Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için

doi: 10.3791/58413 Published: October 12, 2018

ERRATUM NOTICE

Summary

Burada, hızlı bir şekilde yüksek kaliteli çekirdekleri aşağı akım kitlesel paralel RNA sıralama için taze veya dondurulmuş dokusundan izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut. İkisi de çekirdek yalıtımı için kullanılan deterjan-mekanik ve mekanik hipotonik doku bozulma ve hücre lizis seçenekleri, içerir.

Abstract

Tek bir hücre'nın gen ekspresyonu sondalama hücre tipi ve hücre devlet sağlar. Tek hücreli RNA sıralama transkripsiyon profilleri hücrelerinin, merkezi sinir sistemi gibi heterojen dokuları özellikle eğitim için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Ancak, tek hücre sıralama için gereken ayrılma yöntemleri gen ifade ve hücre ölümünde deneysel değişikliklere yol açabilir. Ayrıca, bu yöntemler genellikle böylece arşivleme üzerine çalışmalar ve biyo-banka malzeme sınırlama taze doku için kısıtlanır. Tek çekirdek RNA sıralama (snRNA-Seq) transkripsiyon çalışmaları, verilen bu doğru hücre tipleri tanımlar, donmuş ya da ayırmak zor doku çalışma ruhsatı için çekici bir alternatifi ve ayrılma kaynaklı azaltır Transkripsiyon. Burada, yüksek üretilen iş iletişim kuralı çekirdeği aşağı akım snRNA-devamı için hızlı yalıtım için mevcut Bu yöntem çekirdeği taze veya dondurulmuş omurilik örneklerinden yalıtım sağlar ve iki kitlesel paralel damlacık kapsülleme platformları ile kombine edilebilir.

Introduction

Sinir sistemi hànzú morfolojik, biyokimyasal ve elektrofizyolojik özellikleri çeşitli bir dizi görüntüleyen hücreler kümesinden oluşur. Süre toplu RNA sıralama gen ekspresyonu farklı koşullar altında doku genelindeki değişiklikleri belirlemek için yararlı olmuştur, transkripsiyon değişiklikleri tek hücre düzeyinde algılanması engellemektedir. Tek hücreli transkripsiyon analiz son gelişmeler hànzú hücreleri sınıflandırması moleküler kendi repertuar göre fonksiyonel gruplara etkinleştirdiyseniz ve hatta son zamanlarda aktif nöron kümeleri bulmak için kullanılacak olabilir. 1 , 2 , 3 , 4 son on yıl içinde gen ifadesinde bir görünüme hücre tipi çeşitlilik sağlayan tek tek hücreler, çalışma tek hücre RNA (scRNA-Seq) sıralama gelişimini sağlamıştır. 5

Gibi kitlesel paralel scRNA-Seq, ölçeklenebilir yaklaşımlar ortaya çıkması sıra heterojen dokulara, merkezi sinir sistemine sahip pek çok bölge de dahil olmak üzere platformlar sağlamıştır. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 ancak, tek hücre ayrılma yöntemleri gen ifadesinde deneysel değişikliklerin yanı sıra hücre ölümüne yol açabilir. 16 tek hücre sıralama yöntemleri endojen transkripsiyon profilleri korunması etkinleştirmek için son çalışmasını benimsemiştir. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 bu stratejileri hemen erken gen (IEG) ifade duyusal uyarıcı veya davranış aşağıdaki algılamak için özellikle uygun olmuştur. 3 , 4 gelecekte, bu strateji de dokularda hastalık durumlarında veya strese yanıt dinamik değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Bu yöntemleri, tek çekirdek RNA sıralama (snRNA-Seq) hücre ayrılma stres-inducing içermeyen ve zor doku (örneğin, spinal kord) ayırmak için yanı sıra dondurulmuş kullanılabilir bir umut verici yaklaşımdır doku. 4 , 17 , 18 , 19 uyarlama önceki çekirdek izolasyon yöntemleri,20,21,22,23,25 snRNA-Seq genellikle hızlı doku bozulması ve hücre kullanır lizis soğuk koşulları, Santrifüjü ve ayrılık çekirdeği, hücresel enkaz altında. 4 çekirdek çoklu mikrosıvısal damlacık kapsülleme platformlarda aşağı akım nesil sıralama için ayrılmış olabilir. 4 , 7 , 24 , 25 bu yöntem bir anda zaman içinde binlerce hücre transkripsiyon etkinliği bir anlık görüntü için izin verir.

