Summary
Эта работа представляет собой подготовку метионина функционализированных биосовместимых блоков кополимеров (mBG) с помощью обратимого добавления фрагментации цепи передачи (RAFT) метод. Также были исследованы плазмидная способность ДНК-комплекса полученного mBG и их эффективность трансфекции. Метод RAFT очень полезен для полимеризации мономеров, содержащих специальные функциональные группы.
Abstract
Реверсивная полимеризация цепочки добавленной части (РАФТ) интегрирует преимущества радикальной полимеризации и живой полимеризации. Эта работа представляет собой подготовку метионина функционализированных биосовместимых блоков кополимеров через RAFT полимеризации. Во-первых, N,N-бис(2-гидроксиэтил)метакриламид-б -N-(3-аминопропил)метакриламид (BNHEMA -b-APMA, BA) синтезировался с помощью полимеризации RAFT с использованием 4,4'-azobis (4-цианалерическая кислота) (ACVA) в качестве ивитативным агентом и 4-цианпенпентановой кислотой дитиобензоат (CTP) в качестве агента передачи цепи. Впоследствии, N,N-bis(2-гидроксиэтил)метакриламид-б -N-(3-гуанидинопропил)метакриламид (метионин привитый BNHEMA -b-GPMA, mBG) был подготовлен путем изменения групп амина в APMA с метионином и гуанидином Группы. Для сравнения были синтезированы три вида блоковых полимеров: mBG1, mBG2 и mBG3. Для количественной оценки содержания APMA была использована реакция нингидрина; mBG1, mBG2 и mBG3 имели 21%, 37% и 52% APMA, соответственно. Результаты хроматографии гель-пермяки (GPC) показали, что БА-кополимеры обладают молекулярными весами 16 200 (BA1), 20 900 (BA2) и 27 200 (BA3) г/мол. Была также исследована плазмидная ДНК (pDNA), усложняющая способность полученных носителей гена блока. Коэффициенты заряда (N/P) были 8, 16 и 4, когда pDNA был полностью осложнен mBG1, mBG2, mBG3, соответственно. Когда соотношение N/P polyplexes mBG/pDNA было выше 1, потенциал Зэты мБГ был положительным. При соотношении N/P между 16 и 32 средний размер частиц полигекса mBG/pDNA составлял от 100 до 200 нм. В целом, эта работа иллюстрирует простой и удобный протокол для синтеза комимерии блока.
Introduction
В последние годы, генная терапия возникла для терапевтической доставки нуклеиновые кислоты в качестве лекарств для лечения всех видов заболеваний1. Развитие генных препаратов, включая плазмидную ДНК (pDNA) и малаюдическую интерферирующую РНК (siRNA), зависит от стабильности и эффективности системы доставки лекарств (DDS)2. Среди всех DDS, катионные полимерные носители имеют преимущества хорошей стабильности, низкой иммуногенности, и легкой подготовки и модификации, которые дают катионные полимерные носители широкие перспективы применения3,4. Для практического применения в биомедицине, исследователи должны найти катионный полимер перевозчика с высокой эффективностью, низкой токсичности, и хорошая способность ориентации5. Среди всех носителей полимеров блок кополимеры являются одной из наиболее широко используемых систем доставки лекарств. Блок кополимеров интенсивно изучаются на их свойство самосборки и способности формировать мицеллы, микросферы и наночастицы при доставке лекарств5. Блок кополимеров можно синтезировать с помощью живой полимеризации или нажмите методы химии.
В 1956 году Szwarc et al. подняли тему живой полимеризации,определив ее как реакцию без цепных реакций 6,7. С тех пор было разработано несколько методов синтеза полимеров с помощью этого метода; таким образом, живая полимеризация рассматривается как веха полимерной науки8. Димеризация жизни может быть классифицирована в живую анионическую полимеризацию, живую катионную полимеризацию и обратимую деактивацию радикальной полимеризации (РДРП)9. Живые анионические/катионные полимеризации имеют ограниченный объем применения из-за их строгих условий реакции10. Контролируемая/живая радикальная полимеризация (CRP) имеет мягкие условия реакции, удобное расположение, и хорошую урожайность и таким образом была главным фокусом исследования в недавних летах11. В CRP активные цепи распространения реверсивно переходят в спящие, чтобы уменьшить концентрацию свободных радикалов и избежать бимолекулярной реакции распространяющихся цепных радикалов. Крометое полимеризация может продолжаться только в том случае, если неактивные спящие цепи, распространяющиеся, обратимо анимируются на цепные радикалы. В качестве одной из наиболее перспективных форм живой радикальной полимеризации, обратимая добавка-фрагментация цепи передачи (RAFT) полимеризации является методом, применимым для выхода блок полимеров с контролируемым молекулярным весом и структурой, узкий молекулярный вес распределение и проведение функциональных групп12. Ключом к успешной полимеризации RAFT является эффект цепных переносных агентов, как правило, дитиостеров, которые обладают очень высокой константой передачи цепи.
