Summary
Dit werk presenteert de voorbereiding van methionine Gefunctionaliseerde biocompatibele blok copolymeren (mBG) via de omkeerbare addition-fragmentatie Chain Transfer (RAFT) methode. De plasmide DNA-complexering van het verkregen mBG en hun transfectie efficiëntie werden ook onderzocht. De RAFT methode is zeer gunstig voor polymerisatie monomeren met speciale functionele groepen.
Abstract
Omkeerbare toevoeging-fragmentatie ketting overdracht (RAFT) polymerisatie integreert de voordelen van radicale polymerisatie en levende polymerisatie. Dit werk presenteert de voorbereiding van methionine Gefunctionaliseerde biocompatibele blok copolymeren via RAFT polymerisatie. Ten eerste, n, n-bis(2-hydroxyethyl) methacrylamide-b-N-(3-AMINOPROPYL) methacrylamide (BNHEMA-b-APMA, BA) werd gesynthetiseerd via RAFT polymerisatie met 4, 4 '-AZOBIS (4-cyanovalerische zuur) (acva) als een initiërende agent en 4-cyanopentanoïnezuur dithiobenzoaat (CTP) als de keten transfer agent. Vervolgens, n, n-bis(2-hydroxyethyl) methacrylamide-b-N-(3-guanidinopropyl) methacrylamide (methionine geënt bnhema-b-gpma, mbg) werd bereid door het wijzigen van Amine groepen in APMA met methionine en guanidine Groepen. Drie soorten blok polymeren, mBG1, mBG2 en mBG3, werden gesynthetiseerd ter vergelijking. Een ninhydrine-reactie werd gebruikt om het APMA-gehalte te kwantificeren; mBG1, mBG2 en mBG3 hadden respectievelijk 21%, 37% en 52% van de APMA. De resultaten van de gelpermeatiechromatografie (GPC) toonden aan dat BA-copolymeren molecuulgewichten bezitten van 16.200 (BA1), 20900 (BA2) en 27200 (BA3) g/mol. Het plasmide DNA (pDNA) complexvormende vermogen van het verkregen blokcopolymeer gendragers werd ook onderzocht. De charge ratio's (N/P) waren 8, 16 en 4 toen pDNA volledig werd aangevuld met respectievelijk mBG1, mBG2, mBG3. Toen de N/P ratio van mBG/pDNA polyplexen hoger was dan 1, was de Zeta-potentiaal van mBG positief. Bij een N/P-verhouding tussen 16 en 32 bedroeg de gemiddelde deeltjesgrootte van mBG/pDNA-polyplexen tussen 100-200 nm. Over het algemeen illustreert dit werk een eenvoudig en handig protocol voor de copolymeer Carrier synthese van Block.
Introduction
In de afgelopen jaren is gentherapie ontstaan voor de therapeutische afgifte van nucleïnezuren als geneesmiddelen voor de behandeling van allerlei ziekten1. De ontwikkeling van gengenees middelen, waaronder plasmide DNA (pDNA) en klein interfererende RNA (siRNA), is afhankelijk van de stabiliteit en efficiëntie van het geneesmiddel bezorgingssysteem (DDS)2. Onder alle DDS, kationische polymeer dragers hebben de voordelen van goede stabiliteit, lage immunogeniciteit, en facile voorbereiding en modificatie, die kationische polymeer dragers brede toepassing prospects3,4geven. Voor praktische toepassingen in de biomedische, onderzoekers moeten een kationische Polymer Carrier met hoge efficiëntie te vinden, lage toxiciteit, en goede targeting vermogen5. Onder alle polymeer dragers, Block copolymeren zijn een van de meest gebruikte drug delivery systemen. Block copolymeren worden intensief bestudeerd voor hun zelf-assemblage eigendom en capaciteiten om micellen, microsferen en nanodeeltjes te vormen in de levering van geneesmiddelen5. Blok copolymeren kunnen worden gesynthetiseerd via levende polymerisatie of klik op scheikunde methoden.