Çekirdeklerin hücrelerden yalıtım ve sıralama, her biri kendi avantajları ve dezavantajları önce serbest bırakmak için birden çok strateji vardır. Burada, biz tanımlamak ve aşağı akım kitlesel paralel snRNA Seq için yetişkin omurilik üzerinden çekirdek yalıtım etkinleştirmek için iki protokol karşılaştırın: deterjan-mekanik lizis ve mekanik hipotonik lizis. Deterjan-mekanik lizis tam doku bozulması ve çekirdekleri daha yüksek bir son verim sağlar. Hipotonik mekanik-lysis doku bozulması, miktar ve saflık son nükleer verim arasında bir denge seçmek için bir fırsat sağlayan kontrol edilebilir bir ölçüde içerir. Bu yaklaşımlar karşılaştırılabilir RNA verim, çekirdek ve hücre tipi profil başına genlerin algılanan numaraları sağlar ve aynı zamanda her ikisi de başarılı bir şekilde snRNA-devamı için kullanılabilir

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış bir protokol uyarınca gerçekleştirilmiş tüm hayvan işleri. Erkek ve dişi ICR/CD-1 yaban-farelerde tip, 8 arasında örnekleri dengeli ve 12 hafta yaşlı, tüm deneyler için kullanılmıştır. Fareler yerel kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi kılavuzlarınıza uygun olarak ele alınmalıdır.

1. malzeme ve arabellekleri hazırlanması

  1. Tüm arabellekleri kullanımı gün hazırlamak ve önceden buza chill (bkz. Tablo 1).
    1. Deterjan-mekanik lizis kullanıyorsanız, deterjan lizis arabellek (> 500 μL örnek başına), düşük sükroz arabellek (> 6 mL örnek başına), sukroz yoğunluğu arabellek (> 12,5 mL örnek başına) ve resuspension çözüm (> 1 mL) hazırlayın.
    2. Hipotonik-mekanik lizis kullanıyorsanız, hazırlamak hipotonik lizis tampon (> 5 mL örnek başına), HEB Orta (> 5 mL örnek başına), düşük sükroz arabellek (> 3 mL örnek başına), sukroz yoğunluğu arabellek (> örnek başına 12.5 mL) ve resuspension çözüm (> 1 mL).
    3. Dithiothreitol (DTT) 25 μL düşük sükroz arabelleği 25 mL ve DTT başka bir 25 μL 25 mL sukroz yoğunluk gradient arabelleği için protokol başlatmadan önce ekleyin.
  2. Örnek kağıt havlu veya tek hücre çekirdeği yakalamak için kullanılan mikrosıvısal kanalları tıkayabilir tezgah koruyucular lifleri ile kirlenme en aza indirmek için alüminyum folyo ile parçalanmış yüzeyi kapsamaktadır.
  3. Parçalanmış araçlar ve tezgah alanı RNase dekontaminasyon çözümünü ile sprey. Ayrıca, (deterjan-mekanik hücre lizis kullanıyorsanız) Dounce homogenizer tüp ve Oak Ridge tüp içine RNase dekontaminasyon çözümünü ile sprey. Dounce ve Oak Ridge tüp ultrasaf, RNase free su ile durulayın.
  4. Önceden tüm koleksiyon tüpler (50 mL konik, Oak Ridge) ve buz üzerine Dounce homogenizer boruları, sakin ol.
  5. Yangın Lehçe Pasteur pipetler bir dizi (hipotonik-mekanik hücre lizis kullanıyorsanız).

2. omurilik hazırlanması

  1. Taze doku kullanıyorsanız, fare CO2 inhalasyon tarafından ötenazi. Ötenazi, sprey fare kat saç kirlenme örnek en aza indirmek için % 70 etanol ile.
  2. Fare ile keskin, RNase free cerrahi makas başını kesmek. Sonra yavaşça karın kaldırma forseps ile deri ve iç organlar ortaya çıkarmak için vücut uzunluğu boyunca bir kesi yapmak.
  3. Fare forseps kullanarak vücut boşluğu üzerinden iç organları çekerek içini. Alanı temizlemek için veya bu kirletici tanıştırabilir miyim gibi organları kaldırmak için kağıt havlu kullanmayın. Makas kullanılarak, vertebral sütunun L2 ve L3 omurilik omurga arasında kesme.
    Not: uygulama ile bu adımı 30 saniyeden az bir sürede elde edilebilir.
    1. Spinal kord dışarı atmak için 25 G ¼ inch iğne ile buz gibi PBS içeren bir 3 mL şırınga uygun. İğne ucu sakral vertebral sütunun sonuna yerleştirin. İğne ucu etrafında sıkı bir mühür oluşturmak ve aşağı pistonu üzerinde spinal kord rostrally çıkarmak için basın için omurga çimdik için iki parmağınızı kullanın. Spinal kord buz gibi PBS ile petri kabına yerleştirin.
    2. Bu noktada, doku dondurma ve-80 ° C'de depolayın veya hemen deterjan-mekanik (adım 3) veya hipotonik-mekanik (adım 4) lizis için kullanın.
  4. Donmuş doku, kullanarak korumak, doku Kuru buz üzerinde deterjan-mekanik (adım 3) veya hipotonik-mekanik (adım 4) lizis için devam edin.

