Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Hedeflenen Plasmid DNA teslim için metiyonin functionalized biyouyumlu blok kopolimerler

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/58527
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 2, 3, 1, 2
1Research Center of Clinical Oncology, Jiangsu Cancer Hospital & Jiangsu Institute of Cancer Research & Nanjing Medical University Affiliated Cancer Hospital, 2Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 3School of Clinical Medicine, Xuzhou Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Bu çalışma, geri dönüşümlü ek-parçalanma zinciri transferi (RAFT) yöntemi ile metiyonin functionalized biyouyumlu blok kopolimerler (mBG) hazırlanması sunar. Elde edilen mBG 'nin plazmid DNA 'Sı karmaşıklığı ve transfeksiyon verimliliği de incelenmiştir. Raft yöntemi, özel fonksiyonel gruplar içeren polimerleştirici monomerlerin için çok yararlıdır.

Abstract

Ters dönüşümlü ek-parçalanma zinciri transferi (RAFT) polimerizasyon radikal polimerizasyon ve yaşam polimerizasyonu avantajlarını birleştirir. Bu çalışma RAFT polimerizasyonu ile metionin functionalized biyouyumlu blok kopolimerler hazırlanması sunar. Öncelikle, n, n-bis(2-hidroksiilil) metakrilamid-b-n-(3-AMINOPROTRANSL) metakrilamid (BNHEMA-b-apma, ba), 4, 4 '-AZOBIS (4-SIYANOVALERIK asit) (Acva) kullanarak Raft polimerizasyonu ile sentezlenmiş Aracı ve 4-cyanopentanoik asit dithiobenzoate (CTP) zincir transfer ajanı olarak başlatılıyor. Daha sonra, n, n-bis(2-hidroksiil) metakrilamid-b-n-(3-guanidinoprog) methacrylamid (metiyonin gredyle bnhema-b-gpma, MBG), apma 'daki Amin gruplarını metiyonin ve guanidin ile değiştirerek hazırlanmıştır. Grup. Üç çeşit blok polimerleri, mBG1, mBG2 ve mBG3 karşılaştırılması için sentezlenmiş. APMA içeriğini ölçmek için bir ninhidrin reaksiyonu kullanıldı; mBG1, mBG2 ve mBG3 sırasıyla APMA% 21, 37% ve 52% vardı. Jel geçirgenlik Kromatografi (GPC) sonuçları, BA kopolimerlerin 16.200 molekül ağırlıklarına (BA1), 20900 (BA2) ve 27200 (BA3) g/mol 'e sahip olduğunu göstermiştir. Elde edilen blok kopolimer gen taşıyıcıların Plasmid DNA (pDNA) karmaşıklığı da incelenmiştir. PDNA sırasıyla mBG1, mBG2, mBG3 ile tamamen karmaşıkken şarj oranları (N/P) 8, 16 ve 4 idi. MBG/pDNA polyplexes N/P oranı 1 ' den yüksek olduğunda, mBG Zeta potansiyeli pozitif oldu. 16 ile 32 arasında bir N/P oranı, mBG/pDNA polyplexes ortalama parçacık boyutu 100-200 Nm arasındadır. Genel olarak, bu çalışma blok kopolimer taşıyıcı sentezi için basit ve kullanışlı bir protokol göstermektedir.

