Her presenterer vi en protokoll for å raskt isolere høykvalitets kjerner fra friske eller frosne vev for nedstrøms massivt parallelle RNA sekvensering. Vi inkluderer vaskemiddel mekaniske og hypotonisk mekaniske vev avbrudd og celle lysis alternativer, begge kan brukes for isolering av kjerner.
Undersøkelser en enkeltcelle genuttrykk aktiverer identifisering av celle type og celle tilstand. Encellede RNA sekvensering har dukket opp som et kraftig verktøy for å studere transcriptional profiler av celler, spesielt i heterogen vev som sentralnervesystemet. Dissosiasjon metoder for enkeltcelle sekvensering kan imidlertid føre til eksperimentelle endringer i gene expression og celle død. Videre er disse metodene vanligvis begrenset til friske vevet, dermed begrense studier på arkivering og bio-bank materiale. Enkelt kjernen RNA sekvensering (snRNA-Seq) er et attraktivt alternativ for transcriptional studier, gitt at det nøyaktig identifiserer celletyper, tillater studiet av vev som frosne eller vanskelig å oppheve tilknytningen, og reduserer dissosiasjon-indusert transkripsjon. Her presenterer vi en høy gjennomstrømming protokoll for rask isolering av kjerner for nedstrøms snRNA-Seq. Denne metoden gjør at isolering av kjerner fra friske eller frosne ryggmargen prøver og kan kombineres med to massivt parallelle slippverktøy innkapsling plattformer.
Nervesystemet består av heterogene grupper av celler som viser et variert utvalg av morfologiske, biokjemiske og elektrofysiologiske. Mens den bulk RNA sekvensering har vært nyttig for å bestemme vev-omfattende endringer i genuttrykk under ulike forhold, utelukker det gjenkjenning av transcriptional endringer på encellede nivå. Nylige fremskritt innen én celle transcriptional analysen har aktivert klassifiseringen av heterogene celler i funksjonelle grupper basert på repertoaret molekylære og kan selv bli leveraged for å oppdage sett med nevroner som hadde vært nylig aktiv. 1 , 2 , 3 , 4 de siste ti årene, utviklingen av enkeltcelle RNA sekvensering (scRNA-Seq) har aktivert studiet av genuttrykk i enkeltceller gir en oversikt over celle-type mangfold. 5
Fremveksten av skalerbare tilnærminger som massivt parallell scRNA-Seq, har gitt plattformer sekvens heterogen vev, inkludert mange områder av det sentrale nervesystemet. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 men enkeltcelle dissosiasjon metoder kan føre til celledød samt eksperimentelle endringer i genuttrykk. 16 nyere arbeid er tilpasset enkeltcelle sekvensering metoder for å aktivere bevaring av endogene transcriptional profiler. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 disse strategiene er spesielt egnet for å avdekke umiddelbar tidlig (IEG) genuttrykk etter sensoriske stimulans eller atferd. 3 , 4 i fremtiden, denne strategien kan også brukes til å studere dynamiske endringer i vev i sykdomstilstander eller som svar på stress. Disse metodene enkelt kjernen RNA sekvensering (snRNA-Seq) er en lovende metode som ikke involverer stress-inducing celle dissosiasjon og kan brukes på vanskelig å distansere vev (som ryggmargen), samt frosne vev. 4 , 17 , 18 , 19 tilpasset fra atomkjerner isolasjon metodene,20,21,22,23,25 snRNA-Seq vanligvis benytter rask vev avbrudd og celle lysis under kalde forhold, sentrifugering og separasjon av kjerner fra mobilnettet rusk. 4 kjerner kan være isolert for den nedstrøms neste generasjons sekvensering på flere microfluidic slippverktøy innkapsling plattformer. 4 , 7 , 24 , 25 denne metoden gir et øyeblikksbilde av transcriptional aktivitet av celler på et tidspunkt.
Det er flere strategier for å slippe kjerner fra celler før isolasjon og sekvensering, hver med sine egne fordeler og ulemper. Her beskriver vi og sammenligne to protokoller for å aktivere isolering av kjerner fra voksen ryggmargen for den nedstrøms massivt parallelle snRNA-Seq: vaskemiddel mekaniske lyse og hypotonisk mekaniske lysis. Vaskemiddel mekaniske lysis gir komplett vev avbrudd og en høyere siste avkastning av kjerner. Hypotonisk mekanisk-lysis inkluderer en kontrollerbar grad av vev avbrudd, gir en mulighet for å velge en balanse mellom antallet og renhet av den endelige kjernefysiske Sprengkraften. Disse gir sammenlignbare RNA avkastning, oppdaget antall gener per kjerne og celle-type profilering og også begge kan brukes med hell for snRNA-Seq.
Det endelige målet med denne protokollen er å isolere kjerner som inneholder høykvalitets RNA for nedstrøms transcriptional analyse. Vi tilpasset snRNA-Seq metoder for å profilere alle celletyper i ryggmargen. Først fant vi at typisk celle dissosiasjon metoder var ineffektivt for enkeltcelle RNA sekvensering, som ryggmargen neurons er spesielt utsatt for celledød. Videre induserer celle dissosiasjon metoder uttrykk for ulike aktivitet – og stressrespons gener av opptil flere hundred-fold. 3…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av intramural programmet av NINDS (1 ZIA NS003153 02) og NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Vi takker L. Li og bakgrunnsstøyreduksjon Dobrott for kundestøtte og nyttig diskusjoner og C. Kathe for gjennomgang manuskriptet.
Sucrose | Invitrogen | 15503-022 | |
1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
MgAc | Sigma Aldrich | M1028-10X1ML | |
0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Add DTT just prior to use |
Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
B27 (50X) | Gibco | 17504-044 | |
1X PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
0.2 U/μL RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
Oak Ridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
Glass Tissue Dounce (2 ml) | Kimble | 885303-002 | |
Glass large clearance pestle | Kimble | 885301-0002 | |
Glass small clearance pestle | Kimble | 885302-002 | |
T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
Dispersing tool (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
MACS SmartStrainers, 30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
Conical tubes | Denville Scientific | 1000799 | |
Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml | Denville Scientific | P7127 | |
Hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) | Corning | 352235 | |
MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Corning | 353002 |