3. deterjan-mekanik hücre lizis

  1. Lomber spinal kord bir önceden soğutulmuş Dounce homogenizer yerleştirin ve 500 mL deterjan lizis arabellek önceden soğutulmuş ekleyin.
    Not: Bir fare lomber spinal kord 325.5 mg ± 63.9 mg standart değerlerin ortalamasının hatadır (SEM, N = 4). 50 mg-1.5 g doku başarıyla kullanılabilir.
  2. Havan tokmağı ('gevşek' havaneli) 5 vuruş sonra 5-10 vuruş havaneli B ('sıkı' havaneli) ile Dounce. Homogenizer lizis çözüm vuruşları arasında dışarı kaldırma önlemek ve kabarcıklar tanıtan kaçının.
  3. Bir 40 mm süzgeç önceden soğutulmuş 50 mL konik tüp ve prewet ile 1 mL düşük sükroz arabelleği yerleştirin.
  4. Ham çekirdeklerin lizis arabellek içeren Dounce homogenizer için düşük sükroz arabellek 1 mL ekleyin ve karışımı yavaşça 2-3 kez pipetting.
  5. Ham çekirdeği hazırlık 40 mm süzgeç üzerinde önceden soğutulmuş 50 mL konik tüp içine geçmek.
  6. Bir ek 1 mL düşük sükroz arabellek son hacim 3 mL düşük sükroz arabellek ve 500 mL lizis arabelleği getiren 40 mm süzgeç üzerinden geçmek.
  7. Birden çok kordonlar, aynı konik tüp havuzu birleştirme adımları 3.1 – 3,6 yineleyin.
  8. 3200 x g 4 ° C'de 10 dakika için de örnek santrifüj kapasitesi Santrifüjü tamamlandıktan sonra süpernatant dikkatle boşaltmak. Adım 5'e geçin.

4. hipotonik-mekanik hücre lizis

  1. Lomber spinal kord 5 mL de bir doku kültürü yemek hipotonik lizis arabellekte yerleştirin. Bahar makas künt sonu omurilik bisect, sonra 3-4 mm parçalar halinde göbek bağını kes için bahar makas kullanın kullanın, ancak değil kıyma.
    Not: 50 mg-1.5 g doku başarıyla kullanılabilir.
  2. 2-3 kez dönen 15dk için buz üzerinde kuluçkaya.
  3. Hipotonik lizis arabellek sulandırmak için HEB orta 5 mL ekleyin.
  4. 5 mL serolojik pipet ile 10 kat veya tüm doku adet pipet açıklıktan ahenkli kadar doku triturate.
  5. Triturate bir dizi üç yangın cilalı Pasteur pipetler giderek daha dar fan çapı (~ 900-600 mm).
    1. Her pipet triturate 5 - 15 kat, doku yerleşmek, 1-2 mL Disosiye çekirdek içeren süpernatant kaldırmak ve bir 40 mm süzgeç üzerinde önceden soğutulmuş 50 mL konik tüp içine geçmek izin.
    2. En küçük ölçekli Pasteur pipet ile toz sonra emin olun homogenate sorunsuz pipet ucu akar. Kalan çözüm üzerinde 40 mm süzgeç 50 mL konik tüp içine geçmek.
      Not: Triturations toplam sayısı ayarlanabilir istediğiniz gibi. Fare spinal kord meninkslerde kalır, ancak spinal kord görünür herhangi bir boyutta triturate önemlidir. Kalan homogenate 40 m süzgeç geçmek. Kabarcıklar sırasında toz tanıtan kaçının.
  6. Filtre uygulanmış örneği ' 1000 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Santrifüjü tamamlandıktan sonra dikkatle boşaltmak ve süpernatant atın. Adım 5'e geçin.

5. homojenizasyon ve sukroz yoğunluk Gradient

  1. Adım 3 veya 4 sonra 3 mL düşük sükroz arabellek kullanarak Pelet resuspend. Yavaşça resuspension kolaylaştırmak için duvardan Pelet kaldırmak için girdap. Buz 2 min için oturmak ve süspansiyon bir Oak Ridge tüp transfer örnek ver.
  2. Homogenizer, kullanarak 1 olarak ayarlayarak, homojenize çekirdekleri düşük sükroz arabelleği 15 – 30 s, örnek buz üzerinde tutmak için.
    Not: Eğer bir lomber spinal kord veya 30 kullanarak kullanım 15 s kullanıyorsanız s havuza alınmış örnekleri ya da bütün bir omurilik.
  3. Serolojik pipet, katman yoğunluğu sükroz arabelleği yoğunluğu katmanları bozan bir kabarcık yaratmak değil dikkat çekici düşük sükroz arabellek homogenate altında 12,5 mL kullanarak.
  4. 3200 x g 4 ° C'de 20 dk için de tüpler santrifüj kapasitesi
  5. Santrifüjü tamamlandıktan sonra hemen süpernatant flicking bir hareketle dikkatle boşaltmak.
    Not: Sükroz arabellek kalan hacmi (daha az 400 mL) düşük ses ve son örnek temiz üretmek için isterseniz atılır, ama artık bu birimi çekirdek içerir ve çekirdekleri verimi en üst düzeye çıkarmak için korunmuş.
  6. 100 mL - 1 mL resuspension çözeltisi kullanarak, duvardaki kalan çekirdeği resuspend. 'Deterjan tabanlı hazırlıkla kalır miyelin kaşlarını' kaçının.
  7. Çekirdeklerin 30-35 mm gözenek boyutu süzgeç aracılığıyla filtre ve önceden soğutulmuş bir tüp içinde toplamak.
  8. Çekirdek çekirdek 10 X amaç altında saymak için bir hemasitometre kullanma verim belirlemek.
    Not: Trypan mavi mavi görünmesi gereken çekirdek görselleştirmek için eklenebilir. Hücresel enkaz miktarını Not.
  9. Adım 6 veya 7 için devam edin.

