Summary
Vi beskriver metoder til fluorescerende mærkning af tangentielt migrere celler af elektroporation og for time-lapse billeddannelse af mærket celle bevægelse i en flad-mount kultur for at visualisere migrere celle adfærd i den udviklende chick optiske tectum .
Abstract
Time-lapse imaging er en kraftfuld metode til at analysere overflytter celle adfærd. Efter fluorescerende celler mærkning, kan flytning af mærket cellerne i kulturen registreres under video mikroskopi. Til at analysere celle migration i udviklingslandene hjernen, er Skive kultur almindeligt anvendt til at observere celle migration parallel til afsnittet skive som radial celle migration. Dog kan begrænset information fås fra Skive kultur metode til at analysere celle migration vinkelret på afsnittet skive, som tangerer celle migration. Vi præsenterer her, protokoller for time-lapse imaging for at visualisere tangential celle migration i den udviklende chick optiske tectum. En kombination af celle mærkning af elektroporation i ovo og en efterfølgende fladskærms-mount kultur på celle kultur Indsæt giver mulighed for påvisning af overflytter celle bevægelse i det vandrette plan. Derudover letter vores metode påvisning af både individuelle celle opførsel og den kollektive kampskridt af en gruppe celler på lang sigt. Denne metode kan potentielt anvendes til at opdage den sekventielle ændring af fluorescerende-mærket mikro-struktur, herunder den cytoskeletale brudforlængelse i den neurale væv eller celler forskydning i den ikke-neurale væv.
Introduction
Studiet af celle migration skrider frem med de fremrykkende teknik live Imaging. Efter fluorescerende celler mærkning, kan den temporale bevægelse af mærket celler i en kultur fad eller i vivo registreres under video mikroskopi. I studiet af neurale udvikling, har de morfologiske ændringer af migrere celler eller forlængede axoner analyseret ved hjælp af time-lapse billeddannelse. For effektiv imaging er det vigtigt at anvende en passende metode til fluorescerende celle mærkning og væv forberedelse, baseret på formålet med eksperiment og analyse. Til at analysere celle migration i udviklingslandene hjernen, været skive kultur almindeligt anvendt til at observere celle migration parallel til afsnittet skive som radial celle migration1,2,3. Skive kultur-systemet bruges også til påvisning af tangential celle migration4,5, men det er ikke egnet til retningsbestemt analyse i tilfælde hvor cellerne spredes vinkelret til afsnittet skive.
Den optiske tectum er sammensat af et flerlaget struktur, dannet af radiale og tangerer celle migration under fosterudviklingen. Tectal lag dannelse afhænger primært af radial migration af postmitotic neuronal forløber celler fra den ventrikulære zone, og deres endelige bestemmelsessted i lagene korrelerer med deres fødselsdato i ventrikulær zone6. Hvad angår tangential migration rapporteret vi tidligere to strømme af vandringer i de mellemste og overfladiske lag i et udviklende chick optiske tectum. I de midterste lag under E6-E8 overflytte de bipolare celler med en længe førende proces og en tynd afsluttende proces dorsalt eller ventrally langs axon fasciculus af tectal efferente axoner, der kører dorso-ventrally7. Efter denne axophilic migration differentiere cellerne i multipolær neuroner beliggende i de dybe lag. I de overfladiske lag under E7-E14 spredes de overfører celler horisontalt ved at reformere en forgrenet førende proces og scatter i flere retninger8. Efter sprede migration, differentiere til sidst de sidstnævnte celler i overfladiske neuroner i forskellige morfologier. I begge tilfælde er en flad-mount kultur effektiv til at observere celle bevægelse parallelt med pial overfladen.
