Summary

Visualisering av tangentiell celle migrasjon i utviklingsland Chick fiberoptisk Tectum

Published: October 24, 2018
doi:

Summary

Vi beskriver metodene for fluorescerende merking tangentially overføre celler av electroporation og for tidsinnstilt bildebehandling merket celle bevegelsen i en flat-mount kultur for å visualisere migrere celle atferd i den utvikle chick fiberoptisk tectum .

Abstract

Tidsinnstilt bildebehandling er en kraftig metode for å analysere migrere celle atferden. Etter fluorescerende celle merking, kan bevegelsen av merket cellene i kultur registreres under video mikroskopi. For å analysere celle migrasjon i utvikle hjernen, er stykket kultur vanlig å observere celle migrasjon parallelt delen skive som radial celle migrasjon. Imidlertid kan begrenset informasjon fås fra skive kultur metoden å analysere celle migrasjon vinkelrett delen skive som tangentiell celle migrasjon. Her presenterer vi protokollene for time-lapse tenkelig å visualisere tangentiell celle migrasjon i utviklingsland chick fiberoptisk tectum. En kombinasjon av cellen merking av electroporation i ovo og en påfølgende flat-mount kultur på celle kultur innsatsen kan oppdagelsen av migreringen celle bevegelse vannrett. Dessuten Letter vår metode oppdagelsen av både enkeltcelle atferd og kollektiv handling av en cellegruppe på lang sikt. Denne metoden kan potensielt brukes for å følge endringen av fluorescerende-merket mikro-strukturen, inkludert axonal forlengelse i nevrale vev eller celle forskyvning i ikke-nevrale vev.

Introduction

Studiet av celle migrasjon har gått etter med fremmarsj teknikk for live bildebehandling. Etter fluorescerende celle merking, kan timelige bevegelsen av merkede celler i en kultur parabol eller i vivo registreres under video mikroskopi. I studiet av neural utvikling, er morfologiske endringene av migrering celler eller elongating axons analysert ved hjelp av tidsinnstilt bildebehandling. For effektiv bildebehandling er det viktig å bruke en egnet metode for fluorescerende celle merking og vev forberedelse, basert på eksperimentet og analyse. For å analysere celle migrasjon i utvikle hjernen, er slice kultur vanligvis brukt til å observere celle migrasjon parallelt delen skive som radial celle migrasjon1,2,3. Skive kultur-systemet brukes også for å oppdage tangentiell celle migrasjon4,5, men det er ikke egnet for retningsbestemt analyse i tilfeller der cellene spre vinkelrett til delen skive.

Fiberoptisk tectum består av en flerlags struktur, dannet av radial og tangentiell celle migrasjon under embryonale utviklingen. Tectal lag formasjonen avhenger hovedsakelig radial migrering av postmitotic neuronal forløper celler fra sonen ventrikkel og deres endelig destinasjon i lagene korrelerer med sine fødselsdato i ventrikkel sonen6. Som for tangentiell migrasjon rapportert vi tidligere to strømmer av overføringer i midten og overfladiske lagene i en utvikling chick fiberoptisk tectum. I de midterste lag under E6-E8 overføre bipolar cellene med en lang ledende prosess og en tynn etterfølgende prosessen på ryggen eller ventrally langs axon fasciculus av tectal efferent axons som kjører dorso-ventrally7. Etter denne axophilic overføring skille cellene i multipolar nevroner i de dype lag. I overfladisk lagene under E7-E14 spre overfører cellene vannrett ved å reformere en forgrenet ledende prosessen og scatter i flere retninger8. Etter spre migrasjon, skille sistnevnte cellene til slutt ut overfladisk nevroner i ulike morphologies. I begge tilfeller er en flat-mount kultur effektivt å observere celle bevegelse parallelt pial overflaten.

Her presenterer vi en protokoll for time-lapse tenkelig å visualisere tangentiell celle migrasjon i utviklingsland chick fiberoptisk tectum7,8. Kombinasjonen av cellen merking på electroporation i ovo, og en påfølgende flat-mount kultur på celle kultur innsatsen kan påvisning av overfører celle bevegelse og migrasjon retning. Målet med denne metoden er å lette oppdagelsen av både enkeltcelle atferd i langsiktig og kollektiv handling av en gruppe celler vannrett.

Protocol

1. Electroporation i Ovo Forberede uttrykk plasmider DNA fluorescerende merking i høy konsentrasjon. Isolere DNA fra 200 mL bakteriell kultur av alkaliske lysis metoden bruker anion exchange kolonner i henhold til produsentens protokollen (Tabell for materiale). Bland pCAGGS-EGFP og pCAGGS-mCherryNuc i en endelig konsentrasjon av 4 µg/µL hver.Merk: Endotoxin-gratis plasmider DNA rensing kan være foretrukket for electroporation. Inkuber fertile chicken egg vannrett på…

Representative Results

Figur 2 viser visualisert overfladisk tangentiell overføringen i en flat-mount kultur i en tidsperiode (0, 9, 18, 27 h) etter utbruddet av innspillingen. Film 1 er en time-lapse film av 10 min intervaller over en periode på 28 h og 50 minutter. Rammen er valgt for å fokusere på overfører cellene fra merket nederst i venstre hjørne av rammen til umerkede plass (figur 3A). Nasjonalsosialisten…

Discussion

Protokollen beskrevet ovenfor er optimalisert for å oppdage celle migrasjon i overfladisk lag6,8. Det gjelder for å oppdage midterste laget migrasjon bekker (film 5)6,7, bare ved å flytte tidspunktet for electroporation (E5.5 til E4.5) og utbruddet av kultur og imaging (E7.0 til E6.0).

Presentert prosedyren består av celle merking av elect…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI bevilgning nummer 15K 06740 til Y.W.

Materials

Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF MACHEREY-NAGEL 740422.5 endotoxin-free plasmid DNA purification kit
20 ml syringe TERUMO SS-20ESZ
18 gauge needle TERUMO NN-1838R
Fast Green Wako 061-00031
100x penicillin and streptomycin Gibco 15140-122
glass capillary tube Narishige G-1
cell culture insert Millipore Millicell CM-ORG
Laminin SIGMA L2020 coating of culture insert
poly-L-Lysine Peptide Institute 3075 coating of culture insert
glass bottom dish Matsunami D11130H
Opti-MEM Gibco 31985-070 culture medium
F12 Gibco 11765-054 culture medium
fetal bovine serum Gibco 12483 culture medium
chick serum Gibco 16110082 culture medium
10xHBSS Gibco 14065-056
microsurgical knife Surgical specialties cooperation 72-1501
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
curved scissors AS ONE No.11
micropipette processor SUTTER INSTRUMENT P97/IVF
forceps-type electrode BEX LF646P3x3
pulse generator BEX CUY21EX electroporator
fluorescence stereoscopic microscope Leica MZ16F
inverted fluorescence microscope Olympus IX81
gas controller Tokken MIGM/OL-2
temperature controller Tokai Hit MI-IBC
laser confocal unit Olympus FV300

References

  1. Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
  2. Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
  3. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
  4. Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
  5. Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
  6. Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
  7. Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
  8. Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
  9. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
  10. Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).

Play Video

Cite This Article
Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum. J. Vis. Exp. (140), e58506, doi:10.3791/58506 (2018).

View Video