In 1956, szwarc et al. verhoogde het onderwerp van levende polymerisatie, definiëren het als een reactie zonder keten-brekende reacties6,7. Sindsdien zijn er meerdere technieken ontwikkeld om polymeren te synthetiseren met behulp van deze methode; levende polymerisatie wordt dus gezien als een mijlpaal van polymeer wetenschappen8. Levende polymerisatie kan worden ingedeeld in levende anionische polymerisatie, levende cationische polymerisatie en omkeerbare deactivering radicale polymerisatie (RDRP)9. Levende anionische/kationische polymerisaties hebben een beperkt toepassingsgebied vanwege hun strenge reactieomstandigheden10. Gecontroleerd/levend radicaal polymerisatie (CRP) heeft milde reactieomstandigheden, handige dispositie, en goede opbrengst en is dus een belangrijke onderzoeksinfrastructuur geweest in de afgelopen jaren11. In CRP worden actieve propagatie ketens reversibel gepassiveerde tot slapende om de concentratie van vrije radicalen te verminderen en de bimoleculaire reactie van voortplantings keten radicalen te voorkomen. De additie polymerisatie kan alleen worden voortgezet als de inactieve teelt ketens omkeerbaar worden geanimeerd in keten radicalen. Als een van de meest veelbelovende vormen van levend radicaal polymerisatie, omkeerbare toevoeging-fragmentatie ketting overdracht (RAFT) polymerisatie is een methode die van toepassing is op het rendements blok polymeren met gecontroleerd moleculair gewicht en structuur, smal moleculair gewicht distributie en het meenemen van functionele groepen12. De sleutel tot succesvolle RAFT polymerisatie is het effect van keten Transfer agenten, meestal dithioesters, die zeer hoge keten overdracht constante bezitten.
In dit document is een RAFT-polymerisatie methode ontworpen om BNHEMA-b-APMA-blok-polymeer te bereiden, waarbij 4, 4 '-azobis (4-cyanovalerische zuur) (acva) als initiërende middel en 4-cyanopentanozuurdithiobenzoaat (CTP) als keten transfer agent wordt gebruikt. RAFT polymerisatie werd twee keer gebruikt om BNHEMA in de cationische polymeer dragers te introduceren. Vervolgens werden de amine groepen in de APMA-keten gemodificeerd met methionine en de guanidinylatie-reagens 1-amidinopyrazol hydrochloride. Door het gebruik van de positieve ladingen van het guanidinylatiereagens en de methacrylamide polymeerskelet structuur werd de cellulaire opname-efficiëntie van de verkregen blok polymeer dragers verbeterd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. synthese van BNHEMA polymeer (PBNHEMA)
- Los 1,87 g n, n-bis(2-hydroxyethyl) METHACRYLAMIDE (bnhema) op in 1 ml gedistilleerd water in een polymerisatie fles.
Opmerking: de polymerisatie fles is een rondbodemkolf met een rubberen stop en een magneetroerder. - Los 0,03 g 4-cyanopentanoïnezuur dithiobenzoaat (CTP) en 0,02 g 4, 4 '-azobis (4-cyanovalericzuur) (ACVA) op in 0,5 mL van 1,4-dioxaan in een bekerglas van 5 mL. Voeg vervolgens de CTP-en ACVA-oplossing toe aan de polymerisatie fles uit stap 1,1.
- Ventilaat het reactiesysteem in de polymerisatie fles met stikstof via drie Vries pomp-dooi cycli.
- In detail, Vries de oplossing in de polymerisatie fles met behulp van een condensaat vanger, bevestig de polymerisatie fles aan de ijzer steun en vacuumiseert en Injecteer stikstof in het reactiemengsel via een buis getipt met een naald (#9 naald, binnendiameter 0,65 mm, buitendiameter 0,9 mm). Verzegel de polymerisatie fles en dooi de oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Herhaal de Vries pomp drie keer.
- Zet de polymerisatie fles in een oliebad van 70 °C en laat de oplossing gedurende 24 uur reageren onder de stikstof atmosfeer.
- Chill de polymerisatie fles bij 0 °C en open de rubberen stop om het polymerisatieproces te beëindigen.