Vi præsenterer her, en protokol for time-lapse imaging for at visualisere tangential celle migration i udviklingslandene chick optiske tectum7,8. Kombinationen af celle mærkning af elektroporation i ovo, og en efterfølgende fladskærms-mount kultur på celle kultur Indsæt muliggør påvisning af overflytter celle bevægelighed og migration retning. Målet med denne metode er at lette afsløringen af både individuelle celle opførsel på lang sigt og den kollektive indsats af en gruppe af celler i det vandrette plan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Elektroporation i Ovo
- Forberede udtryk plasmid DNA fluorescerende mærkning i høj koncentration. Isolere DNA fra 200 mL bakteriekulturen af alkalisk lysis metode ved hjælp af anion-exchange kolonner efter producentens protokol (Tabel af materialer). Mix pCAGGS-EGFP og pCAGGS-mCherryNuc i en endelig koncentration på 4 µg/µL hver.
Bemærk: Endotoxin-fri plasmid DNA oprensning kan være at foretrække for elektroporation. - Inkuber frugtbare hønseæg vandret ved 38 ° C i 70% relativ luftfugtighed.
- Efter 2,5 dage, fjerne 5 mL af æggehvidestof (æggehvide) fra den spidse side af ægget ved hjælp af 20 mL sprøjte med en 18 gauge kanyle og forsegle nålen hullet med tape.
- Skære toppen af æg shell med buet saks til at åbne et hul 2 cm i diameter og kontrollere udviklingsstadiet af embryo under stereomikroskopet (fase 17 af Hamburger og Hamilton9). Forsegle hullet igen med tape.
Bemærk: Dette trin kan udføres på ethvert tidspunkt under E2.5-E3.0. Trin 1.3 og 1.4 lavere niveau af embryo i æg for at undgå en stram udlæg i den voksende embryo og blodkarrene til top shell. - Fortsætte inkubation indtil E5.5.
- Før elektroporation, forberede 10 µL af den nævnte plasmid DNA farvet med 0,5 µL af hurtigt grøn (25 mg/mL), 10 mL af autoklaveres phosphat bufferet saltvand (PBS) indeholdende (100 enheder/mL) penicillin og streptomycin (100 μg/mL) og Mikropipetter fremstillet af glas kapillarrør ved hjælp af en mikropipette processor. Skær den distale spidsen af mikropipette til at foretage en passende størrelse af pore afhængigt af mængden af DNA til injektion.
- Skær den forseglede top shell med en saks til at genåbne en hul 2,5 cm i diameter og sætte æg stabilt under stereo-mikroskop. Tilsæt et par dråber af PBS ind i ægget. Skrælle allantois membranen dækker embryonet uden blødning ved hjælp af to fine pincet. Fjerne dyr fra lederen af embryoet.
- Mens vende hovedet med en microspatula, injicere 0,1-1 μL af farvede DNA i den ventrikulære hulrum af den venstre optiske tectum ved hjælp af en mikropipette tilsluttet en slamsuger tube.
Bemærk: DNA indsprøjtet mængde afhænger af formålet med forsøget. Koncentreret DNA løsning bør synke og vedhæfte langs den ventrikulære væg. - Placer et par af forcep-type elektroder (3 mm kvadratiske elektroder med 7 mm afstand), så målområde for den optiske tectumis placeret i mellem (figur 1trin 1).
Bemærk: DNA er electroporated til anoden side. - Opkræve en før pulsen på 30 V, 1 ms med et interval på 5 ms og fire efterfølgende pulser af 6 V, 5 ms med en 10 ms interval ved hjælp af pulse generator.
Bemærk: Den elektroniske tilstand afhænger af størrelse og afstand til elektroderne. Det bør være stærk nok til at opnå effektiv Transfektion, men det skal være beskedne nok til at sikre den normale udvikling af målvæv. - Forsegle hullet med tape og fortsætte inkubation. Sættetid elektroderne i PBS fjerne æggehvidestof med en interdentalbørsten i en plastik skål. Gentag 1,7-1.11 for hvert æg.
2. fast-Mount kultur på celle Indsæt
- Én dag før den flade-mount kultur, forberede belagt celle kultur Indsæt. Float nogle cellekultur indsætter på de autoklaveres destilleret vand i et 10-cm celle kultur parabol. Indlæse en løsning af 8 µg/mL laminin og 80 µg/mL poly-L-lysin til at dække indsætter og lade de flød skær i celle kultur CO2 inkubator ved 37 ° C natten over.
