Summary

Visualización de la migración celular tangencial en el Tectum óptico de Chick en desarrollo

Published: October 24, 2018
doi:

Summary

Describimos los métodos de etiquetado fluorescente tangencial migrar las células por electroporación y para Time-lapse de imágenes del movimiento celular marcada en una cultura de plano-montaje para visualizar migración celular comportamiento en El tectum óptico de chick en desarrollo .

Abstract

Proyección de imagen de Time-lapse es un método poderoso para analizar el comportamiento de células migratorias. Después de etiquetado fluorescente de la célula, el movimiento de las células marcadas en la cultura puede grabarse bajo microscopia video. Para el análisis de migración de la célula en el cerebro en desarrollo, sector cultura se utiliza comúnmente para observar la migración de la célula paralela a la sección de corte, como la migración de la célula radial. Sin embargo, la información limitada puede obtenerse desde el método de cultura rebanada para analizar la migración de la célula perpendicular a la sección de corte, como migración tangencial. Aquí, presentamos los protocolos para Time-lapse de imágenes para visualizar la migración de la célula tangencial en El tectum óptico de chick en vías de desarrollo. Una combinación de etiquetado celular por electroporación de ovo y una cultura de plano-montaje posterior en la inserción de la cultura de célula permite la detección de movimiento de migración celular en el plano horizontal. Además, nuestro método facilita la detección de comportamiento de células individuales y la acción colectiva de un grupo de células a largo plazo. Potencialmente, este método puede aplicarse para detectar el cambio secuencial de la etiqueta fluorescente micro-estructura, incluyendo la elongación axonal en el desplazamiento de tejido o células neuronal en el tejido no neural.

Introduction

El estudio de la migración de la célula ha sido avanzando con la técnica de avance de la proyección de imagen vivo. Después de etiquetado fluorescente de la célula, el movimiento temporal de células marcadas en una placa de cultivo o en vivo puede grabarse bajo microscopia video. En el estudio del desarrollo neuronal, se han analizado los cambios morfológicos de migración de las células o alarga axones usando proyección de imagen de Time-lapse. Para la proyección de imagen efectiva, es esencial aplicar un método adecuado para la preparación de tejido y etiquetado fluorescente de la célula, basado en el propósito del experimento y el análisis. Para el análisis de migración de la célula en el cerebro en desarrollo, sector cultura se ha utilizado comúnmente para observar la migración de la célula paralela a la sección de corte, como célula radial migración1,2,3. El sistema de cultivo del sector también se utiliza para detectar células tangenciales migración4,5, pero no es adecuado para análisis direccional en casos donde las células dispersan perpendicular a la sección de corte.

El tectum óptico se compone de una estructura multicapa, formada por la migración radial y tangencial de la célula durante el desarrollo embrionario. Formación de la capa tectal depende principalmente de la migración radial de las células precursoras neuronales postmitotic desde la zona ventricular y su destino final en las capas se correlaciona con su fecha de nacimiento en la zona ventricular6. En cuanto a la migración tangencial, habían divulgado previamente dos flujos de migraciones en las capas intermedias y superficiales en un tectum óptico de chick en vías de desarrollo. En las capas medias en E6-E8, las células bipolares con un líder largo proceso y un proceso final fino migran dorsal o ventralmente a lo largo de la Unión de axon de tectal axones eferentes que dorso-ventralmente7. Después de esta migración de axophilic, las células se diferencian en neuronas multipolares situadas en las capas profundas. En las capas superficiales durante E7-E14, migración de las células dispersa horizontalmente por reformar un proceso principal ramificado y dispersión en múltiples direcciones8. Después de la dispersión de la migración, las últimas células eventualmente se diferencian en neuronas superficiales de diferentes morfologías. En ambos casos, una cultura de plano-montaje es eficaz para observar movimiento celular paralela a la superficie pial.

Aquí, presentamos un protocolo para Time-lapse de imágenes para visualizar la migración de la célula tangencial en El tectum óptico polluelo en desarrollo7,8. Combinación de etiquetado celular por electroporación de ovoy una cultura de plano-montaje posterior en la inserción de la cultura de célula permite la detección de migración dirección de movimiento y migración de célula. El objetivo de este método es facilitar la detección de ambos comportamiento de células individuales en el largo plazo y la acción colectiva de un grupo de células en el plano horizontal.

Protocol

1. Electroporación de Ovo Preparar el ADN del plásmido de expresión etiquetado fluorescente en alta concentración. Aislar ADN de 200 mL de cultivo bacteriano por el método de lisis alcalina mediante columnas de intercambio según protocolo del fabricante (Tabla de materiales). Mezcla pCAGGS-EGFP y pCAGGS-mCherryNuc a una concentración final de 4 μg/μl cada una.Nota: Purificación de DNA de plásmido libre de endotoxina puede ser preferido para la electroporación. <li…

Representative Results

La figura 2 muestra la migración tangencial superficial visualizada en una cultura de plano-montaje en un tiempo transcurrido (0, 9, 18, 27 h) después del inicio de la grabación. Película 1 es una película de lapso de tiempo de 10 min-intervalos durante un periodo de 28 h y 50 min. El marco está seleccionado para centrarse en la migración de las células de la etiqueta esquina inferior izquierda del cuadro al espacio s…

Discussion

El protocolo descrito anteriormente está optimizado para detectar la migración celular en capas superficiales6,8. Es aplicable para la detección de capa media migración arroyos (película 5)6,7, cambiando el momento de la electroporación (E5.5 a E4.5) y el inicio de la cultura y la proyección de imagen (E7.0 a E6.0).

El procedimiento pre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por JSP KAKENHI número 15K 06740 a Y.W.

Materials

Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF MACHEREY-NAGEL 740422.5 endotoxin-free plasmid DNA purification kit
20 ml syringe TERUMO SS-20ESZ
18 gauge needle TERUMO NN-1838R
Fast Green Wako 061-00031
100x penicillin and streptomycin Gibco 15140-122
glass capillary tube Narishige G-1
cell culture insert Millipore Millicell CM-ORG
Laminin SIGMA L2020 coating of culture insert
poly-L-Lysine Peptide Institute 3075 coating of culture insert
glass bottom dish Matsunami D11130H
Opti-MEM Gibco 31985-070 culture medium
F12 Gibco 11765-054 culture medium
fetal bovine serum Gibco 12483 culture medium
chick serum Gibco 16110082 culture medium
10xHBSS Gibco 14065-056
microsurgical knife Surgical specialties cooperation 72-1501
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
curved scissors AS ONE No.11
micropipette processor SUTTER INSTRUMENT P97/IVF
forceps-type electrode BEX LF646P3x3
pulse generator BEX CUY21EX electroporator
fluorescence stereoscopic microscope Leica MZ16F
inverted fluorescence microscope Olympus IX81
gas controller Tokken MIGM/OL-2
temperature controller Tokai Hit MI-IBC
laser confocal unit Olympus FV300

References

  1. Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
  2. Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
  3. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
  4. Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
  5. Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
  6. Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
  7. Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
  8. Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
  9. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
  10. Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).

Play Video

Cite This Article
Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum. J. Vis. Exp. (140), e58506, doi:10.3791/58506 (2018).

View Video