- Precool aceton in een koelkast van 20 °C voor 2 uur en meng het vervolgens met de reactie oplossing van stap 1,5 bij 50:1 (v/v). Daarna Centrifugeer bij 8.200 x g gedurende 10 minuten om aceton te verwijderen en het precipitaat te verzamelen.
- Om de gesynthetiseerde pbnhema te zuiveren, los het verzamelde precipitaat op in 2 ml zuiver water en meng het vervolgens met 100 ml gekoelde aceton, bij de verhouding van 1:50 (v/v). Centrifugeer de oplossing gedurende 10 minuten bij 8.200 x g en vang het precipitaat op. Herhaal dit proces drie keer.
- Droog de geproduceerde PBNHEMA met een 50 °C vacuüm droger. Eenmaal gedroogd, weeg het poeder met een balans. Bereken het rendementspercentage volgens vergelijking 1.
1
Opmerking: in dit experiment was het behaalde rendement 77,2%.
12. synthese van BNHEMA-b-APMA polymeer (BA)
- Los 0,96 g N-(3-aminopropyl) methacrylamidehydrochloride (APMA) en 0,93 g PBNHEMA op in 5 ml gedistilleerd water in een bekerglas van 10 ml.
- Los 0,01 g 4, 4 '-azobis (4-cyanovalerische zuur) (ACVA) op in 0,5 mL van 1, 4-dioxaan en meng met de APMA-PBNHEMA oplossing uit deel 2,1.
- Breng het mengsel in een polymerisatie fles en ventilaat met droge stikstof gedurende 1 uur.
- Zet de polymerisatie fles in een oliebad van 70 °C en laat deze gedurende 24 uur reageren onder de stikstof atmosfeer.
- Chill de polymerisatie fles bij 0 °C en open de rubberen stop om het polymerisatieproces te beëindigen.
- Breng de oplossing over naar het gekoelde aceton uit stap 1,6 en centrifugeer vervolgens de oplossing bij 8.200 x g gedurende 10 minuten om de BA neer te slaan.
- Los de BA op in 2 mL gedistilleerd water en precipitaat het polymeer in gekoeld aceton. Herhaal dit drie keer.
- Droog de geproduceerde BA in een 50 °C vacuüm droger en weeg het verkregen poeder af. Bereken het rendementspercentage volgens vergelijking 2.
Opmerking: in dit experiment werd het rendementspercentage berekend op 82,0%.
3. Bepaal de mol procent van APMA in BA copolymeer via de ninhydrine-methode
Opmerking: Spectrophotometrie wordt gebruikt om de inhoud van multicomponent aminozuren te bepalen. Het principe is een kleurreactie van ninhydrine en aminozuur waarbij de extinctie is gecorreleerd met het aminozuurgehalte tot op zekere hoogte13,14.
- Los 5 g ninhydrine op in 125 mL kokend gedestilleerd water. Los ook 5 g vitamine C op in 250 mL warm gedestilleerd water. Voeg de 250 ml vitamine C oplossing druppelsgewijs toe aan de ninhydrine oplossing onder magnetisch roeren. Blijf 15 minuten roeren en ontspan vervolgens de reactie oplossing in een koelkast van 4 °C.
- Haal de oplossing uit de koelkast en filtreer met behulp van een Buchner trechter om gereduceerde ninhydrin te verkrijgen. Vang het precipitaat op en bewaar het in een fosforpentoxide Dehydrator.
- Los 85 mg ninhydrine en 15 mg gereduceerde ninhydrine in 10 mL ethyleenglycol monomethylfumaraat ether op om de ninhydrinkleuringoplossing te bereiden.
Opmerking: Ninhydrinkleuringoplossing kan reageren met α-amino in de APMA en een violet verbinding vormen met een structuur zoals beschreven in een vorige studie15. - Verdun 1 mL van 0, 1, 10, 100, 1.000 mg/mL APMA monomeer oplossingen met 1 mL acetaatbuffer (2 M, pH 5,4) en voeg vervolgens 1 mL ninhydrinekleuringoplossing toe.
- Verwarm de mengsels 15 min in een kokend waterbad en koel ze vervolgens af met stromend water. Laat de oplossingen 5-10 min zitten en Verdun ze met 3 mL 60% ethylalcohol en meng ze grondig. Meet de extinctie op 570 nm met behulp van een spectrofotometer en teken de standaard curve (vergelijking 3).