6. ağır snRNA-sıralama paralel: Akademik Platform7

  1. Kitlesel paralel snRNA sıralama (Örneğin, damla-Seq) gerçekleştirin yöntemi daha önce açıklandığı gibi7 aşağıdaki değişiklikler ile:4
    1. Çekirdeklerin mL başına 225 çekirdeği son bir konsantrasyon için ayarlayın.
    2. Barkodlu boncuk mL başına 250 boncuk bir konsantrasyon, hazır olun.
    3. % 0.7 sarkosyl lizis önbellekle hazırlayın.
    4. Akış oranları min boncuk, min için çekirdek başına 35 mL ve petrol için min başına 200 mL başına 35 mL için ayarlayın.

7. kitlesel paralel snRNA-sıralama: ticari Platform26

  1. Kitlesel paralel snRNA-sıralama (Örneğin, krom tek hücre gen ifade çözümü) ticari platformu kullanarak gerçekleştirmek aşağıdaki değişiklik ile üreticinin yönergeleri26 uygun ürünler:
    1. Ters-transkripsiyon ek PCR çevriminin hücrelere kıyasla çekirdekleri dan azalmış cDNA telafi etmek için hedeflenen hücre kurtarma temel cDNA amplifikasyon devredir hesaplanan sayısını ekleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada, çekirdeği olan yetişkin fare lomber spinal kord aşağı akım kitlesel paralel RNA sıralama için üzerinden gerçekleştirilen. Protokol üç ana bileşenini dahil: doku bozulması ve hücresel lizis, homojenizasyon ve sukroz yoğunluğu Santrifüjü (Şekil 1). Saniye içinde çok sayıda çekirdeği hem de hücresel ve doku artıkları (Şekil 2ATablo 2) ham çekirdeği hazırlıkla deterjan-mekanik lizis vermiştir. On beş dakika sonra hipotonik-mekanik lizis vardı daha az enkaz ama aynı zamanda daha az çekirdek (Şekil 2BTablo 2) bir ham çekirdeği hazırlık vermiştir. Homojenizasyon her iki hazırlıklar yapıldı (Şekil 2C ve D) ve sukroz yoğunluk gradient Santrifüjü PBS %0,04 BSA ile resuspension önce (Şekil 2E ve F). Ortalama bir fare lomber spinal kord (325.5 mg ± 63.9 mg standart hata ortalamaya, SEM, N = 4) 5.1 x 105 çekirdeği vermiştir (± 6,3 x 104 SEM, N = 3) deterjan-mekanik lizis ve 105 çekirdeği (± 5.9 x 104 x 2.0 aşağıdaki SEM, N = 3) hipotonik-mekanik lizis takip. Lomber spinal kord çekirdek sayısı Dounce homojenizasyon deterjan-mekanik lizis protokolündeki sonra ilk ham hazırlık üzerinden tahmin edilmiştir (2.6 x 106 çekirdek ± 4.0 x 105 SEM, N = 3, Tablo 2). Deterjan-mekanik lizis Protokolü son örnekten ilk çekirdeği, % 20 oluşur (± % 2 SEM, N = 3, Tablo 2). Ham çekirdeği hazırlık toz takip hipotonik-mekanik lizis üzerinden %62 ilk çekirdeği içerir (± % 2 SEM, N = 3, Tablo 2). Son hipotonik-mekanik lizis örnek ilk çekirdeği sadece % 8'i içerir (± % 1 SEM, N = 3, Tablo 2). Biz iki hazırlama yöntemleri arasında toplam RNA verim ya da bir temizlik gen (Gapdh) cDNA ödemesini herhangi bir farklılık tespit etmedi. QPCR kullanarak, deterjan yöntemi vermiştir 463.7 ng (± 98,9 SEM, N = 6) Toplam RNA ve bir ortalama algılama eşik döngüsünü 25,2 (± 1.3 SEM) Gapdh cDNA için qPCR ve hipotonik yöntemi tarafından vermiştir 419.2 ng (± 85.3 SEM, N = 6) Toplam RNA ve bir ortalama algılama eşiği 26,1 döngüsü Gapdh cDNA (± 0,8 SEM) için. İki lizis seçenekler ayırmak zor dokulara gelen çekirdeklerin yalıtmak ve aşağı akım tek-çekirdek RNA sıralama yüksek kaliteli malzeme sağlamak.