В этой работе, метод полимеризации RAFT был разработан для подготовки BNHEMA -b-APMA блок полимера, принимая 4,4'-azobis (4-cyanovaleric кислоты) (ACVA) в качестве инициирующего агента и 4-цианоптановой кислоты дитиобензоат (CTP) в качестве агента передачи цепи. ПОЛимеризация RAFT дважды использовалась для внедрения BNHEMA в катионные полимерные носители. Впоследствии группы амина в цепи APMA были модифицированы с помощью метионина и гуанидинилового реагента 1-амидинопиразоле гидрохлорида. Благодаря использованию положительных зарядов гуанидинадинационного реагента и метакремламидного полимерного скелета структуры, была улучшена эффективность клеточного поглощения полученных блоков полимерных носителей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Синтез полимера BNHEMA (PBNHEMA)
- Растворите 1,87 г N, N-бис(2-гидроксиэтил) метакриламид (БНХЕМА) в 1 мл дистиллированной воды в полимерной бутылке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бутылка полимеризации представляет собой кругло-нижнюю колбу с резиновой пробкой и магнитным мешалкой. - Растворите 0,03 г 4-цианопентановой кислоты дитиобензоат (CtP) и 0,02 г 4,4'-азобис (4-cyanovalericacid ) (ACVA) в 0,5 мл 1,4-диоксана в 5 мл стакана. Затем добавьте раствор CTP и ACVA в бутылку полимеризации со ступени 1.1.
- Вентивная система реакции в полимеризации бутылки с азотом через три замораживания насоса оттепели циклов.
- Подробно заморозить раствор в полимеризации бутылки с помощью конденсата ловушку, исправить полимеризации бутылку железа опоры, и пылесосить и вводить азот в реакционную смесь через канал наконечником с иглой (#9 игла, внутренний диаметр 0,65 мм, внешнего диаметра 0,9 мм). Запечатать полимеризацию бутылки и разморозить раствор при комнатной температуре в течение 30 минут.
- Повторите циклы замораживания насоса-оттепели три раза.
- Положите бутылку полимеризации в масляную ванну 70 градусов по Цельсию и дайте раствору реагировать на 24 ч под атмосферой азота.
- Охладите бутылку полимеризации при 0 градусах по Цельсию и откройте резиновую пробку, чтобы завершить процесс полимеризации.
- Precool ацетон в холодильнике -20 градусов по Цельсию в течение 2 ч, а затем смешать его с реакционным раствором шага 1.5 на 50:1 (v/v). После этого, центрифуга на 8200 х г в течение 10 минут, чтобы удалить ацетон и собирать осадок.
- Для очищения синтезированного PBNHEMA, растворить собранный осадок в 2 мл чистой воды, а затем смешать его с 100 мл предварительно охлажденного ацетона, в соотношении 1:50 (v/v). Centrifuge раствор на 8200 х г в течение 10 минут и собирать осадок. Повторите этот процесс три раза.
- Высушите произведенный PBNHEMA с помощью вакуумной сушилки на 50 градусов Цельсия. После высыхать, взвесить порошок с балансом. Рассчитайте норму урожайности в соответствии с уравнением 1.
(1)
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте полученная доходность составила 77,2%.
(1)2. Синтез полимера BNHEMA-b-APMA (BA)
- Растворите 0,96 г N-(3-аминопропил)метакриламид гидрохлорид (APMA) и 0,93 г PBNHEMA в 5 мл дистиллированной воды в стакане 10 мл.
- Растворите 0,01 г 4,4'-азобис (4-цианалера(ACVA) в 0,5 мл 1,4-диоксана и смешайте с раствором APMA-PBNHEMA с части 2.1.