Bemærk: Den følgende dag, de belagte skær kan opbevares ved 4 ° C. - På dagen af kultur på E7.0, fjerne laminin-poly-L-lysin løsning fra indsatsen og placere indsatsen i et glas bund fad (figur 1trin 2) fyldt med 1,1 mL af næringssubstratet (60% nedsat serum medium, 20% F12, 10% føtal bovint serum, 10 % kylling serum, 50 enheder/mL penicillin, 50 μg/mL streptomycin). Holde fadet i celle kultur CO2 inkubator ved 37 ° C.
Bemærk: Medium kan bruges i hele perioden kultur for tre dage uden ændringer. - Forberede opsætningen kultur. Indstil et fugtkammer enhed på en inverteret Konfokal mikroskop med en gasflow af 40% O2 og 5% CO2 (gas controller) ved 38 ° C (temperatur controller).
- Skær hovedet af fosteret med saks. Knivspids hovedet ud med pincet i den iskolde Hanks' afbalanceret saltopløsning (HBSS) i en 6-cm celle kultur parabol.
- Isolere electroporated optiske tectum ved hjælp af to fine pincet. Overføre tectum med en plastik dropper i en anden skål fyldt med iskolde HBSS. Bruge concaved glasfad baseret med sort silicium som en tallerken til at skære.
- Kontrollere placeringen af mærkning under fluorescens stereoskopisk mikroskop. Skåret ud i tectal vævet omkring området mærkning med en microsurgical kniv. Sørg for retningen af væv i tectum (anterior-posterior, dorsal-ventral).
- Overføre den mærket væv med en plastik dropper til skæret, så pia side er knyttet til indsatsen. Lægge det tectal væv i den ønskede retning og fjerne overskydende HBSS (figur 1trin 2).
- Gentag 2.4-2,7 for at forberede andre væv på samme sæt. Placer fadet i den prewarmed afdeling i den omvendte Konfokal mikroskop (figur 1trin 3).
3. time-Lapse Imaging
- Kontrollere de fluorescerende mærkning og fokusere mikroskopifeltets i den omvendte Konfokal mikroskop. Start laser Konfokal enheder og prøv prøveudtagning Konfokal scanningen for at justere retningen og placeringen af væv langs X- og y-aksen i feltet. Bruge 10 X eller 20 X mål linse uden nedsænkning olie.
- Vælg den scanning størrelse (fx 512 x 512 dpi). Beslutte interval og samlede vifte af Konfokal scanningen langs z-aksen. Tage en 5 eller 10 µm interval for rækken 100 µm. Bestemme intervallet af Konfokal imaging og samlede imaging varighed (fx 10 min mellemrum over 48 h).
Bemærk: For at undgå laser fototoksicitet, forbyde scanning i høj scanning størrelse med korte z-intervaller for z-langtrækkende eller med korte tidsintervaller i løbet af den lange imaging varighed. For eksempel, når du anvender en høj scanning størrelse (f.eks. 1024 x 1024 dpi), reducere antallet af scanninger langs z-aksen. - Indstil parametrene for den Konfokal kører program beskrevet i 3.2 og starte imaging.
- Efter imaging, kombinere de Konfokal billeder på forskellige z-akse til at give z-stak billeder med fokale finjustering for hvert tidspunkt.
- Føj z-stak billeder for forskellige tidspunkt og konstruere en time-lapse film i AVI-format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser den visualiseret overfladiske tangential migration i en flad-mount kultur på en forløbet tid (0, 9, 18, 27 h) efter starten af optagelsen. Film 1 er en time-lapse film af 10 min-mellemrum over en periode på 28 timer og 50 min. Rammen er valgt for at fokusere på de overflytte celler fra mærket nederste venstre hjørne af rammen til den umærkede plads (figur 3A). Massebevægelse af overflytter celler (normal god landbrugspraksis, øverste venstre panel, film 1) og deres kerner (mCherry-Nuc; øverste højre panel) kan observeres med de flettede film (nederste panel, film 1). Retningslinier for den celle migration kan undersøges ved at fokusere på de sprede celler fra mærket center til alle retninger (film 2, figur 3B).