Opmerking: vergelijking 3 is afgeleid van de lineaire aanpassing van de extinctie bij 570 nm versus de APMA-concentratie. - Los 0,01 g BA op in 1 mL gedistilleerd water; Voeg 1 mL acetaatbuffer (2 M, pH 5,4) en 1 mL ninhydrinekleuringoplossing toe. Bereken het molaire gehalte van APMA volgens de extinctie bij 570 nm.
5
Opmerking: de berekeningsformules zijn als volgt (vergelijkingen 3-6).
5
4. synthese van methionine geënt BA polymeer (mBA)
- Los 8,9 mg FOMC-methionine op in 5 mL DMSO in een herstel kolf.
- Voeg 6,92 mg 1-ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimidehydrochloride (EDCl) en 4,86 mg 1-hydroxybenzotriazol (HOBT) toe aan de herstel kolf en reageer bij 0 °C gedurende 0,5 uur.
- Los 2,59 g BA op in 5 mL DMSO-oplossing en voeg vervolgens 50 μL trimethylamine toe; Voeg deze oplossing druppelsgewijs toe aan de herstel kolf (stap 4,2) en laat de oplossing op kamertemperatuur reageren voor 0,5 uur.
- Dialyze te verwijderen DMSO en trimethylamine uit de BA-oplossing in stap 4,3 met behulp van een dialyse zak (MWCO 10 kDa) in een 2 L bekerglas voor 24 h; Vervang het gedeïoniseerde water elke 6 h.
- Vries droog de behaalde mBA en weeg om het rendementspercentage te berekenen volgens vergelijking 7.
Opmerking: in dit geval werd het rendementspercentage vastgesteld op 71%. - Kwantificeer de NH2 met MBA door meting van de extinctie bij 570 nm om de hoeveelheid geënt methionine te berekenen. Bereken het molaire gehalte van methionine volgens vergelijking 8.
5. synthese van guanidinated en methionine geconjugeerd BNHEMA-b-APMA polymer (mbg)
Opmerking: drie verschillende mBA1, mBA2 en mBA3 copolymeer werden gesynthetiseerd. mBA3 copolymeer wordt als voorbeeld gebruikt in de volgende stappen.
- Los mBA3 met 60 μmol van amino groep op in 5 mL zuiver water.
Opmerking: amino Group-inhoud is gekwantificeerd met behulp van de ninhydrine-methode zoals beschreven in stap 3,5. - Los 40,6 mg (300 μmol) guanidinylation reagens 1-amidinopyrazol hydrochloride op in mBA-oplossingen.
- Stel de pH op 9,0 met de verzadigde oplossing van natriumcarbonaat en laat deze gedurende 24 uur op kamertemperatuur stabiliseren.
- Dialyseer het mBG-product met gedeïoniseerd water met behulp van een dialyse zakje in een bekerglas (MWCO 10 kDa, 2 L) en bewaar het in de vorm van een gevriesdroogd poeder.
Het rendementspercentage werd berekend op 85% via vergelijking 8.
8 - Los mBG poeder in D2O in de NMR buizen en karakteriseren het met behulp van 1h nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (1h NMR)16.
86. bereiding en karakterisering van mBG/pDNA polyplexen
- Los 50 μg pDNA op in 50 μL RNase/DNase-vrij water.
- Los 1 mg mbg copolymeren op in 1 ml RNase/DNase-vrij water.
- Voeg de oplossing mBG copolymeren direct toe aan de pDNA-oplossing volgens verschillende voedings verhoudingen, dat wil doen, verschillende N/P-verhoudingen (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 en 32:1).
Opmerking: de N/P-verhouding wordt gedefinieerd als de molaire verhouding van de guanidine-groep in het polymeer en de fosfaatgroep in pDNA, namelijk de molaire verhouding van de GPMA-keten in het polymeer en het mononucleotide in pDNA. De N/P-verhouding wordt berekend op basis van het molecuulgewicht van amino-stikstof (N) in de mBG-en fosfaatgroep (P) in pDNA. - Meng de oplossingen met een Vortex mixer en laat ze 30 minuten staan bij kamertemperatuur. Daarna, dispergeren van het mengsel in fosfaatbufferoplossing (PBS, pH 7,4) en behoud van de verkregen mBG/pDNA polyplexen bij 4 ° c voor de follow-up experimenten.