- Перенесите смесь в полимеризацию бутылки и проветрить сухим азотом на 1 ч.
- Положите бутылку полимеризации в масляную ванну 70 градусов и дайте ей реагировать на 24 ч под атмосферой азота.
- Охладите бутылку полимеризации при 0 градусах по Цельсию и откройте резиновую пробку, чтобы завершить процесс полимеризации.
- Перенесите раствор на охлажденный ацетон со ступени 1.6, а затем центрифугите раствор при 8200 х г в течение 10 минут, чтобы осаждать БА.
- Растворите БА в 2 мл дистиллированной воды и осажесли полимер в охлажденный ацетон. Повторите три раза.
- Высушите произведенный БА в вакуумной сушиле на 50 градусов и взвесьте полученный порошок. Рассчитайте норму урожайности в соответствии с уравнением 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте, доходность была рассчитана на 82,0%.
3. Определите процент родинки APMA в BA copolymer с помощью метода нингидрина
ПРИМЕЧАНИЕ: Спектрофотометрия используется для определения содержания многокомпонентных аминокислот. Принцип омрачить цветовую реакцию нингидрина и аминокислоты, где абсорбция коррелирует с содержанием аминокислот в определенной степени13,14.
- Растворите 5 г нингидрина в 125 мл кипящей дистиллированной воды. Кроме того, растворить 5 г витамина С в 250 мл теплой дистиллированной воды. Добавьте 250 мл раствора витамина С, капли в раствор нингидрина при магнитном перемешивании. Продолжайте перемешивать в течение 15 мин, а затем охладить раствор реакции в холодильнике 4 градусов по Цельсию.
- Возьмите раствор из холодильника и фильтр путем всасывания с помощью воронки Buchner для получения сниженного нингидрина. Соберите осадок и сохранить его в обезвоживатель фосфора пентоксида.
- Растворите 85 мг нингидрина и 15 мг пониженного нингидрина в 10 мл этилена гликолмоном монометилэфира для приготовления раствора нингидрин-окраски.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нингидрин-окраска решение может всмяиваться с а-амино в APMA и образуют фиолетовое соединение со структурой, как описано в предыдущем исследовании15. - Разбавить 1 мл 0, 1, 10, 100, 1000 мг/мл APMA мономерные растворы с 1 мл ацетатбуфера (2 М, рН 5,4), а затем добавить 1 мл нингидрина окраски решения, соответственно.
- Нагрейте смеси в течение 15 минут на кипящей водяной бане, а затем охладите их с помощью проточной воды. Пусть растворы сидят в течение 5-10 мин и разбавить их 3 мл 60% этилового спирта и тщательно перемешать. Измерьте абсорбцию на уровне 570 нм спомощью спектрофотометра и нарисуйте стандартную кривую (Equation 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Уравнение 3 было получено из линейной установки абсорбции на уровне 570 нм по сравнению с концентрацией APMA. - Растворите 0,01 г БА в 1 мл дистиллированной воды; добавьте 1 мл ацетатного буфера (2 M, pH 5.4) и 1 мл раствора нингидрин-окраски. Рассчитайте содержание моляров APMA в соответствии с абсорбцией на 570 нм.
(5)
ПРИМЕЧАНИЕ: Формулы расчета следующие(Уравнения 3-6).
(5)
4. Синтез метилонина привитых BA полимер (mBA)
- Растворите 8,9 мг фомк-метионина в 5 мл ДМСО в леродительную колбу.
- Добавьте 6,92 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорида (EDCl) и 4,86 мг 1-гидроксибензотриазота (HOBT) в лечебную колбу и реагируйте при 0 КК на 0,5 ч.
- Растворите 2,59 г БА в 5 мл раствора DMSO, а затем добавьте 50 л триметиламина; добавить это решение dropwise к восстановлению колбу (шаг 4.2) и пусть раствор реагирует на 0,5 ч при комнатной температуре.
- Диализ для удаления DMSO и триметиламина из раствора BA в шаге 4.3 с помощью диализа мешок (MWCO 10 kDa) в 2 L стакан для 24 ч; заменить деионизированную воду каждые 6 ч.
