Isolasjon av voksen ryggmargen kjerner for massivt parallelle Single-kjernen RNA sekvensering
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å raskt isolere høykvalitets kjerner fra friske eller frosne vev for nedstrøms massivt parallelle RNA sekvensering. Vi inkluderer vaskemiddel mekaniske og hypotonisk mekaniske vev avbrudd og celle lysis alternativer, begge kan brukes for isolering av kjerner.
Abstract
Undersøkelser en enkeltcelle genuttrykk aktiverer identifisering av celle type og celle tilstand. Encellede RNA sekvensering har dukket opp som et kraftig verktøy for å studere transcriptional profiler av celler, spesielt i heterogen vev som sentralnervesystemet. Dissosiasjon metoder for enkeltcelle sekvensering kan imidlertid føre til eksperimentelle endringer i gene expression og celle død. Videre er disse metodene vanligvis begrenset til friske vevet, dermed begrense studier på arkivering og bio-bank materiale. Enkelt kjernen RNA sekvensering (snRNA-Seq) er et attraktivt alternativ for transcriptional studier, gitt at det nøyaktig identifiserer celletyper, tillater studiet av vev som frosne eller vanskelig å oppheve tilknytningen, og reduserer dissosiasjon-indusert transkripsjon. Her presenterer vi en høy gjennomstrømming protokoll for rask isolering av kjerner for nedstrøms snRNA-Seq. Denne metoden gjør at isolering av kjerner fra friske eller frosne ryggmargen prøver og kan kombineres med to massivt parallelle slippverktøy innkapsling plattformer.
Introduction
Nervesystemet består av heterogene grupper av celler som viser et variert utvalg av morfologiske, biokjemiske og elektrofysiologiske. Mens den bulk RNA sekvensering har vært nyttig for å bestemme vev-omfattende endringer i genuttrykk under ulike forhold, utelukker det gjenkjenning av transcriptional endringer på encellede nivå. Nylige fremskritt innen én celle transcriptional analysen har aktivert klassifiseringen av heterogene celler i funksjonelle grupper basert på repertoaret molekylære og kan selv bli leveraged for å oppdage sett med nevroner som hadde vært nylig aktiv. 1 , 2 , 3 , 4 de siste ti årene, utviklingen av enkeltcelle RNA sekvensering (scRNA-Seq) har aktivert studiet av genuttrykk i enkeltceller gir en oversikt over celle-type mangfold. 5
Fremveksten av skalerbare tilnærminger som massivt parallell scRNA-Seq, har gitt plattformer sekvens heterogen vev, inkludert mange områder av det sentrale nervesystemet. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 men enkeltcelle dissosiasjon metoder kan føre til celledød samt eksperimentelle endringer i genuttrykk. 16 nyere arbeid er tilpasset enkeltcelle sekvensering metoder for å aktivere bevaring av endogene transcriptional profiler. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 disse strategiene er spesielt egnet for å avdekke umiddelbar tidlig (IEG) genuttrykk etter sensoriske stimulans eller atferd. 3 , 4 i fremtiden, denne strategien kan også brukes til å studere dynamiske endringer i vev i sykdomstilstander eller som svar på stress. Disse metodene enkelt kjernen RNA sekvensering (snRNA-Seq) er en lovende metode som ikke involverer stress-inducing celle dissosiasjon og kan brukes på vanskelig å distansere vev (som ryggmargen), samt frosne vev. 4 , 17 , 18 , 19 tilpasset fra atomkjerner isolasjon metodene,20,21,22,23,25 snRNA-Seq vanligvis benytter rask vev avbrudd og celle lysis under kalde forhold, sentrifugering og separasjon av kjerner fra mobilnettet rusk. 4 kjerner kan være isolert for den nedstrøms neste generasjons sekvensering på flere microfluidic slippverktøy innkapsling plattformer. 4 , 7 , 24 , 25 denne metoden gir et øyeblikksbilde av transcriptional aktivitet av celler på et tidspunkt.
Det er flere strategier for å slippe kjerner fra celler før isolasjon og sekvensering, hver med sine egne fordeler og ulemper. Her beskriver vi og sammenligne to protokoller for å aktivere isolering av kjerner fra voksen ryggmargen for den nedstrøms massivt parallelle snRNA-Seq: vaskemiddel mekaniske lyse og hypotonisk mekaniske lysis. Vaskemiddel mekaniske lysis gir komplett vev avbrudd og en høyere siste avkastning av kjerner. Hypotonisk mekanisk-lysis inkluderer en kontrollerbar grad av vev avbrudd, gir en mulighet for å velge en balanse mellom antallet og renhet av den endelige kjernefysiske Sprengkraften. Disse gir sammenlignbare RNA avkastning, oppdaget antall gener per kjerne og celle-type profilering og også begge kan brukes med hell for snRNA-Seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det endelige målet med denne protokollen er å isolere kjerner som inneholder høykvalitets RNA for nedstrøms transcriptional analyse. Vi tilpasset snRNA-Seq metoder for å profilere alle celletyper i ryggmargen. Først fant vi at typisk celle dissosiasjon metoder var ineffektivt for enkeltcelle RNA sekvensering, som ryggmargen neurons er spesielt utsatt for celledød. Videre induserer celle dissosiasjon metoder uttrykk for ulike aktivitet – og stressrespons gener av opptil flere hundred-fold. 3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av intramural programmet av NINDS (1 ZIA NS003153 02) og NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Vi takker L. Li og bakgrunnsstøyreduksjon Dobrott for kundestøtte og nyttig diskusjoner og C. Kathe for gjennomgang manuskriptet.
Materials
| Sucrose | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M1028-10X1ML | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Add DTT just prior to use |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504-044 | |
| 1X PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Glass Tissue Dounce (2 ml) | Kimble | 885303-002 | |
| Glass large clearance pestle | Kimble | 885301-0002 | |
| Glass small clearance pestle | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
| Dispersing tool (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Conical tubes | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
| Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Corning | 353002 |
References
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
- Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
- Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022 (2016).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- . Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018)
- 10X Genomics. . Single Cell 3′ Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
- Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
- Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