Opmerking: de gemiddelde deeltjesgrootte en Zeta-potentiaal van mBG en de complexen werden gedetecteerd met behulp van Dynamische lichtverstrooiing (DLS)17. - Verdun 10 μL van de mbg/pdna kunst-oplossingen met 1 ml PBS (pH 7,4) in de DLS-en Zeta-potentiaal monster cellen.
Opmerking: deeltjesgrootte en Zeta potentiële detectie werden drie keer uitgevoerd en een gemiddelde van de drie waarden werd genomen.
7. elektroforetisch retardatie-experiment van mBG/pDNA-polyplexen
Opmerking: er is een elektroforetisch retardatie-experiment uitgevoerd om de minimale oplaad verhouding te bepalen.
- Neem vijf groepen van de mBG/pDNA-polyplexen met verschillende N/P-verhoudingen (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 en 32:1) met 50 μg pDNA.
- Voeg 6x laad buffer toe aan de mbg/pdna kunst samples tot een uiteindelijke concentratie van 1x.
- Voeg de oplossingen toe aan de 1,5% agarose gels en voer de gel op 90 mV gedurende 15 min, met behulp van pDNA als controle.
- Maak foto's van de gels met behulp van een gel Imager.
8. cytotoxiciteit van mBG/pDNA-polyplexen
- Zaad MCF-7 cellen in de 96-goed platen met een dichtheid van 104 cellen per put. Kweek vervolgens de cellen voor 12 h met behulp van DMEM medium (10% FBS en 1% antibioticum) in een bevoficeerde 37 °C incubator geleverd met 5% CO2.
- Vervang het kweekmedium door antibioticum vrije DMEM-kweekmedia met 10% foetaal runderserum (FBS) en mBG/pDNA-polyplexen van verschillende charge ratio's (N/P 4, 8, 16 en 32, n = 6) voor 6 uur, waarbij cellen worden toegevoegd met gelijke volumes PBS-oplossing als de controle. Vervang vervolgens het kweekmedium met 150 μL vers 1640 medium en verdere kweek de cellen gedurende 24 uur.
- Voeg 5 mg/mL 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-oplossing (20 μL/goed) toe aan de 96-put-platen en verdere kweek de cellen voor 4 uur.
- Verwijder de oplossing en voeg 150 μL DMSO toe aan elk goed en schud de 96-well platen 30 sec.
- Meet de optische dichtheid (OD) bij 490 nm met een microplaat lezer om de levensvatbaarheid van de cel te tonen. Bereken het percentage van de levensvatbaarheid van de cel volgens vergelijking 9.
Levensvatbaarheid van de
cel% = (9)
cel% = (9)9. transfectie-efficiëntie van mBG/GFP-pDNA-polyplexen
- Los 50 μg pDNA op met de reporter gene green fluorescent proteïne (GFP) pDNA (GFP-pDNA) in 50 μL RNase/DNase-vrij water. Los vervolgens 1 mg mbg copolymeren op in 1 ml RNase/DNase-vrij water. Meng de pDNA-en mBG-oplossing tegen een charge ratio (N/P) van 1:1, 4:1, 8:1, 16:1 en 32:1 en incuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Dispergeren de mBG/GFP-pDNA polyplexen oplossing met behulp van ultrasone golven (30 s) en op te slaan op 4 ° c voor de follow-up experimenten.
Opmerking: de N/P-verhouding wordt berekend op basis van het molecuulgewicht van amino-stikstof (N) in de mBG-en fosfaatgroep (P) in pDNA. - Zaad MCF-7 cellen met een dichtheid van 2 × 105 cellen per put in een 6-well plaat en cultuur ze op 37 ° c en 5% Co2 in een bevoficeerde incubator voor 12 uur.
- Vervang het kweekmedium door het verse kweekmedium met mBG/GFP-pDNA-polyplexen van verschillende N/P-verhoudingen (4, 8, 16 en 32) gedurende 6 uur.