- Заморозить-сухой полученный mBA и взвешивать, чтобы рассчитать норму урожайности в соответствии с уравнением 7.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае, доходность была определена в 71%. - Количественно NH2, содержащий mBA, путем измерения абсорбции на 570 нм, чтобы вычислить количество привитого метионина. Рассчитайте содержание моляров в метионине в соответствии с уравнением 8.
5. Синтез гуанидинатизированного и метионина спряженный BNHEMA -b-APMA полимер (mBG)
ПРИМЕЧАНИЕ: Были синтезированы три различных mBA1, mBA2 и mBA3 copolymer. copolymer mBA3 используется в качестве примера в следующих шагах.
- Растворите mBA3, содержащий 60 змоль группы аминокислот в 5 мл чистой воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Содержание группы Amino было количественно с использованием метода нингидрина, как описано в шаге 3.5. - Растворите 40,6 мг (300 мкмоль) гуанидинадинационного реагента 1-амидинопиразоле гидрохлорид в растворах mBA.
- Отрегулируйте рН до 9.0 с насыщенным раствором карбоната натрия и дайте ему стабилизироваться в течение 24 ч при комнатной температуре.
- Диализ ный продукт с деионизированной водой с помощью диализа мешок в стакане (MWCO 10 kDa, 2 L) и сохранить его в виде лиофилизированного порошка.
Процент доходности был рассчитан на 85% через Equation 8.
(8) - Растворите порошок mBG в D2O в трубках ЯМР и охарактеризуют его с помощью 1H ядерной магнитно-резонансной спектроскопии (1H NMr)16.
(8)6. Подготовка и характеристика полиппексов мБГ/pDNA
- Растворите 50 мкг pDNA в 50 Л без RNase/DNase воды.
- Растворите 1 мг copolymers mBG в 1 мл безрычании RNase/DNase.
- Добавьте раствор copolymers mBG непосредственно в раствор pDNA в соответствии с различными соотношениями кормления, то есть различными соотношениями N/P (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 и 32:1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение N/P определяется как соотношение моляров группы гуанидин овполий и фосфатной группы в pDNA, а именно соотношение моляров цепи GPMA в полимере и мононуклеотида в pDNA. Соотношение N/P рассчитывается в соответствии с молекулярными весами аминоазота (N) в mBG и фосфатной группе (P) в pDNA. - Смешайте растворы с вихревой смеситель и дайте им постоять 30 минут при комнатной температуре. После этого рассеять смесь в фосфатном буферном растворе (PBS, pH 7.4) и сохранить полученные полиптексы mBG/pDNA при 4 градусах По Цельсия для последующих экспериментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Средний размер частиц и потенциал Зета mBG и комплексы были обнаружены с помощью динамического рассеяния света (DLS)17. - Разбавить 10 л из растворов полиппека mBG/pDNA с 1 мл PBS (pH 7.4) в потенциальных образцовых клетках DLS и Зета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер частиц и потенциальное обнаружение Зеты выполнялись три раза, и в среднем было принято три значения.
7. Эксперимент по электрофоретической отсталости полиппексов mBG/pDNA
ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения минимального коэффициента заряда был проведен эксперимент по электрофоретической отсталости.
- Возьмем пять групп полиптексов mBG/pDNA с различными соотношениями N/P (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 и 32:1), содержащих 50 мкг pDNA .
- Добавьте 6x буфер загрузки к пробам polyplex mBG/pDNA к окончательной концентрации 1x.
- Добавьте растворы в 1,5% гели агарозы и запустите гель на 90 мВ в течение 15 мин, используя pDNA в качестве контроля.
- Сфотографируйте гели с помощью геля изображения.
8. Цитотоксичность полиппексов mBG/pDNA
- Семена MCF-7 в 96-колодцы пластин при плотности 104 клеток на скважину. Затем, культуры клеток для 12 ч с использованием DMEM среды (10% FBS и 1% антибиотик) в увлажненный 37 КС инкубатор поставляется с 5% CO2.
- Замените среду культуры с антибиотиками-свободно средствами культуры DMEM содержа 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и polyplexes mBG/pDNA по-разному коэффициентов обязанности (N/P 4, 8, 16, и 32, n'6) для 6 h, принимая клетки добавленные с равными томами разрешения PBS как управление. Затем замените культурную среду 150 qL свежих 1640 средних и далее культуры клеток для 24 ч.