Introduction

Son yıllarda, her türlü hastalıkları tedavi etmek için ilaç olarak nüklütik asitlerin terapötik teslim edilmesi için gen terapisi ortaya çıkmıştır1. Plasmid DNA (pDNA) ve küçük müdahale RNA (siRNA) dahil gen ilaçların geliştirilmesi, ilaç teslim sistemi (DDS)2' nin stabilitesi ve verimliliğine dayanır. Tüm DDS arasında, cationıc polimer taşıyıcılar iyi stabilite avantajları vardır, düşük immünogenisite, ve facile hazırlama ve modifikasyon, hangi katort polimer taşıyıcılar geniş uygulama umutları vermek3,4. Biyolojik olarak pratik uygulamalar için, araştırmacılar yüksek verimlilik, düşük toksisite ve iyi hedefleme yeteneği5ile bir katyonik polimer taşıyıcı bulmak zorundadır. Tüm polimer taşıyıcılar arasında blok kopolimerler en yaygın olarak kullanılan ilaç teslim sistemlerinden biridir. Blok kopolimerler yoğun kendi kendi kendine montaj özelliği ve yetenekleri micelles, microspheres ve ilaç teslim5nanopartiküller oluşturmak için incelenmiştir. Blok kopolimerler yaşam polimerizasyonu veya tıklama Kimya yöntemleri ile sentezlenmiş olabilir.

1956 yılında, Szwarc ve al. canlı polimerizasyon konusunu kaldırdı, zincir kırma reaksiyonları olmadan bir reaksiyon olarak tanımlayarak6,7. O zamandan beri, bu yöntemi kullanarak polimerleri sentezlemek için birden fazla teknik geliştirilmiştir; Böylece, yaşayan polimerizasyon Polimer bilim bir kilometre taşı olarak görülebilir8. Yaşayan polimerizasyon yaşam anyonik polimerizasyon, yaşam katyonik polimerizasyon ve geri dönüşümlü deaktivasyon radikal polimerizasyon (RDRP)9sınıflandırılabilir. Yaşayan anyonik/katyonik polimerizasyon, sıkı reaksiyon koşulları nedeniyle sınırlı bir uygulama kapsamına sahiptir10. Kontrollü/yaşayan radikal polimerizasyon (CRP) hafif reaksiyon koşulları, uygun eğilim ve iyi verim ve böylece son yıllarda büyük bir araştırma odağı olmuştur11. CRP 'de, aktif yayılma zincirleri, serbest radikallerin konsantrasyonunu azaltmak ve zincir radikallerinin yayılmasının bimoleküler reaksiyonu önlemek için uyuyan olanlara geri döndürülebilir. Ek polimerizasyon, yalnızca aktif olmayan uyuyan yayılma zincirleri ters şekilde zincir radikallerine animasyonsa devam edebilir. Radikal polimerizasyon yaşayan en umut verici formlardan biri olarak, geri dönüşümlü ek-parçalanma zinciri transferi (RAFT) polimerizasyon kontrollü molekül ağırlığı ve yapısı ile blok polimerleri verim için uygulanabilir bir yöntemdir, dar moleküler ağırlık Dağıtım ve fonksiyonel gruplar12taşıma. Başarılı RAFT polimerizasyonu için anahtar zincir transfer ajanları etkisi, genellikle çok yüksek zincir transfer sabiti sahip dithioesters.

Bu yazıda, bir sal polimerizasyon yöntemi, bir başlatıcı ajan olarak 4, 4 '-azobis (4-cyanovaleric acid) (ACVA) ve zincir transfer ajanı olarak 4-cyanopentanoik asit dithiobenzoat (CTP) alarak BNHEMA-b-apma blok polimer hazırlamak için tasarlanmıştır. Raft polimerizasyon iki kez bnhema 'ya katyonik polimer taşıyıcıları tanıtmak için kullanıldı. Daha sonra, APMA zincirindeki Amin grupları metiyonin ve guanidinilasyon reaktifinin 1-amidinopyrazol hidroklorür ile değiştirildi. Guanidinilasyon reakajının ve metakrilamid polimer iskelet yapısının pozitif ücretlerinin kullanımı, elde edilen blok polimer taşıyıcıların hücresel Alım verimliliği iyileştirildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. BNHEMA polimer sentezi (PBNHEMA)