Mikrosıvısal kanalları boyutunu aşağı akım kitlesel paralel tek çekirdek sıralama platformlar için göz önüne alındığında, bir çekirdek süspansiyon büyük parçacıkları veya tıkanma hücresel enkaz ücretsiz giriş için önemlidir. Burada sunulan protokolü, Macosko ve ark. adapte platformda tıkanma hiç örneği vardı 2015 (N = 17) ve ticari platform üzerinde bir kısmi takunya (N = 16).

Deterjan-mekanik ve mekanik hipotonik yordamlar çekirdek iki kitlesel paralel damlacık kapsülleme platformlar için başarılı bir şekilde ayırmak için kullanılan ve temsilcisi sonuçları Şekil 3' te gösterilmektedir. Bu yaklaşımların her ikisi de çekirdek binlerce ve yetişkin fare lomber spinal kord (Şekil 3) hücre tiplerinin sınıflandırılması transkripsiyon profil oluşturma etkin. 4 her hücre türü için çekirdek başına benzer genlerin bu yaklaşımlar sonucunda (Şekil 3 c ve D). İki platform arasında giriş çekirdek kurtarma oranları farklı. Sathyamurthy ve ark. bazı değişiklikleri ile Macosko ve ark. 2015 adapte platformu 2018 kurtarılan çekirdeği yaklaşık %0.59 (± % 0.05 SEM, N = 17), ticari platform bir tahmini %53,7 çekirdeği kurtarılan iken (N = 2).

Bu iletişim kuralı biraz son hazırlık nöronal hücre çekirdeği için zenginleştirir. Lomber spinal kord doku bölümlerde, biz çekirdek % 27'si için nöronal işaretleyici NeuN olumlu bulundu (N = 2 hayvanlardan 7,368 çekirdeği), lomber spinal kord hazırlanması deterjan-mekanik çekirdeği %31.9 toplam çekirdek NeuN, ifade sonuçlandı floresans aktif hücre sıralama tarafından belirlenen (FACS, ± % 2,0 SEM, N = 13 bağımsız çekirdek hazırlıkları her hazırlık olarak, Şekil 4birden fazla hayvanlardan havuza alınmış numuneleri kullanılarak). Bu ne daha önce NeuN pozitif çekirdek tüm spinal kord (20 %24 yaş bağlı olarak), yüzde için daha fazla beyaz madde ve oligodendrocytes boyun ve göğüs bölgeler de dahil olmak üzere27 görülmüştür için benzer. Notun, NeuN/Rbfox3 tüm nöronlarda ifade değil ve buna göre bu numaralar büyük olasılıkla mütevazı hafife da. Daha küçük sigara nöronal hücre biraz sükroz degrade arıtma sırasında tükenmiş olan mümkündür. Nöronlar çekirdek başına daha fazla genlere sahip olduğundan Ayrıca, sıralama takip aşağı akım filtreleme ve analiz parametrelerini son hücre türü dağıtım değişiklik (Şekil 3 c ve D) ve bu nedenle, kaldırılacak daha az olasıdır filtre uygulama işlemi sırasında.

Bakım gerektiren bu protokolündeki birkaç önemli adımlar vardır. İlk, aşırı douncing veya toz (3 veya 4, sırasıyla adımları) hücresel artıkları ve parçacık oluşumu bir artışa yol açabilir. Küçük parçacıklar hücresel lizis sırasında oluşturulan bir kez filtrasyon ve sukroz yoğunluğu Santrifüjü büyük parçacıkları, ayırabilirsiniz, kaldırılması zor olmakla birlikte. İkinci olarak, homojenizasyon sırasında homogenizer doğrudan Oak Ridge tüp alt üzerine yerleştirmeyin. Bunun yerine, homogenizer sonuna resuspended çekirdeği, tüp alt dokunmadan içeren düşük sükroz çözüm içine daldırın. Homojenizasyon nükleer yalıtım hücresel enkaz kaldırma ve kümeleri ve multiplets (Şekil 5) azaltarak artırır. Sükroz yoğunluğu Santrifüjü hemen santrifüj Oak Ridge tüpü çıkarması ve hızlı bir şekilde hızlı bir 'flicking' hareketle süpernatant dikkatle boşaltmak için önemlidir. Oak Ridge tüp duvarından çekirdeği resuspending zaman, 'tuzlu' Pelet miyelin bant ile tüp alt üzerinden resuspend. Pelet görünür olmayabilir unutmayın. Çekirdeklerin tüp daha yüksek resuspending miyelin kirlenme çekirdeği hazırlık neden olabilir. Hücresel lizis ve sukroz yoğunluğu Santrifüjü adımları mikrosıvısal kanallar için aşağı akım uygulama yapışmasına neden parçacık azaltılması için kritik önem taşımaktadır.