- Добавьте 5 мг/мЛ 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилдетразолий бромид (МТТ) раствор (20 л/колодец) к 96-колодским пластинам и далее культуре клеток в течение 4 ч.
- Снимите раствор и добавьте 150 л DMSO к каждой скважине и встряхните 96-колодские пластины 30 сек.
- Измерьте оптическую плотность (OD) на уровне 490 нм с помощью микроплитного считывателя, чтобы показать жизнеспособность клетки. Рассчитайте процент жизнеспособности клеток в соответствии с уравнением 9.
Жизнеспособность клеток
% (9)
% (9)9. Эффективность трансфекции полиппексов mBG/GFP-pDNA
- Растворите 50 мкг pDNA, содержащего репортёрский ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) pDNA (GFP-pDNA) в 50 Л воды без RNase/DNase. Затем растворите 1 мг мг мг мг copolymers mBG в 1 мл воды без RNase/DNase. Смешайте раствор pDNA и mBG при соотношении заряда (N/P) 1:1, 4:1, 8:1, 16:1 и 32:1 и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре. Разогнать раствор полипрексm mBG/GFP-pDNA с помощью ультразвуковых волн (30 с) и хранить при 4 градусах Цельсия для последующих экспериментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение N/P рассчитывается в соответствии с молекулярными весами аминоазота (N) в mBG и фосфатной группе (P) в pDNA. - Семена MCF-7 клеток при плотности 2 и 105 клеток на хорошо в 6-хорошо пластины и культуры их на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 в увлажненный инкубатор для 12 ч.
- Замените культурную среду на свежую культурную среду, содержащую полиппексы mBG/GFP-pDNA различных соотношений N/P (4, 8, 16 и 32) на 6 ч.
- Замените среду на 2 мл свежей среды RPMI1640 и культуры на 48 ч.
- Соберите клетки и обнаружить зеленую флуоресценцию с цитометром потока.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
БНЕХЕМА кормили в соответствии с объективной степенью полимеризации, показанной в таблице1; процедура синтеза mBG показана на рисунке 1. Во-первых, гомополимер BNHEMA был подготовлен с помощью обратимого добавления фрагментации цепи передачи (RAFT) метод в системе водного диоксана, используя 4-цианпентановой кислоты дитиобензоат в качестве агента передачи цепи. Во-вторых, PBNHEMA использовался в качестве цепного агента для подготовки полимера блока BNHEMA -b-APMA. APMA мономер кормили в соответствии с объективной степенью полимеризации показано в таблице 1. Гель пермяционная хроматография (ГПК) была проведена для обнаружения молекулярного веса БА с различными соотношениями кормления(таблица 1). Фактическое содержание моляров в цепочках APMA в BA с различными коэффициентами кормления было обнаружено с помощью метода нингидрина(таблица 1). Согласно нашему предыдущему исследованию5, мы использовали mBG3 в настоящем исследовании, потому что он имеет самый высокий содержание APMA. Наконец, метионин был привит в цепи APMA и остаточные группы амина были полностью guanidinylated для подготовки mBG. Рисунок 2 - это данные 1H NMR mBG. Средний размер частиц и потенциал Зеты пополипрексм мБГ/pDNA составляли 124 нм и 15,7 мВ, соответственно, при соотношении N/P 16(рисунок 3).
Электрофоретическая отсталость является быстрым и простым методом, который включает в себя разделение несвязанных pDNA и copolymer / pDNA полипрекс на основе различий в их электрофоретической мобилизации в гели агарозы. Несвязанная полоса pDNA может перемещаться в геле агарозы под действием электрического поля. В эксперименте электрофоретической отсталости(рисунок4), pDNA (с коэффициентом N/P 0) может двигаться без ограничения в геле агарозы и наблюдался как полоса в геле. Когда pDNA комплексируется с mBG, движение pDNA тормозится, и впоследствии яркость полосы уменьшается. Рисунок 4 показывает, что mBG может полностью осложнить pDNA, когда N/P выше 4.