- Vervang het medium door 2 mL vers RPMI1640 medium en kweek voor 48 h.
- Verzamel de cellen en Detecteer de groene fluorescentie met een flow-cytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BNHEMA werd gevoed volgens de objectieve graad van polymerisatie zoals weergegeven in tabel 1; de synthese procedure van mBG wordt weergegeven in Figuur 1. Ten eerste werd BNHEMA homopolymer bereid via de omkeerbare additie-fragmentatie ketting Transfer (RAFT) methode in het water-dioxaan systeem, met behulp van 4-cyanopentanozuur dithiobenzoaat als keten transfer agent. Ten tweede werd PBNHEMA gebruikt als keten transfer agent om BNHEMA-b-APMA Block Polymer voor te bereiden. APMA monomeer werd gevoed volgens de objectieve graad van polymerisatie zoals weergegeven in tabel 1. Gel Permeatie Chromatografie (GPC) werd uitgevoerd om het molecuulgewicht van BA met verschillende voedings verhoudingen te detecteren (tabel 1). Het werkelijke molaire gehalte van APMA ketens in BA met verschillende voedings verhoudingen werd gedetecteerd via de ninhydrine-methode (tabel 1). Volgens onze eerdere studie5, gebruikten we mBG3 in de huidige studie omdat het het hoogste APMA-gehalte heeft. Tot slot werd methionine geënt op de APMA-keten en de residuele amine groepen waren volledig guanidinyated om mBG te bereiden. Figuur 2 is de 1H NMR-gegevens van mbg. De gemiddelde deeltjesgrootte en Zeta-potentiaal van mBG/pDNA-polyplexen waren respectievelijk 124 nm en + 15,7 mV bij een N/P-ratio van 16 (Figuur 3).
Elektroforetisch retardatie is een snelle en eenvoudige techniek die scheiding van ongebonden pdna en copolymeer/pdna kunst inhoudt op basis van verschillen in hun elektrofortische mobiliteit in agarose gels. De ongebonden pDNA band kan bewegen in de agarose gel onder de werking van het elektrische veld. In het elektroforetisch retardatie-experiment (Figuur 4) kan pdna (met een N/P-verhouding van 0) zonder terughoudendheid in de agarose-gel bewegen en werd waargenomen als een streep in de gel Imager. Wanneer pDNA is gecomplexed met mBG, wordt de beweging van pDNA vertraagd en vervolgens wordt de helderheid van de band gereduceerd. Figuur 4 toont aan dat mbg de pdna volledig kan complex als N/P hoger is dan 4.
De cytotoxiciteit van de mBG/pDNA-polyplexen werd gemeten met behulp van de standaard MTT-test (Figuur 5). De resultaten tonen aan dat mBG/pDNA-polyplexen duidelijk een lagere cytotoxiciteit hebben dan PEI/pDNA-polyplexen bij de N/P-verhoudingen van 4, 8, 16 en 32 in de MCF-7-cellijn (P < 0,05, N = 3, one-way ANOVA). Bovendien neemt de cytotoxiciteit van mBG/pDNA-polyplexen toe met een verhoogde N/P-verhouding. De toename van de cytotoxiciteit van mBG/pDNA-polyplexen met een verhoogde N/P is het resultaat van het positief geladen GPMA-onderdeel. mBG/pDNA polyplexen vertoonden minder cytotoxiciteit dan de polyplexen van PEI/pDNA, die kunnen worden toegeschreven aan de aanwezigheid van BNHEMA in de copolymeren die de oppervlakte lading van kationische polymeren afschermende.