Malzemenin adı / ekipman Hisse senedi toplama Son konsantrasyonu Birim / miktarı
Deterjan lizis arabellek
Düşük sükroz arabellek - - 600 μL
Triton-X % 20 %0.10 3 μL
Hipotonik lizis arabellek
Tris-HCl (pH 7.4 =) 1 M 10 mM 100 μL
NaCl 5 M 10 mM 20 μL
MgCl2 1 M 3 mM 30 μL
Nonidet P40 - %0.01 1 μL
Nükleaz ücretsiz su 10 mL
HEB orta
Hazırda bekletme-A - - 10 mL
Glutamax - - 100 μL
B27 - - 200 μL
Düşük sükroz arabellek
Sükroz - 0.32 M 2.75 g
HEPES (pH = 8.0) 1 M 10 mM 250 μL
CaCl2 1 M 5 mM 125 μL
MgAc 1 M 3 mM 75 μL
EDTA 0,5 M 0,1 mM 5 μL
DTT 1 M 1 mM 25 μL
Nükleaz ücretsiz su ilâ 25 mL
Sükroz yoğunluğu arabellek
Sükroz - 1 M 8.6 g
HEPES (pH = 8.0) 1 M 10 mM 250 μL
MgAc 1 M 3 mM 75 μL
DTT 1 M 1 mM 25 μL
Nükleaz ücretsiz su ilâ 25 mL
Resuspension çözüm
1 X PBS - - 1 mL
BSA 20 mg/mL 0.4 mg/mL 20 μL
RNAse inhibitörü 40 U/μL 0,2 U/μL 5 μL

Tablo 1: Tablo çözümleri.

Ham Homojenize Son
Deterjan-mekanik 100 ± %15 87 ± %9 % 20 ± 2
Hipotonik-mekanik 62 ± % 12 35 ± %4 % 8 ± 1

Tablo 2: çekirdek protokol her adımda verimini. Çekirdeği dounce homojenizasyon deterjan-mekanik lizis protokolündeki sonra ilk ham hazırlık sayıda çekirdeği lomber spinal kord sayısını tahmin etmek için kullanıldı. İlk çekirdeği verim (2.6 x 106 çekirdek ± 4.0 x 105 SEM, N = 3) çekirdeklerin verim her iki deterjan ve hipotonik-mekanik lizis protokolleri için aşağı akım her adımda hesaplamak için kullanıldı. Hipotonik-mekanik hazırlık tarafından izole çekirdeklerin sayısı tahmini ilk çekirdeği için normalleştirilmiş. Tablo değerler ortalama ± SEM, N = 3.

