Vi lägger härmed fram ett protokoll för mätning vid sängen av endotoxinhaltig aktivitet av mänskliga helblod prov. Endotoxin Activity assay är ett enkelt test för att prestera och kan vara en användbar biomarkör hos kritiskt sjuka patienter med sepsis.
Lipopolysackarid, även känd som endotoxin, är en fundamental del av gramnegativa bakterier och spelar en avgörande roll i utvecklingen av sepsis och septisk chock. Tidig identifiering av en smittsam process som snabbt utvecklas till en kritisk sjukdom kan leda till en snabbare och intensivare behandling och därmed potentiellt leda till bättre patientresultat. Endotoxin Activity (EA)-analysen kan användas vid sängen som en tillförlitlig biomarkör för systemisk endotoxemi. Detektion av förhöjda endotoxin aktivitetsnivåer har upprepade gånger visat sig vara förknippade med en ökad sjukdoms svårighetsgrad hos patienter med sepsis och septisk chock. Analysen är snabb och enkel att utföra. Kort efter provtagning blandas en alikvot av helblod med en anti-endotoxin-antikropp och med tillsats av LP-skivor. Endotoxin aktivitet mäts som den relativa oxidativa explosion av primade neutrofiler som upptäcks av chemioluminescence. Analysens utdata uttrycks på en skala från 0 (frånvarande) till 1 (maximal) och kategoriseras som “låg” (< 0,4 enheter), "mellanliggande" (0,4 – 0,59 enheter), eller "hög" (≥ 0,6 enheter). Den detaljerade metoden och motivet för genomförandet av EA-analysen rapporteras i detta manuskript.
Lipopolysackarid (LPS), även känd som endotoxin, är en viktig del av membranstruktur gramnegativa (GN) bakterier. Det utgör cirka 10% av cellväggen, är avgörande för den yttre membranet integritet och homeostas. Dessutom, det är en potent aktivator av värd medfödda immunförsvaret1,2.
In vitro exponering av medfödda immunsystemet celler till LPS leder till förändringar i uttrycket av flera gener3. Administrering av mycket små mängder LP-skivor hos friska frivilliga försökspersoner utlöser en kaskad av akut systemisk inflammation, medan sepsis och septisk chock kan uppkomma med högre endotoxkoncentrationer4,5.
Sepsis är ett livshotande tillstånd som, om det inte omedelbart erkänns, kan leda till flera organ misslyckande och död. Septiska patienter måste behandlas i tid, med aggressiv återupplivning, adekvat antibiotikabehandling, optimal källkontroll, och snabba organ stödstrategier. Diagnosen av sepsis är främst baserad på klinisk igenkänning och kulturbaserad patogen detektion6. Resultaten av mikrobiella kulturer kan dock ta upp till 48 h och är ofullständiga i upp till 30% av fallen7. Tidig identifiering och intervention kan leda till bättre patientresultat. Hos patienter i vilka sepsis misstänks fattas ofta beslut på grundval av fysiologiska och biokemiska parametrar, utan ett tydligt tecken på endotoxemi.
Mätningen av Endotoxinaktiviteten (EA) kan erhållas med hjälp av en kommersiell analys (se tabell över material) i helblod. Det kan användas som en biomarkör av systemisk endotoxemia för tidig stratifiering av sjukdomens svårighetsgrad, särskilt hos patienter med risk för att utveckla septisk chock8. Analysen användes för att vägleda polymyxin B hemoperfusion terapi i en nyligen publicerad dubbelblind randomiserad kontrollerad klinisk prövning hos patienter med septisk chock9. Hos kritiskt sjuka patienter visade MEDIC-studien ökade EA-nivåer för att associeras med multipel organdysfunktion, intensivvårdsenhet (ICU) vistelsens längd och mortalitet10.
Olika analyser har utvecklats för att detektera endotoxin. Den Limulus Amoebocyte lysate (LAL) assay, antingen som en gel-propp, turbidimetriska, eller kromogena test, har hittills den mest förekommande för uppskattning av serum endotoxin. Den är baserad på förmågan hos endotoxin att inducera koagulering av hemolymfa av hästsko krabba, Limulus Polyfemos. Emellertid, denna analys har vissa begränsningar när det gäller specificitet. I synnerhet kan det också aktiveras av andra mikrobiella produkter än endotoxin, såsom komponenter i svamp cellväggen, och det kan hämmas av olika humana plasmaproteiner11.
Under det senaste decenniet har mätningen av EA utvecklats och validerats som en biomarkör för cirkulerande endotoxemi. Jämfört med LAL-testet är EA snabbare och enklare att implementera i den kliniska miljön. Dessutom, det har visat sig vara mer exakt än LAL i helblod, med ökad känslighet och specificitet, både in vitro-och in vivo12.
Trots sin första implementering som ett tidigt diagnostiskt verktyg för snabb identifiering av GN bakterier som sepsis smittämnen, har EA-nivån också studerats som en biomarkör för sjukdoms svårighetsgrad. I detta sammanhang har det visat sig vara särskilt användbart för att bedöma hypoperfusion tillstånd på grund av pågående kritisk sjukdom, såsom septisk chock eller efter hjärtstillestånd syndrom13. På senare tid, sedan utvecklingen av hemorenings system, ett positivt EA-resultat har också föreslagits som ett screening verktyg för att exakt identifiera potentiella kandidater för sådan behandling14. Vi genomförde nyligen en observationell retrospektiv studie om prevalensen och den kliniska betydelsen av tidiga höga nivåer av EA hos 107 patienter med septisk chock. I linje med andra nya resultat fann vi att EA är en lovande markör för sjukdomens svårighetsgrad hos patienter med septisk chock15.
Syftet med föreliggande manuskript är att beskriva metoden för att utföra EA-analysen, antingen vid sängen eller i laboratoriet, och för att beskriva dess potentiella användning i ett representativt scenario av septisk chock. Denna teknik kan upptäcka LPS aktivitet genom att mäta den förbättrade oxidativa burst i neutrofiler efter deras grundning av komplex av en anti-endotoxin antikropp och LP-skivor. Den ökade andnings bristningen upptäcks av en kemiluminometer och mängden utsänt ljus anses proportionell mot mängden endotoxin i blodprovet. Analysen kräver några reagens, tar ca 30 min att utföra och använder så lite som 40 μL av helblod12.
Septisk chock är fortfarande idag förknippad med en dödlighet så hög som 40%, även om denna kurs varierar enligt de övervägde rapporter16. Behovet av nya och bättre biomarkörer förespråkas av de flesta experter inom områdena för att hjälpa kliniker i tidig diagnos, bättre förvaltning och Prognosticering av patienter med septisk chock6.
Att utföra ett EA-test kräver inte tidigare teknisk kunskap eller sofistikerad laboratorieutr…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Paolo Braganò och Lisa Mathiasen, Ph.D. för deras granskning av analysen protokoll metodik. Dario Winterton, MD gav betydande hjälp att granska manuskriptet för engelska språkfärdighet.
EAA kit | Spectral Medical Inc. | EAAST-20 | Package with 20 tests + 1 quality control |
Smart Line TL | Berthold | EAASL | Luminometer |
Incubator shaker | GRANT | ES-20 | Mini-incubator shaker |
Vortexer | VWR | 444-2790 | Vortex instrument |