De N/P-verhouding die in het pdna transfectie-experiment werd gebruikt, werd geselecteerd volgens de resultaten van de cytotoxiciteit. Zoals weergegeven in Figuur 6werden de transfectie capaciteiten van MBG1, MBG2 en mBG3 vergeleken door de intensiteit van de GFP-fluorescentie te meten en de resultaten toonden aan dat mBG3 de optimale gendrager is. Hoewel PEI/pDNA-polyplexen met een N/P-ratio van 8 vergelijkbare transfectie-efficiëntie hebben als mBG3/pDNA-polyplexen met een N/P-verhouding van 32, heeft PEI een hogere cytotoxiciteit en heeft het geen functies zoals het laden van geneesmiddelen, waardoor de toepassing ervan in het biomedische veld wordt beperkt. De resultaten toonden aan dat de toename van AMPA inhoud essentieel is voor het verbeteren van de transfectie-efficiëntie van mBG copolymeer. Zoals we al vermeldde in een eerdere studie5, cel penetrerende peptiden (cpp's) zijn 9-35 Mer kationische of amfipathische peptiden met een vermogen om te dringen de celmembraan. De guanidine groep is een cationische cpp die kan worden geconjugeerd in een polymeer om de transfectie van polymeer/pdna kunst te verbeteren door middel van een eiwit-onafhankelijk transmembraan traject. Daarom integreert mBG copolymeer voordelen met betrekking tot guanidine groepen voor celpenetratie en de BNHEMA component voor afscherming, met een groot potentieel voor effectieve genlevering.
| Monster | BHEMA-b-APMA | Mw | Pdi | |
| Theoretische waarde van het APMA-gehalte (%) | Werkelijke waarde van APMA-gehalte (%) | |||
| BNHEMA90-b-APMA30(BA1) | 25 | 21 | 16200 | 1,25 |
| BNHEMA90-b-APMA60(BA2) | 40% | 37% | 20900 | 1,21 |
| BNHEMA90-b-APMA90(BA3) | 50% | 52% | 27200 | 1,25 |
Tabel 1: de samenstelling van BNHEMA-b-APMA door RAFT polymerisatie.
Figuur 1: schematische synthese procedure van mBG. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: 1H NMR spectra van Mbg in D2O. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: deeltjesgrootte en Zeta-potentiaal van de polyplexen.
A) de deeltjesgrootte van BA/pdna. B) de deeltjesgrootte van mbg/pdna. C) het Zeta-potentieel van BA/pdna. D) Zeta-potentiaal van mbg/pdna. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: agarose gel elektroforese beelden van BA3
(a) , mBA3 (b) en mBG3 (c) polyplexen bij verschillende laad verhoudingen.
Figuur 5: cytotoxiciteit van mBG/pDNA-polyplexen bij verschillende N/P-ratio in MCF7 cellijn.
Pei/pdna kunst werd gebruikt als de controle. De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 3). * geeft p < 0,05 aan in vergelijking met de PEI-groep. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: transfectie-efficiëntie van mBG/pDNA-polyplexen bij N/P-ratio van 4, 8, 16 en 32 werden gemeten door flow cytometer.
De gegevens werden getoond als gemiddelde ± SD (n = 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie introduceerde een reeks BNHEMA-b-APMA blok polymeer cationische gendragers. Deze blok polymeren werden gesynthetiseerd via de omkeerbare addition-fragmentatie Chain Transfer (RAFT) methode. Het hydrofiele segment BNHEMA werd geïntroduceerd om de oplosbaarheid te verbeteren. Methionine en guanidine groepen werden aangepast ter verbetering van het doelvermogen en transfectie efficiëntie5. De APMA-keten-inhoud verhoogd en guanidinylering in mBG copolymeer verminderde de deeltjesgrootte van mBG/pDNA polyplexen. De deeltjesgrootte en het oppervlakte potentieel maken het complex gemakkelijk over het celmembraan en toepasbaar op transfectie. De kritische punten in het experiment liggen in het strikt beheersen van de molaire verhouding van de BNHEMA monomeer en CTP tot 45:1, de molaire verhouding van CTP en ACVA tot 2:1, en de temperatuur tot 70 °C. Tijdens het zuiverende proces moet de volume verhouding van de voorgekookte aceton-en polymeeroplossing hoger zijn dan 50:1.
