अवसर प्रदान करते हैं । इन दृष्टिकोणों तुलनीय आरएनए उपज प्रदान करते हैं, नाभिक प्रति जीन की संख्या का पता चला, और सेल-प्रकार रूपरेखा और भी दोनों सफलतापूर्वक snRNA-Seq के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का अंतिम लक्ष्य बहाव transcriptional विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए युक्त नाभिक को अलग करने के लिए है । हम snRNA-Seq तरीके अनुकूलित करने के क्रम में रीढ़ की हड्डी में कोशिका प्रकार के सभी प्रोफ़ाइल क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NINDS के अंदर प्रोग्राम (1 जिया NS003153 02) और NIDCD (1 जिया DC000059 18) के सहयोग से किया गया । हम अपनी तकनीकी सहायता और सहायक चर्चा के लिए एल ली और C.I. Dobrott धंयवाद, और सी. कठे पांडुलिपि की समीक्षा के लिए ।
Materials
| Sucrose | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M1028-10X1ML | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Add DTT just prior to use |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504-044 | |
| 1X PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Glass Tissue Dounce (2 ml) | Kimble | 885303-002 | |
| Glass large clearance pestle | Kimble | 885301-0002 | |
| Glass small clearance pestle | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
| Dispersing tool (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Conical tubes | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
| Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Corning | 353002 |
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