Summary

Samtidig og kryosnitt flere gnager hjerner

Published: September 18, 2018
doi:

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å fryse og delen hjernevevet fra flere dyr som en tidsbesparende alternativ til behandling enkelt hjerner. Dette reduserer flekker variasjon i immunohistochemistry og reduserer tid og kryosnitt og bildebehandling.

Abstract

Histologi og immunohistochemistry er rutinemessig analysemetoder å visualisere mikroskopiske anatomi og lokalisere proteiner i biologisk vev. I nevrovitenskap, samt en mengde andre vitenskapelige områder brukes disse teknikkene. Immunohistochemistry kan gjøres på lysbilde montert vev eller frittflytende deler. Forbereder lysbilde montert prøver er en tid intensiv prosess. Følgende protokollen for et teknikk, kalt Megabrain, redusert tiden det tar å cryosection og mount hjernevev med opptil 90% ved å kombinere flere hjerner i en enkelt frosne blokk. Videre, denne teknikken redusert variasjon sett mellom flekker runder, i en stor histochemical studie. Gjeldende teknikken er optimalisert for bruk av gnager hjernevev i nedstrøms immunohistochemical analyser; men kan det brukes til forskjellige vitenskapelige felt som bruker og kryosnitt.

Introduction

Her presenterer vi protokoll for en ny metode, som vi kaller Megabrain, utviklet for å cryosection flere gnager hjerner samtidig for nedstrøms immunohistochemical prosedyrer. En Megabrain kan for produksjon av enkeltlysbilder som inneholder vev fra flere dyr. Denne teknikken er blitt optimert for å kutte framskaffet 9 voksen rotte halvkuler eller 5 voksne full hjernen, samtidig. Derfor er teknikken mest aktuelt i store immunohistochemical studier eller andre analyser gjort på lysbilde montert hjernevevet fra en stor kohort av dyr.

Immunohistochemistry innebærer bruk av spesifikke antistoffer rettet mot proteiner av interesse å forstå og karakterisere deres uttrykk og mobilnettet endringer i bestemte vev1,2,3. Bruk av immunohistochemistry er utbredt i nevrovitenskap forskning, blant andre vitenskapelige disipliner, hjelpe i mobilnettet og molekylære forståelsen av hjernen4. Store studier som involverer mange dyr og hjernen delene kan være både ressurser og tid intensiv. Som sådan, det er en mangefasettert begrunnelsen bak utviklingen av Megabrain: å redusere tid brukt og kryosnitt, montering og flekker vev, mens du bruker derfor mindre reagenser. Dessuten mulighet til å strømlinjeforme prosessen og flekken flere hjerner i samme runde bidrar til å lindre noen av variasjon mellom flekker bunker, en begrensning av immunohistochemistry3. I tillegg snitting en Megabrain er en tidsbesparende alternativ til snitting personlige frosne gnager hjerner og gir mulighet for rask sammenligning av vev mellom dyr eller selv behandlingsgrupper av mikroskopi teknikker.

Protocol

Megabrain teknikken er optimalisert ved hjelp av hele og hemisected hjernen fra mannlig voksen C57Bl6 mus5, juvenile Sprague-Dawley rotter og voksen Sprague-Dawley rotter som var transcardially parfyme med 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) fulgt med 4% paraformaldehyde6. Lignende resultater kan oppnås i andre stammer av mus og rotten, i begge kjønn og på ulike aldersgrupper. Studien å generere data for dette manuskriptet brukt juvenile Sprague-Dawley rotter og ble godkje…

Representative Results

Et positivt sluttresultat denne prosedyren er vev som ligger flatt på lysbildet uten bobler eller tårer, i retning der de ble frosset. Vev deler er avstand fra hverandre og lett identifiserbare på grunn av god plassering av hjernen i Tilpasningsverktøy for Office og god notasjon som vist i figur 1. Forutsatt at hjernevev ble samlet inn fra dyr av samme alder, og at vevet ble riktig justert i Tilpasningsverktøy for Office, skal inndelinger samlet på et l…

Discussion

Det bør vurderes under denne prosedyren at temperaturen på Megabrain og omegn må overvåkes kontinuerlig for å hindre tining og re frysing av vev. Hjernen kan bare fjernes fra 20 ° C fryseren opp til 3 ganger som hver gang det rørte og venstre i kryostaten, med en varmere varierende temperatur, vevet thaws og refreezes, forårsaker en gelé som tekstur og unormale vevet integritet10. Derfor er det optimale å kutte Megabrain samtidig.

Vev fiksering og cryoprotecti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PCH oppdrag Support fond støtte forskning rapportert i dette manuskriptet. Forfatterne vil gjerne takke Daniel Griffiths for å ta bilder som brukes i tallene.

Materials

Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) Fisher Scientific 14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Fisher Scientific 18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-128
Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap Fisher Scientific 03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg Fisher Scientific S2-212 Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical Fisher Scientific O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers Fisher Scientific 02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) Fisher Scientific 13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula Fisher Scientific 14-357Q
STANLEY Razor Blade Grainger 4A807
Edge-Rite Microtome blades Fisher Scientific 14-070-60
Microscope slides (1" frost) – white Fisher Scientific 22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 Fisher Scientific 70-013-032 Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes Amazon B079J12ZRV
PAP pen abcam ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. Electron Microscopy Sciences EMS065

References

  1. Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
  2. Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?. Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).
  3. Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
  4. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
  5. Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
  6. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  7. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
  8. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
  9. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
  10. Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).
  11. Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).

Play Video

Cite This Article
Green, T. R., Ortiz, J. B., Harrison, J. L., Lifshitz, J., Rowe, R. K. Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains. J. Vis. Exp. (139), e58513, doi:10.3791/58513 (2018).

View Video