Met dezelfde N/P-waarde, samen met de toename van het aandeel van de APMA-keten, neemt de deeltjesgrootte van mBG/pDNA-polyplexen af. Deze resultaten geven aan dat APMA-keten inhoud toeneemt en guanidinylatie kan de deeltjesgrootte verminderen. De deeltjesgrootte en het oppervlakte potentieel maken het complex gemakkelijk te transporteren over het celmembraan en toepasbaar op transfectie. Gel elektroforese werd gebruikt om de relatie tussen complexvormer en n/p ratio te onderzoeken en de gegevens toonden aan dat de minimale n/p 4 is. Deze studie zal waardevolle basisgegevens opleveren voor verdere studie van kationische gendragers. Echter, BNHEMA-b-APMA is niet gemakkelijk afgebroken en het metabolisme proces in vivo is niet duidelijk genoeg. Daarom is klinische toepassing nog steeds een grote uitdaging voor cationische polymeer gendragers.
Hoge efficiëntie en lage toxiciteit van gendragers zijn de noodzakelijke voorwaarden voor hun klinisch gebruik. Cationische polymeer genvectoren hebben voordelen van goede stabiliteit en geen immunogeniciteit en kunnen gemakkelijk worden voorbereid en aangepast.
RAFT polymerisatie wordt veel gebruikt in de polymerisatie van monomeren, waaronder styreen, methacrylaat, acrylonitril en acrylamide. Dit soort polymerisatieproces kan op lage temperatuur worden uitgevoerd. Ook kan RAFT polymerisatie worden gebruikt voor het synthetiseren van polymeren van fijne structuren. RAFT polymerisatie beschreven in dit protocol wordt beschouwd als een van de meest veelbelovende mogelijke methoden voor de bereiding van biomedische polymeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met een financiële organisatie met betrekking tot het materiaal dat in dit artikel wordt besproken.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door het National Key Research and Development Program van China (No. 2016YFC0905900), National Natural Science Foundation of China (NOS. 81801827, 81872365), basis onderzoeksprogramma van Jiangsu Province (Natural Science Foundation, No. BK20181086), en het Jiangsu Cancer Hospital wetenschappelijk onderzoek Fonds (nr. ZK201605).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-hydroxybenzotriazole | Macklin Biochemical Co., Ltd,China | H810970 | ≥97.0% |
| 1,4-dioxane | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10008918 | AR |
| 1-amidinopyrazole Hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | A107935 | 98% |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | E106172 | AR |
| 4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) | Aladdin Co., Ltd., China | A106307 | Analytical reagent (AR) |
| 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid | Aladdin Co., Ltd., China | C132316 | >97%(HPLC) |
| Acetate | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 81014818 | AR |
| Acetone | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10000418 | AR |
| Agarose | Aladdin Co., Ltd., China | A118881 | High resolution |
| Ascorbic acid | Aladdin Co., Ltd., China | A103533 | AR |
| DMSO | Aladdin Co., Ltd., China | D103272 | AR |
| Ethylene glycol | Aladdin Co., Ltd., China | E103319 | AR |
| N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | N129096 | ≥98.0%(HPLC) |
| N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide | ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China | CF259748 | ≥98.0%(HPLC) |
| Ninhydrin | Aladdin Co., Ltd., China | N105629 | AR |
| PBS buffer | Aladdin Co., Ltd., China | P196986 | pH 7.4 |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | pDNA-EGFP | pDNA-EGFP |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | Pdna | pDNA |
| Sodium carbonate decahydrate | Aladdin Co., Ltd., China | S112589 | AR |
| Trimethylamine | Aladdin Co., Ltd., China | T103285 | AR |
References
- Flotte, T. R. Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead. Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).
- Huang, W., et al. Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).
- Wu, Y., et al. Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles. Colloids & Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).
- Quader, S., Kataoka, K. Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy. Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).
- Wu, Y., et al. Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR. Journal of Gene Medicine. 19, e2969 (2017).
- Szwarc, M. ‘Living’ Polymers. Nature. 178, 168-169 (1956).
- Szwarc, M., Rembaum, A. Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer. Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).
- Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. Living supramolecular polymerization. Science. 349, 241 (2015).
- Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization. European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).
- Wu, W., Wang, W., Li, J. Star polymers: Advances in biomedical applications. Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).
- Boyer, C., et al. Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications. Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).
- Keddie, D. J. A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization. Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).
- Wu, Y., et al. Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression. Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).
- Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).
- Friedman, M. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).
- Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).
- Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles. Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).