Цитотоксичность полипрекс mBG/pDNA измерялась с помощью стандартного анализа МТТ(рисунок 5). Результаты показывают, что polyplexs mBG/pDNA имеют очевидно более низкую цитотоксичность, чем полипрексы PEI/pDNA при соотношении N/P 4, 8, 16 и 32 в линии клеток MCF-7 (p'lt;0.05, n'3, односторонней ANOVA). Кроме того, цитотоксичность полиппексов mBG/pDNA увеличивается с увеличением соотношения N/P. Увеличение цитотоксичности полиптексов mBG/pDNA с повышенным N/P является результатом положительно заряженного компонента GPMA. polyplexes mBG/pDNA показали меньшую цитотоксичность, чем полиппексы PEI/pDNA, что может быть связано с наличием BNHEMA в кополимерах, защищающих поверхностный заряд катионных полимеров.
Соотношение N/P, используемое в эксперименте трансфекции pDNA, было выбрано в соответствии с результатами цитотоксичности. Как показано на рисунке 6, трансфекционные способности mBG1, mBG2 и mBG3 были сопоставлены путем измерения интенсивности флуоресценции GFP и результаты показали, что mBG3 является оптимальным носителем генов. Хотя полиплаксы PEI/pDNA с соотношением N/P 8 имеют аналогичную эффективность трансфекции, как и полиппексы mBG3/pDNA с соотношением N/P 32, PEI имеет более высокую цитотоксичность и не имеет таких функций, как загрузка лекарств, что ограничивает его применение в биомедицинской области. Результаты показали, что увеличение содержания АМРА является ключом к повышению эффективности трансфекции mBG copolymer. Как мы уже упоминали в предыдущем исследовании5, клеток проникающих пептидов (CPPs) являются 9-35 мер катионных или амфипатических пептидов с возможностью проникать в клеточной мембране. Гуанидин группа катионных CPP, которые могут быть спряжены в полимер для повышения трансфекции полимера / pDNA полипрекс через белок-независимых трансмембранного пути. Таким образом, mBG copolymer интегрирует преимущества, связанные с группами гуанидина для проникновения клеток и компонентом BNHEMA для защиты, показывая большой потенциал для эффективной доставки генов.
| Образец | BHEMA -b-APMA | Мвт | Pdi | |
| Теоретическая ценность контента APMA (%) | Фактическая стоимость контента APMA (%) | |||
| БНЕМА90-б-APMA30(BA1) | 25% | 21% | 16200 | 1.25 |
| БНЕМА90-б-APMA60(BA2) | 40% | 37% | 20900 | 1.21 |
| БНЕМА90-б-АПМА90(BA3) | 50% | 52% | 27200 | 1.25 |
Таблица 1: Состав BNHEMA -b-APMA по полимеризации RAFT.
Рисунок 1: Процедура схематического синтеза mBG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: 1H NMR спектра mBG в D2O. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Размер частиц и потенциал Зеты полипрексов.
(A) Размер частиц BA/pDNA. (B) Размер частиц mBG/pDNA. (C) Зета потенциал BA / pDNA. (D) Зета потенциал mBG / pDNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Агаросе гель электрофорез изображения BA3
(a) , mBA3(b) и mBG3 (c) полипрексы при различных коэффициентах заряда.
Рисунок 5: Цитотоксичность полиптексов mBG/pDNA при различном соотношении N/P в линии клеток MCF7.
В качестве элемента контроля использовался полипрекс PEI/pDNA. Данные были показаны как средние SD (n'3). - указывает на p'lt;0.05 по сравнению с группой PEI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Эффективность трансфекции полиптексов mBG/pDNA при соотношении N/P 4, 8, 16 и 32 измерялась цитометром потока.
Данные были показаны как средние SD (n'3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это исследование представило серию BNHEMA-b-APMA блок полимерных катионных носителей генов. Эти блок-полимеры были синтезированы с помощью метода реверсивной передачи цепочек добавления (RAFT). Гидрофильный сегмент BNHEMA был введен для улучшения растворимости. Метилонин и гуанидин группы были изменены для улучшения целевой способности и трансфекции эффективность5. Содержание цепи APMA увеличилось, и гуанидинилация в мБГ кополимер еуменьшила размер частиц полиптекса mBG/pDNA. Размер частиц и поверхностный потенциал облегчают поперек клеточной мембраны и применимы к трансфекции. Критические моменты эксперимента заключаются в строгом контроле молярового соотношения мономера BNHEMA и CTP к 45:1, молярного соотношения CTP и ACVA до 2:1, а температуры до 70 градусов по Цельсию. В процессе очистки соотношение объема предварительно охлажденных ацетона и полимерного раствора должно быть выше 50:1.
