Samtidig og kryosnitt flere gnager hjerner
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å fryse og delen hjernevevet fra flere dyr som en tidsbesparende alternativ til behandling enkelt hjerner. Dette reduserer flekker variasjon i immunohistochemistry og reduserer tid og kryosnitt og bildebehandling.
Abstract
Histologi og immunohistochemistry er rutinemessig analysemetoder å visualisere mikroskopiske anatomi og lokalisere proteiner i biologisk vev. I nevrovitenskap, samt en mengde andre vitenskapelige områder brukes disse teknikkene. Immunohistochemistry kan gjøres på lysbilde montert vev eller frittflytende deler. Forbereder lysbilde montert prøver er en tid intensiv prosess. Følgende protokollen for et teknikk, kalt Megabrain, redusert tiden det tar å cryosection og mount hjernevev med opptil 90% ved å kombinere flere hjerner i en enkelt frosne blokk. Videre, denne teknikken redusert variasjon sett mellom flekker runder, i en stor histochemical studie. Gjeldende teknikken er optimalisert for bruk av gnager hjernevev i nedstrøms immunohistochemical analyser; men kan det brukes til forskjellige vitenskapelige felt som bruker og kryosnitt.
Introduction
Her presenterer vi protokoll for en ny metode, som vi kaller Megabrain, utviklet for å cryosection flere gnager hjerner samtidig for nedstrøms immunohistochemical prosedyrer. En Megabrain kan for produksjon av enkeltlysbilder som inneholder vev fra flere dyr. Denne teknikken er blitt optimert for å kutte framskaffet 9 voksen rotte halvkuler eller 5 voksne full hjernen, samtidig. Derfor er teknikken mest aktuelt i store immunohistochemical studier eller andre analyser gjort på lysbilde montert hjernevevet fra en stor kohort av dyr.
Immunohistochemistry innebærer bruk av spesifikke antistoffer rettet mot proteiner av interesse å forstå og karakterisere deres uttrykk og mobilnettet endringer i bestemte vev1,2,3. Bruk av immunohistochemistry er utbredt i nevrovitenskap forskning, blant andre vitenskapelige disipliner, hjelpe i mobilnettet og molekylære forståelsen av hjernen4. Store studier som involverer mange dyr og hjernen delene kan være både ressurser og tid intensiv. Som sådan, det er en mangefasettert begrunnelsen bak utviklingen av Megabrain: å redusere tid brukt og kryosnitt, montering og flekker vev, mens du bruker derfor mindre reagenser. Dessuten mulighet til å strømlinjeforme prosessen og flekken flere hjerner i samme runde bidrar til å lindre noen av variasjon mellom flekker bunker, en begrensning av immunohistochemistry3. I tillegg snitting en Megabrain er en tidsbesparende alternativ til snitting personlige frosne gnager hjerner og gir mulighet for rask sammenligning av vev mellom dyr eller selv behandlingsgrupper av mikroskopi teknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det bør vurderes under denne prosedyren at temperaturen på Megabrain og omegn må overvåkes kontinuerlig for å hindre tining og re frysing av vev. Hjernen kan bare fjernes fra 20 ° C fryseren opp til 3 ganger som hver gang det rørte og venstre i kryostaten, med en varmere varierende temperatur, vevet thaws og refreezes, forårsaker en gelé som tekstur og unormale vevet integritet10. Derfor er det optimale å kutte Megabrain samtidig.
Vev fiksering og cryoprotecti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCH oppdrag Support fond støtte forskning rapportert i dette manuskriptet. Forfatterne vil gjerne takke Daniel Griffiths for å ta bilder som brukes i tallene.
Materials
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) – white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?. Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).
- Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).
