Isolement des noyaux d’adultes de la moelle épinière pour séquençage massivement parallèle ARN simple-noyau
Summary
Nous présentons ici un protocole afin d’isoler rapidement les noyaux de la haute qualité des tissus frais ou congelés pour aval séquençage massivement parallèle de RNA. Nous incluons détergent-mécanique et hypotonique-mécanique des tissus désorganisation cellulaire lyse options et, qui peuvent être utilisés pour l’isolement des noyaux.
Abstract
Sondant l’expression des gènes de la cellule individuelle permet l’identification du type de cellule et de l’état de la cellule. Séquençage de RNA unicellulaire a émergé comme un outil puissant pour l’étude des profils de transcriptional des cellules, en particulier dans les tissus hétérogènes tels que le système nerveux central. Cependant, méthodes de dissociation requis pour l’ordonnancement de la cellule unique peuvent conduire à des changements expérimentaux dans la gène expression et la mort cellulaire. En outre, ces méthodes sont généralement limités aux tissus frais, limitant ainsi les études sur les archives et le matériel de bio-Banque. Séquençage seul noyau RNA (snRNA-Seq) est une alternative attrayante pour études transcriptionnels, étant donné qu’il identifie les types de cellules, permet l’étude des tissus congelés ou difficile de dissocier, avec précision et réduit la dissociation induite par le transcription. Nous présentons ici un protocole haut débit pour l’isolement rapide de noyaux pour aval snRNA-suiv. Cette méthode permet l’isolement des noyaux des échantillons frais ou congelés de la moelle épinière et peut être combinée avec deux plates-formes d’encapsulation de gouttelettes massivement parallèle.
Introduction
Le système nerveux est composé de groupes hétérogènes de cellules qui présentent une grande diversité de propriétés morphologiques, biochimiques et électrophysiologiques. Alors que le séquençage de RNA en vrac a été utile pour déterminer les modifications à l’échelle tissulaire dans l’expression de gène dans des conditions différentes, il s’oppose à la détection de changements transcriptionnelles au niveau unicellulaire. Les progrès récents dans l’analyse transcriptionnelle unicellulaires ont permis la classification des cellules hétérogènes en groupes fonctionnels basé sur leur répertoire moléculaire et peuvent même être exploités pour détecter les ensembles de neurones qui avaient été récemment actifs. 1 , 2 , 3 , 4 au cours des dix dernières années, le développement de l’ARN unicellulaire séquençage (scRNA-Seq) a permis l’étude de l’expression des gènes dans des cellules individuelles, offrant ainsi une vue de la diversité type de cellule. 5
L’émergence d’approches évolutives telles que massivement parallèle scRNA-Seq, a fourni des plates-formes de tissus hétérogènes de séquence, dont de nombreuses régions du système nerveux central. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 Toutefois, méthodes de dissociation unicellulaire peuvent conduire à la mort cellulaire, mais aussi les changements expérimentaux dans l’expression des gènes. 16 travaux récents a adapté des méthodes de séquençage unicellulaire pour permettre la préservation des profils de transcriptionnelles endogènes. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 ces stratégies ont été particulièrement adaptés pour la détection de l’expression des gènes (IEG) début immédiat après le stimulus sensoriel ou comportement. 3 , 4 dans le futur, cette stratégie pourrait également servir à étudier les changements dynamiques dans les tissus dans les états pathologiques ou en réponse au stress. De ces méthodes, séquençage seul noyau RNA (snRNA-Seq) est une approche prometteuse qui n’implique pas de stress induisant la dissociation cellulaire et peut être utilisée sur difficile de dissocier les tissus (par exemple, la moelle épinière), mais aussi gelé des tissus. 4 , 17 , 18 , 19 adapté des précédentes méthodes d’isolement de noyaux,20,21,22,23,25 snRNA-Seq utilise généralement cellulaire et interruption rapide des tissus lyse dans des conditions froides, centrifugation et séparation des noyaux de débris cellulaires. 4 noyaux peuvent être isolés pour le séquençage de nouvelle génération en aval sur plusieurs plateformes d’encapsulation de gouttelettes microfluidiques. 4 , 7 , 24 , 25 cette méthode permet une capture instantanée de l’activité transcriptionnelle de milliers de cellules à un moment dans le temps.
Il existe plusieurs stratégies pour libérer les noyaux des cellules avant d’isolement et de séquençage, chacun avec leurs propres avantages et inconvénients. Nous décrivons ici et comparer deux protocoles pour permettre l’isolement des noyaux de la moelle épinière adulte pour la snRNA-Seq massivement parallèle en aval : détergent-mechanical lyse et lyse hypotonique-mécanique. Détergent-mechanical lyse fournit la désorganisation complète de tissus et un meilleur rendement final des noyaux. Mécanique-lyse hypotonique comprend une certaine désorganisation du tissu, offrant la possibilité de sélectionner un équilibre entre la quantité et la pureté de la dernière puissance nucléaire contrôlable. Ces approches fournissent le rendement comparable de RNA, détecté un nombre de gènes par noyau et le profilage de type cellulaire et aussi peuvent être utilisés avec succès pour snRNA-suiv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le but ultime de ce protocole est d’isoler les noyaux contenant ARN de haute qualité pour l’analyse transcriptionnelle en aval. Nous avons adapté le snRNA-Seq méthodes afin de profil de tous les types de cellules dans la moelle épinière. Au départ, nous avons constaté que les méthodes de dissociation cellulaire typique étaient inefficaces de séquençage d’unicellulaire RNA, comme les neurones de la moelle épinière sont particulièrement vulnérables à la mort cellulaire. En outre, méthodes de dissocia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le programme intramural de NINDS (1 ZIA NS003153 02) et NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Nous remercions L. Li et C.I. Dobrott pour leur soutien technique et des discussions utiles et Kathe C. pour l’examen du manuscrit.
Materials
| Sucrose | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M1028-10X1ML | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Add DTT just prior to use |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504-044 | |
| 1X PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Glass Tissue Dounce (2 ml) | Kimble | 885303-002 | |
| Glass large clearance pestle | Kimble | 885301-0002 | |
| Glass small clearance pestle | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
| Dispersing tool (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Conical tubes | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
| Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Corning | 353002 |
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