Figure 1
Şekil 1: nükleer tecrit şematik. Yetişkin omurilik üzerinden çekirdek deterjan-mekanik veya hipotonik-mekanik hücre lizis, ardından homojenizasyon ve sukroz yoğunluk gradient Santrifüjü kullanarak ayrılmış olabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Temsilcisi aydınlık alan ve DAPI lekeli çekirdek anahtar adımlar iletişim kuralında.  (A, B) ham çekirdeği deterjan-mekanik veya hipotonik-mekanik lizis takip. (C, D) Homojenizasyon takip çekirdeği. (E, F) Çekirdeklerin PBS sükroz yoğunluğu aralıklarla takip %0,04 BSA ile resuspended. Çekirdek %2 paraformaldehyde ile tespit edildi ve daha sonra Trypan mavi veya DAPI kullanarak lekeli. Görüntüleri 10 X alınmıştır (ölçek çubuğu = 100 µm) aydınlık alan ve epi-floresan kullanarak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: sıralı çekirdeği temsilcisi tSNE Arsa: deterjan-mekanik ve mekanik hipotonik lizis kullanarak. (A)sonuç üzerinde 17.000 çekirdeği disseke yetişkin fare lomber spinal kord deterjan-mekanik lizis takip ve Macosko ve ark. 2015 değişiklikler ile Sathyamurthy ve ark. üzerinden göre sıralama elde 2018. bu rakam Sathyamurthy vd izniyle değiştirildi 2018.4 (B) sonuçlar elde sıralama 5000 çekirdeği çkarlyor yetişkin lomber spinal hipotonik-mekanik lizis ve ticari mikrosıvısal tek hücre kapsülleme platformu aşağıdaki kablosu üzerinden. 26  (C, D) ortalama genler başına yetişkin fare omurilik ± SEM büyük hücre tiplerinin kümeleme aşağıdaki çekirdek sonuçları Not, Macosko ve arktarafından takip deterjan-mekanik lizis yordamı. 2015 platformu disseke lomber spinal kord kullanarak gerçekleştirilen, ticari platformu tarafından takip hipotonik-mekanik lizis gerçekleştirildi iken kullanarak lomber spinal kord (Bu protokol için açıklandığı gibi) atılır. Verilen bu kabloyu çıkarma dura ve dorsal kök gangliyon kaldırır, meninjeal/Schwann hücresi küme yoktur Şekil 3B üzerinden ve D. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: deterjan-mekanik lizis takip NeuN+ çekirdeği FACS arsa. Sabit çekirdek gösterilen FACS Arsa lekeli NeuN için (ortalama %31.9 toplam çekirdek ± %2.0 SEM, N = 13), izole deterjan-mekanik lizis iletişim kuralını kullanarak. Hemen fiksasyon, çekirdeği FACS doğrulama için için bir ham çekirdeği hazırlık dounce homojenizasyon spinal % 1 ile hemen fiksasyon ardından deterjan-mekanik hazırlık kullanarak iplerden tarafından elde edildi PFA 5 dk kuluçka dönemi ile. Fiksasyon 250 mM glisin ile söndürülür ve çekirdekleri toplanmıştır. Anti-NeuN antikor ile boyama çözümde gerçekleştirildi. FACS, sabit bir hücre sıralayıcısı kullanarak lekeli NeuN çekirdeği üzerinde gerçekleştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: çekirdeklerin hazırlık olmadan homojenizasyon. Çekirdeklerin sükroz yoğunluğu Santrifüjü A deterjan-mekanik takip veya B hipotonik-mekanik lizis, homojenizasyon olmadan önce resuspended. * Çekirdek (A) ve hücresel enkaz (B)bağlı çekirdeği multiplet bağlı hücresel enkaz gösterir. Çekirdeklerin PBS sükroz yoğunluğu aralıklarla takip %0,04 BSA ile resuspended. Çekirdek %2 paraformaldehyde ile tespit edildi ve daha sonra Trypan mavi veya DAPI kullanarak lekeli. Görüntüleri aydınlık alan ve epi-floresan kullanarak 10 X at (ölçek çubuğu 100 µm) alındı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu iletişim kuralı, nihai hedefi aşağı akım transkripsiyon analiz için yüksek kaliteli RNA içeren çekirdeklerin izole etmektir. SnRNA-Seq yöntemleri tüm hücre tiplerinin spinal kord profil için uyarlanmış. Başlangıçta, biz omurilik sinir hücreleri hücre ölümü için özellikle savunmasız olduğu gibi tipik hücre ayrılma yöntemleri tek hücre RNA sıralama için etkisiz bulundu. Ayrıca, hücre ayrılma yöntemleri hundred-fold kadar birçok çeşitli etkinlik ve stres tepkisi genler tarafından ifade ikna etmek. 3 , 4 , 16 tek hücre hazırlıkları ile ilişkili dezavantajlar göz önüne alındığında, biz ve diğerleri çekirdeği alternatif olarak kullandım. 16 , 17 , 18 , 24 bu yöntem de donmuş omurilik doku dahil olmak üzere insan dokusu üzerinde kullanılabilir. 4 , 19 , 24 burada, biz güçlü ve sınırlamalar bu yaklaşımın anlatacağız.

Bu yöntemin güçlü deneysel olarak indüklenen bacakları kaçınma yanı sıra taze ve donmuş doku kullanma yeteneğini içerir. 4 böylece, bu yaklaşım endojen bacakları bir davranış veya uyarıcı aşağıdaki problama için yararlı olabilir. 1 , 3 , Bu özel cihazlar çekirdeği kitlesel paralel tek çekirdek sıralama için kullanımı için gerekli değildir ancak Macosko vd. tarafından 2015, küçük ayarlamalar ile geliştirilen platform kullanabilirsiniz 4 bu yöntem faydalarından biri olduğunu lizis tampon ve akış oranı veya ticari olarak mevcut sistemleri kullanmak. Ayrıca, tek çekirdek sıralama hücre tipleri, bu yaklaşım gücü için borç verme tanımlanması için benzer bir yöntem olan tek hücre sıralama için olduğu kanıtlanmıştır. 28 , 29 ancak, bu yaklaşımın bazı önemli sınırlamaları vardır. Çekirdek hücresel mRNA yaklaşık % 20-50 içerir,29 ve bu yansıtılır transkript tek hücre sıralama için karşılaştırıldığında çekirdek başına daha düşük bir dizi. 18 , 29 snRNA-Seq intronic okur da dahil olmak üzere tespit edilen genlerin sayısını artırmak için bir yaklaşımdır.

Çekirdeklerin dokusundan izolasyonu sağlayan çeşitli kullanılabilir protokoller vardır. 2 , 16 , 17 , 18 , 24 , 30 miyelin kaldırma, ultrasantrifüj, ya da birçok Santrifüjü adımları veya çekirdek son sayıda alt yol açabilir yıkar çoğu diğer yöntemleri ile karşılaştırıldığında, burada sunulan iletişim kuralları gerektirmez. Ayrıca, bu iletişim kuralını (hipotonik tamamlamak için mekanik) 45 dk (deterjan-mekanik) ya da bir saat alır. Mikrosıvısal platformlarda desteklenen ticari protokolleri iki katından fazla sırada ve çekirdekleri kaybetme riski artan pek çok daha fazla Santrifüjü işlem gerektirmez. Sadece lizis ve filtre uygulama içeren çekirdeklerin yalıtım iletişim kuralları aksine, burada sunulan yöntemleri son çekirdek saflığı artırmak için sükroz degrade içerir. Yetişkin omurilik doku nedeniyle beyaz madde ve elde edilen miyelin enkaz büyük bölümü için bu adım gereklidir.