De klare billeder af den nukleare bevægelse (Movie 2; mCherry-Nuc, højre panel) gør det muligt for os at spore celle nukleare migration af automatisk sporing ved hjælp af en partikel Tracker plugin10 af en Fiji billedbehandling ansøgning af ImageJ11 (Movie 3, figur 3B). Tidsmæssige ændringer af baner af tangential migration kan visualiseres for at bevise de sprede migration i omni-retninger.
Enkelte celle adfærd med den sekventielle morfologisk ændring af førende processen, afsluttende proces og kerner kan blive manifesteret med højere forstørrelse billeder af 5 min.-intervaller (Movie 4, figur 3 c).
En anden type af tangential migration i den midterste lag7 kan visualiseres ved hjælp af en lignende protokol (Movie 5, figur 3D). Tovejs lineær migration langs axon fasciculus kører dorsal til ventral (top til ned) er tydeligt7.
Figur 1. Protokollen flow chart. Trin 1: elektroporation i ovo. Trin 2: Æglæggende tectal væv så at pia side er knyttet til indsatsen. Trin 3: Inverted fluorescerende mikroskop med laser Konfokal enhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Visualisering af overfladiske tangential migration i flade-mount kultur. Tangentielt overflytter cellerne (normal god landbrugspraksis; øverste panel) og kerne (mCherry-Nuc; nederste panel) i de overfladiske lag af det optiske tectum er vist på 0, 9, 18, 27 h efter indtræden af kultur fra E7.0. Cellerne i det nederste venstre hjørne af rammen er mærket på 0 h (Se figur 3A). Skalalinjen: 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Skematiske figur illustrerer mount betingelserne for time-lapse imaging. Form af fluorescerende mærkning (grøn), oprindelige retning celle migration (magenta), og video frame (sorte firkant) var illustreret med forstørrelse på objektive linse (obj) og digital zoom (zoom) i det øverste felt, med dag af elektroporation (EP ) og udbrud af kultur (kultur) i feltet nederst. (A) Movie 1, (B) Movie 2 og 3, (C) Movie 4, (D) Movie 5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1. Visualisering af overfladiske tangential migration i en flad-mount kultur. Flytning af de tangentielt overflytter celler (normal god landbrugspraksis, øverste venstre panel) og deres kerner (mCherry-Nuc; øverste højre panel) i de overfladiske lag af det optiske tectum efter indtræden af kultur fra E7.0. Det flettede billede er vist i nederste panel. Cellerne i det nederste venstre hjørne af rammen er mærket på 0 h (Se figur 3A), og de time-lapse billeder blev fanget over 28 h og 50 min. skalalinjen: 100 µm. venligst klik her for at se denne video. Højreklik for at downloade.
Movie 2. Sprede bevægelighed tangentielt overflytter cellerne (normal god landbrugspraksis, venstre panel) og deres kerner (mCherry-Nuc; højre panel) fra midten af begge paneler er vist over 48 h (Se figur 3B). Skalalinjen: 100 µm. venligst klik her for at se denne video. Højreklik for at downloade.
Film 3. Baner af tangential migration. Forskydning af cellekernen (det højre panel i Movie 2) blev sporet til at visualisere baner af tangential migration. Skalalinjen; 100 µm. venligst klik her for at se denne video. Højreklik for at downloade.
Movie 4. Enkelte celle adfærd i højere forstørrelse. Bevægelse af de enkelte celler (normal god landbrugspraksis, venstre panel) og deres kerner (mCherry-Nuc; højre panel) er vist i højere forstørrelse over 24 timer (Se figur 3 c). Forgrening proces af den førende proces kan genkendes. Skalalinjen: 100 µm. venligst klik her for at se denne video. Højreklik for at downloade.