При том же значении N/P, наряду с увеличением доли цепи APMA, размер частиц полигексм mBG/pDNA уменьшается. Эти результаты показывают, что содержание цепи APMA увеличивается и гуанидиниловация может уменьшить размер частицы. Размер частиц и поверхностный потенциал облегчают перенос через клеточную мембрану и применимы к трансфекции. Гель электрофорез был использован для исследования взаимосвязи между комплексом и N / P соотношение и данные показали, что минимальный N / P составляет 4. Это исследование предоставит ценные базовые данные для дальнейшего изучения катионных носителей генов. Тем не менее,BNHEMA- b-APMA не легко деградирует и его метаболизм процесс in vivo не достаточно ясно. Таким образом, клиническое применение по-прежнему является большой проблемой для носителей генов катионов.
Высокая эффективность и низкая токсичность носителей генов являются необходимыми условиями для их клинического использования. Киционные переносчики генов полимеров обладают преимуществами хорошей стабильности и иммуногенности, и их можно легко подготовить и модифицировать.
Полимеризация RAFT широко используется в полимеризации мономеров, включая стирол, метакрилат, акрилонитрил и акриламид. Этот вид процесса полимеризации может осуществляться при низкой температуре. Кроме того, полимеризация RAFT может быть использована для синтеза полимеров тонких структур. Полимеризация RAFT, описанная в данном протоколе, считается одним из наиболее перспективных потенциальных методов подготовки биомедицинских полимеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы удостоверяем, что нет никакого конфликта интересов с какой-либо финансовой организацией в отношении материала, обсуждаемого в этой статье.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (No 2016YFC0905900), Национальным фондом естественных наук Китая (No 81801827, 81872365), Программой фундаментальных исследований провинции Цзянсу (Фонд естественных наук, No. BK20181086), и Цзянсу онкологический госпиталь Научно-исследовательский фонд (Нет. К201605).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-hydroxybenzotriazole | Macklin Biochemical Co., Ltd,China | H810970 | ≥97.0% |
| 1,4-dioxane | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10008918 | AR |
| 1-amidinopyrazole Hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | A107935 | 98% |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | E106172 | AR |
| 4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) | Aladdin Co., Ltd., China | A106307 | Analytical reagent (AR) |
| 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid | Aladdin Co., Ltd., China | C132316 | >97%(HPLC) |
| Acetate | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 81014818 | AR |
| Acetone | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10000418 | AR |
| Agarose | Aladdin Co., Ltd., China | A118881 | High resolution |
| Ascorbic acid | Aladdin Co., Ltd., China | A103533 | AR |
| DMSO | Aladdin Co., Ltd., China | D103272 | AR |
| Ethylene glycol | Aladdin Co., Ltd., China | E103319 | AR |
| N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | N129096 | ≥98.0%(HPLC) |
| N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide | ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China | CF259748 | ≥98.0%(HPLC) |
| Ninhydrin | Aladdin Co., Ltd., China | N105629 | AR |
| PBS buffer | Aladdin Co., Ltd., China | P196986 | pH 7.4 |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | pDNA-EGFP | pDNA-EGFP |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | Pdna | pDNA |
| Sodium carbonate decahydrate | Aladdin Co., Ltd., China | S112589 | AR |
| Trimethylamine | Aladdin Co., Ltd., China | T103285 | AR |
References
- Flotte, T. R. Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead. Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).
- Huang, W., et al. Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).
- Wu, Y., et al. Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles. Colloids & Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).
- Quader, S., Kataoka, K. Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy. Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).
- Wu, Y., et al. Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR. Journal of Gene Medicine. 19, e2969 (2017).
- Szwarc, M. ‘Living’ Polymers. Nature. 178, 168-169 (1956).
- Szwarc, M., Rembaum, A. Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer. Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).
- Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. Living supramolecular polymerization. Science. 349, 241 (2015).
- Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization. European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).
- Wu, W., Wang, W., Li, J. Star polymers: Advances in biomedical applications. Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).
- Boyer, C., et al. Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications. Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).
- Keddie, D. J. A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization. Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).
- Wu, Y., et al. Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression. Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).
- Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).
- Friedman, M. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).
- Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).
- Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles. Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).