Deterjan-mekanik lizis Protokolü tam doku ayrılma ve lizis için kullanılabilir ve mekanik hipotonik lizis Protokolü doku ayrılma ve hücresel enkaz mansap uygulamaya izin miktarını denetlemek için kullanılabilir. Bu protokoller çekirdeği yalıtım etkinlik bağımlı transkripsiyon değişimler incelenmesi ve biyo-banka malzeme, doku ayırmak zor için aşağı akım kitlesel paralel snRNA devamı için kullanılabilir Kitlesel paralel tek çekirdek RNA sıralama yanı sıra, bu iletişim kuralı çekirdeği ayirt ve FACS ve DNA metilasyonu çalışmalar ve ChIP-Seq (Şekil 4 gibi epigenetik analiz dahil olmak üzere alternatif uygulamaların yalıtmak için kullanılabilir ). 23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Bu eser NINDS Intramural programı tarafından desteklenmiştir (1 ZIA NS003153 02) ve NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Biz L. Li ve onların teknik destek ve yararlı tartışmalar için CI Dobrott ve C. Kathe el yazması gözden geçirme için teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Invitrogen 15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0) Gibco 15630-080
CaCl2 Sigma Aldrich C1016-100G
MgAc Sigma Aldrich M5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0) Corning MT-46034CI
Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 10197777001 Add DTT just prior to use
Triton-X Sigma Aldrich T8787
Nuclease-free water Crystalgen 221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4) Sigma Aldrich T2194
5 M NaCl Sigma Aldrich 59222C
1 M MgCl2 Sigma Aldrich M1028
Nonidet P40 Sigma Aldrich 74385
Hibernate-A Gibco A12475-01
Glutamax (100x) Gibco 35050-061
B27 (50x) Gibco 17504-044
1x PBS Crystalgen 221-133-10
0.04% BSA New England Biolabs B9000S
0.2 U/μL RNAse Inhibitor Lucigen 30281-1
Oak Ridge Centrifuge Tube Thermo Scientific 3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL) Kimble 885303-002
Glass large clearance pestle Kimble 885301-0002
Glass small clearance pestle Kimble 885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer IKA 3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G) IKA 3304000
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
40 μm cell strainer Falcon 352340
MACS SmartStrainers, 30 μm Miltenyi Biotec 130-098-458
Conical tubes Denville Scientific 1000799
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor Thermo Fisher Scientific 75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL Denville Scientific P7127
Hemocytometer Daigger Scientific EF16034F
Chemgenes Barcoding Beads Chemgenes Macosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) Corning 352235
MoFlo Astrios Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10X Genomics 120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns 10X Genomics 120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns 10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm) Corning 353002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21, (1), 120-129 (2018).
  2. Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68, (5), 1006-1015 (2017).
  3. Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96, (2), 313-329 (2017).
  4. Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22, (8), 2216-2225 (2018).
  5. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6, (5), 377-382 (2009).
  6. Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20, (3), 484-496 (2017).
  7. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, (5), 1202-1214 (2015).
  8. Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18, (13), 3227-3241 (2017).
  9. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343, (6172), 776-779 (2014).
  10. Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26, (8), 967 (2016).
  11. Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17, (3), 360-372 (2015).
  12. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, (2), 335-346 (2016).
  13. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18, (1), 145-153 (2015).
  14. Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356, (6335), (2017).
  15. Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, (6226), 1138-1142 (2015).
  16. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022 (2016).
  17. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352, (6293), 1586-1590 (2016).
  18. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (49), 19802-19807 (2013).
  19. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11, (3), 499-524 (2016).
  20. Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  21. Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  22. Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  23. Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19, (1), 102-110 (2016).
  24. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14, (10), 955-958 (2017).
  25. 10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018).
  26. 10X Genomics. Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. (2018).
  27. Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218, (5), 1337-1354 (2013).
  28. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7, (1), 6031 (2017).
  29. Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. (2018).
  30. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353, (6302), 925-928 (2016).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.

Step 3.1 was updated from:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.

to:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.

Step 3.6 was updated from:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.

to:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.

Step 5.5 was updated from:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

to:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

Step 5.6 was updated from:

Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

to:

Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.

to:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A., Johnson, K. R., Kelly, M. C., Kelley, M. W., Levine, A. J. Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58413, doi:10.3791/58413 (2018).More

Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A., Johnson, K. R., Kelly, M. C., Kelley, M. W., Levine, A. J. Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58413, doi:10.3791/58413 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter