Summary

Visualisering af Tangential celle Migration i den udviklende Chick optiske Tectum

Published: October 24, 2018
doi:

Summary

Vi beskriver metoder til fluorescerende mærkning af tangentielt migrere celler af elektroporation og for time-lapse billeddannelse af mærket celle bevægelse i en flad-mount kultur for at visualisere migrere celle adfærd i den udviklende chick optiske tectum .

Abstract

Time-lapse imaging er en kraftfuld metode til at analysere overflytter celle adfærd. Efter fluorescerende celler mærkning, kan flytning af mærket cellerne i kulturen registreres under video mikroskopi. Til at analysere celle migration i udviklingslandene hjernen, er Skive kultur almindeligt anvendt til at observere celle migration parallel til afsnittet skive som radial celle migration. Dog kan begrænset information fås fra Skive kultur metode til at analysere celle migration vinkelret på afsnittet skive, som tangerer celle migration. Vi præsenterer her, protokoller for time-lapse imaging for at visualisere tangential celle migration i den udviklende chick optiske tectum. En kombination af celle mærkning af elektroporation i ovo og en efterfølgende fladskærms-mount kultur på celle kultur Indsæt giver mulighed for påvisning af overflytter celle bevægelse i det vandrette plan. Derudover letter vores metode påvisning af både individuelle celle opførsel og den kollektive kampskridt af en gruppe celler på lang sigt. Denne metode kan potentielt anvendes til at opdage den sekventielle ændring af fluorescerende-mærket mikro-struktur, herunder den cytoskeletale brudforlængelse i den neurale væv eller celler forskydning i den ikke-neurale væv.

Introduction

Studiet af celle migration skrider frem med de fremrykkende teknik live Imaging. Efter fluorescerende celler mærkning, kan den temporale bevægelse af mærket celler i en kultur fad eller i vivo registreres under video mikroskopi. I studiet af neurale udvikling, har de morfologiske ændringer af migrere celler eller forlængede axoner analyseret ved hjælp af time-lapse billeddannelse. For effektiv imaging er det vigtigt at anvende en passende metode til fluorescerende celle mærkning og væv forberedelse, baseret på formålet med eksperiment og analyse. Til at analysere celle migration i udviklingslandene hjernen, været skive kultur almindeligt anvendt til at observere celle migration parallel til afsnittet skive som radial celle migration1,2,3. Skive kultur-systemet bruges også til påvisning af tangential celle migration4,5, men det er ikke egnet til retningsbestemt analyse i tilfælde hvor cellerne spredes vinkelret til afsnittet skive.

Den optiske tectum er sammensat af et flerlaget struktur, dannet af radiale og tangerer celle migration under fosterudviklingen. Tectal lag dannelse afhænger primært af radial migration af postmitotic neuronal forløber celler fra den ventrikulære zone, og deres endelige bestemmelsessted i lagene korrelerer med deres fødselsdato i ventrikulær zone6. Hvad angår tangential migration rapporteret vi tidligere to strømme af vandringer i de mellemste og overfladiske lag i et udviklende chick optiske tectum. I de midterste lag under E6-E8 overflytte de bipolare celler med en længe førende proces og en tynd afsluttende proces dorsalt eller ventrally langs axon fasciculus af tectal efferente axoner, der kører dorso-ventrally7. Efter denne axophilic migration differentiere cellerne i multipolær neuroner beliggende i de dybe lag. I de overfladiske lag under E7-E14 spredes de overfører celler horisontalt ved at reformere en forgrenet førende proces og scatter i flere retninger8. Efter sprede migration, differentiere til sidst de sidstnævnte celler i overfladiske neuroner i forskellige morfologier. I begge tilfælde er en flad-mount kultur effektiv til at observere celle bevægelse parallelt med pial overfladen.

Vi præsenterer her, en protokol for time-lapse imaging for at visualisere tangential celle migration i udviklingslandene chick optiske tectum7,8. Kombinationen af celle mærkning af elektroporation i ovo, og en efterfølgende fladskærms-mount kultur på celle kultur Indsæt muliggør påvisning af overflytter celle bevægelighed og migration retning. Målet med denne metode er at lette afsløringen af både individuelle celle opførsel på lang sigt og den kollektive indsats af en gruppe af celler i det vandrette plan.

Protocol

1. Elektroporation i Ovo Forberede udtryk plasmid DNA fluorescerende mærkning i høj koncentration. Isolere DNA fra 200 mL bakteriekulturen af alkalisk lysis metode ved hjælp af anion-exchange kolonner efter producentens protokol (Tabel af materialer). Mix pCAGGS-EGFP og pCAGGS-mCherryNuc i en endelig koncentration på 4 µg/µL hver.Bemærk: Endotoxin-fri plasmid DNA oprensning kan være at foretrække for elektroporation. Inkuber frugtbare hønseæg vandret ved 38 ° …

Representative Results

Figur 2 viser den visualiseret overfladiske tangential migration i en flad-mount kultur på en forløbet tid (0, 9, 18, 27 h) efter starten af optagelsen. Film 1 er en time-lapse film af 10 min-mellemrum over en periode på 28 timer og 50 min. Rammen er valgt for at fokusere på de overflytte celler fra mærket nederste venstre hjørne af rammen til den umærkede plads (figur 3A). Massebevægelse…

Discussion

Den protokol, der er beskrevet ovenfor er optimeret til påvisning af celle migration i overfladiske lag6,8. Det kan anvendes til påvisning af midterste lag migration vandløb (Movie 5)6,7, bare ved at flytte timingen af elektroporation (E5.5 til E4.5) og udbrud af kultur og imaging (E7.0 til E6.0).

Den præsenterede procedure er sammensat af…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af JSP’ER KAKENHI Grant nummer 15K 06740 til Y.W.

Materials

Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF MACHEREY-NAGEL 740422.5 endotoxin-free plasmid DNA purification kit
20 ml syringe TERUMO SS-20ESZ
18 gauge needle TERUMO NN-1838R
Fast Green Wako 061-00031
100x penicillin and streptomycin Gibco 15140-122
glass capillary tube Narishige G-1
cell culture insert Millipore Millicell CM-ORG
Laminin SIGMA L2020 coating of culture insert
poly-L-Lysine Peptide Institute 3075 coating of culture insert
glass bottom dish Matsunami D11130H
Opti-MEM Gibco 31985-070 culture medium
F12 Gibco 11765-054 culture medium
fetal bovine serum Gibco 12483 culture medium
chick serum Gibco 16110082 culture medium
10xHBSS Gibco 14065-056
microsurgical knife Surgical specialties cooperation 72-1501
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
curved scissors AS ONE No.11
micropipette processor SUTTER INSTRUMENT P97/IVF
forceps-type electrode BEX LF646P3x3
pulse generator BEX CUY21EX electroporator
fluorescence stereoscopic microscope Leica MZ16F
inverted fluorescence microscope Olympus IX81
gas controller Tokken MIGM/OL-2
temperature controller Tokai Hit MI-IBC
laser confocal unit Olympus FV300

References

  1. Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
  2. Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
  3. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
  4. Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
  5. Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
  6. Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
  7. Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
  8. Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
  9. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
  10. Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).

Play Video

Cite This Article
Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum. J. Vis. Exp. (140), e58506, doi:10.3791/58506 (2018).

View Video