Visualisering af Tangential celle Migration i den udviklende Chick optiske Tectum
Summary
Vi beskriver metoder til fluorescerende mærkning af tangentielt migrere celler af elektroporation og for time-lapse billeddannelse af mærket celle bevægelse i en flad-mount kultur for at visualisere migrere celle adfærd i den udviklende chick optiske tectum .
Abstract
Time-lapse imaging er en kraftfuld metode til at analysere overflytter celle adfærd. Efter fluorescerende celler mærkning, kan flytning af mærket cellerne i kulturen registreres under video mikroskopi. Til at analysere celle migration i udviklingslandene hjernen, er Skive kultur almindeligt anvendt til at observere celle migration parallel til afsnittet skive som radial celle migration. Dog kan begrænset information fås fra Skive kultur metode til at analysere celle migration vinkelret på afsnittet skive, som tangerer celle migration. Vi præsenterer her, protokoller for time-lapse imaging for at visualisere tangential celle migration i den udviklende chick optiske tectum. En kombination af celle mærkning af elektroporation i ovo og en efterfølgende fladskærms-mount kultur på celle kultur Indsæt giver mulighed for påvisning af overflytter celle bevægelse i det vandrette plan. Derudover letter vores metode påvisning af både individuelle celle opførsel og den kollektive kampskridt af en gruppe celler på lang sigt. Denne metode kan potentielt anvendes til at opdage den sekventielle ændring af fluorescerende-mærket mikro-struktur, herunder den cytoskeletale brudforlængelse i den neurale væv eller celler forskydning i den ikke-neurale væv.
Introduction
Studiet af celle migration skrider frem med de fremrykkende teknik live Imaging. Efter fluorescerende celler mærkning, kan den temporale bevægelse af mærket celler i en kultur fad eller i vivo registreres under video mikroskopi. I studiet af neurale udvikling, har de morfologiske ændringer af migrere celler eller forlængede axoner analyseret ved hjælp af time-lapse billeddannelse. For effektiv imaging er det vigtigt at anvende en passende metode til fluorescerende celle mærkning og væv forberedelse, baseret på formålet med eksperiment og analyse. Til at analysere celle migration i udviklingslandene hjernen, været skive kultur almindeligt anvendt til at observere celle migration parallel til afsnittet skive som radial celle migration1,2,3. Skive kultur-systemet bruges også til påvisning af tangential celle migration4,5, men det er ikke egnet til retningsbestemt analyse i tilfælde hvor cellerne spredes vinkelret til afsnittet skive.
Den optiske tectum er sammensat af et flerlaget struktur, dannet af radiale og tangerer celle migration under fosterudviklingen. Tectal lag dannelse afhænger primært af radial migration af postmitotic neuronal forløber celler fra den ventrikulære zone, og deres endelige bestemmelsessted i lagene korrelerer med deres fødselsdato i ventrikulær zone6. Hvad angår tangential migration rapporteret vi tidligere to strømme af vandringer i de mellemste og overfladiske lag i et udviklende chick optiske tectum. I de midterste lag under E6-E8 overflytte de bipolare celler med en længe førende proces og en tynd afsluttende proces dorsalt eller ventrally langs axon fasciculus af tectal efferente axoner, der kører dorso-ventrally7. Efter denne axophilic migration differentiere cellerne i multipolær neuroner beliggende i de dybe lag. I de overfladiske lag under E7-E14 spredes de overfører celler horisontalt ved at reformere en forgrenet førende proces og scatter i flere retninger8. Efter sprede migration, differentiere til sidst de sidstnævnte celler i overfladiske neuroner i forskellige morfologier. I begge tilfælde er en flad-mount kultur effektiv til at observere celle bevægelse parallelt med pial overfladen.
Vi præsenterer her, en protokol for time-lapse imaging for at visualisere tangential celle migration i udviklingslandene chick optiske tectum7,8. Kombinationen af celle mærkning af elektroporation i ovo, og en efterfølgende fladskærms-mount kultur på celle kultur Indsæt muliggør påvisning af overflytter celle bevægelighed og migration retning. Målet med denne metode er at lette afsløringen af både individuelle celle opførsel på lang sigt og den kollektive indsats af en gruppe af celler i det vandrette plan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den protokol, der er beskrevet ovenfor er optimeret til påvisning af celle migration i overfladiske lag6,8. Det kan anvendes til påvisning af midterste lag migration vandløb (Movie 5)6,7, bare ved at flytte timingen af elektroporation (E5.5 til E4.5) og udbrud af kultur og imaging (E7.0 til E6.0).
Den præsenterede procedure er sammensat af…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af JSP’ER KAKENHI Grant nummer 15K 06740 til Y.W.
Materials
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