Film 5. Midterste lag migration. Bevægelse af de tangentielt overflytter celler (normal god landbrugspraksis, venstre panel) og deres kerne (mCherry-Nuc; højre panel) i tectal midterste lag er vist over 24 timer efter debut af kultur fra E6.0 (Se figur 3D). Lineær migration langs dorso-ventrale akse (top til ned) er bemærkelsesværdige. Skalalinjen: 100 µm. venligst klik her for at se denne video. Højreklik for at downloade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokol, der er beskrevet ovenfor er optimeret til påvisning af celle migration i overfladiske lag6,8. Det kan anvendes til påvisning af midterste lag migration vandløb (Movie 5)6,7, bare ved at flytte timingen af elektroporation (E5.5 til E4.5) og udbrud af kultur og imaging (E7.0 til E6.0).
Den præsenterede procedure er sammensat af celle mærkning af elektroporation i ovo, flad-mount kultur og time-lapse Konfokal imaging (figur 1). Først og fremmest er det en forudsætning, at dyrkningsbetingelserne skal optimeres for at bevare vævet sundt og voksende normalt som in vivo. Det er også afgørende at sikre, at orientering af væv er egnet til påvisning af celle migration. Til sådanne formål anvender vi en flad-mount kultur på celle Indsæt, som letter observation af vandret celle dispersion og leverer rig medium med høj iltkoncentration. Efter at have sikret kultur tilstand og orientering, er kritisk for visualisering til at justere de modstridende forhold bedre fluorescerende mærkning med den mindste elektroniske og foto skader. For bedre mærkning, kan vi vælge en udtryk vektor med en effektiv promotor og electroporate koncentreret DNA. For at opnå mindst skade, er det vigtigt at moderere elektroporation elektriske tilstand, sænke DNA-koncentrationen og minimere den samlede tid af laser bestråling.
En fordel ved denne protokol bruger flade-mount kultur på celle Indsæt er, at vi kan observere tangential celle migration på lang sigt. Generelt, er det vanskeligt at bestemme, hvor længe væv i kultur fastholder de fysiologiske tilstande i forhold til i ovo. I det mindste, overfladiske tangential migration fortsætter over 72 h efter indtræden af kultur på E7.0, som viser normal cellulære dispersion svarende til at i ovo8. Derudover er frisk væv parat i starten af kultur og billeddannelse til at observere migration i senere faser. Det er også fordelagtigt at celle fortrængning kan følges over en længere periode, fordi cellerne forbliver bevægelige vandret i overfladiske flade plader af tectum, som er tæt på objektive linse. Ved hjælp af en Konfokal system letter også sporing celle bevægelse langs z-aksen. På den anden side er en ulempe ved denne metode, at flat-mount kultur ikke altid er relevante at sammenfatte andre typer af indvandring såsom radial migration. Når metoden anvendes til at observere radial migration i den tectal skive på skæret, øge tykkelsen af det tectal væv ikke så hurtigt som at i ovo. Metoden skive kultur i kollagen gele kan være bedre at sammenfatte disse lag udvikling.
Da vores metode giver mulighed for observation af vandret bevægelse parallelt med kultur-Indsæt, det potentielt kan anvendes til påvisning af sekventielle ændringer af de fluorescerende-mærket mikro-struktur, herunder den cytoskeletale brudforlængelse i det neurale væv eller celle forskydning i den ikke-neurale væv. For eksempel, efter mærkning commissural axoner i udviklingslandene neuralrøret af elektroporation, kan bevægelser af præ- og post krydse axoner over bundpladen visualiseres i den åbne bog kultur incising topplade. Forudsat at passende kultur betingelse på celle Indsæt foreligger gengivelse i vivo betingelser, giver vores metode en effektiv teknik til at visualisere horisontale bevægelser af forskellige celletyper og strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af JSP'ER KAKENHI Grant nummer 15K 06740 til Y.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R.
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