  1. Polimerizasyon şişesinde 1 mL distile suyunda 1,87 g , n-bis(2-hidroksiil) METAKRILAMID (bnhema) çözülür.
    Not: polimerizasyon şişesi, kauçuk stoper ve manyetik karıştırıcı ile yuvarlak alt Flask olduğunu.
  2. 4-cyanopentanoik asit dithiobenzoat (CTP) ve 0,02 g 4, 4 '-azobis (4-cyanovalericacid) (ACVA) 0,03 g, 5 mL 'Lik bir Beaker 'da 1, 4-dioxane, 0,5 mL çözülür. Ardından, CTP ve ACVA çözeltisi adım 1,1 polimerizasyon şişesine ekleyin.
  3. Üç donma-pompa-çözme döngüsü yoluyla azot ile polimerizasyon şişesinde reaksiyon sistemini havalandırın.
    1. Ayrıntılı olarak, bir kondens tuzağı kullanarak polimerizasyon şişesinde solüsyonu dondurmak, demir desteğine polimerizasyon şişesini düzeltin ve iğne ile uçlu bir boru ile reaksiyon karışımına azot enjekte et (#9 iğne, iç çapı 0,65 mm, dış çapı 0,9 mm). Polimerizasyon şişesini mühürleyin ve solüsyonu oda sıcaklığında 30 dakika çözün.
    2. Donma pompası çözme döngülerini üç kez tekrarlayın.
  4. Polimerizasyon şişesini 70 °C ' lik yağ banyosuna koyun ve çözeltinin nitrojen atmosferinin altında 24 saat tepki vermesini sağlar.
  5. Polimerizasyon şişesini 0 °C ' de soğutur ve polimerizasyon sürecini sonlandırmak için kauçuk stoper açın.
  6. 2 h için bir-20 °C buzdolabında precool aseton ve sonra 50:1 (v/v) adım 1,5 reaksiyon çözeltisi ile karıştırın. Bundan sonra, 10 dk için 8.200 x g santrifüjün aseton kaldırmak ve çökelme toplamak.
  7. Sentezlenmiş PBNHEMA arındırmak için, toplanan çökeltiye 2 mL saf su içinde çözülür ve sonra 1:50 (v/v) oranında, 100 mL presoğutmalı aseton ile karıştırın. Solüsyonu 10 dakika 8.200 x g 'de santrifüjle toplayın ve çökelme topla. Bu işlemi üç kez tekrarlayın.
  8. 50 °C vakum kurutıcısı kullanarak üretilen PBNHEMA 'nın kurutun. Kurutulmuş bir kez, bir denge ile toz tartın. Denklemi 1 ' e göre verim hızını hesaplayın.
    Equation 11
    Not: Bu deneyde elde edilen verim% 77,2 idi.

2. BNHEMA-b-apma polimer sentezi (BA)

  1. 10 mL 'Lik bir Beaker içinde 5 mL distile su içinde N-(3-aminoprotransl) metakrilamid hidroklorür (apma) ve 0,93 g PBNHEMA 0,96 g çözülür.
  2. 1, 4-dioxane 0,5 mL 'de 4, 4 '-azobis (4-cyanovaleric asit) (ACVA) 0,01 g çözülür ve Bölüm 2,1 APMA-PBNHEMA çözeltisi ile karıştırın.
  3. Karışımı bir polimerizasyon şişesine aktarın ve 1 saat boyunca kuru nitrojen ile havalandırın.
  4. Polimerizasyon şişesini 70 °C ' lik yağ banyosuna koyun ve nitrojen atmosferinin altında 24 saat tepki gösterelim.
  5. Polimerizasyon şişesini 0 °C ' de soğutur ve polimerizasyon sürecini sonlandırmak için kauçuk stoper açın.
  6. Adım 1,6 soğutulmuş aseton için çözüm transferi ve sonra 10 dakika için 8.200 x g çözüm SANTRIFÜJLE ba çökeltmek için.
  7. BA 'yı 2 mL distile su içinde eritin ve soğutulmuş aseton içinde polimeri çökeltir. Üç kez tekrarlayın.
  8. Üretilen BA 'yı 50 °C ' lik vakum kurutıcısı ile kurutun ve elde edilen tozu tartın. Denklemi 2' ye göre verim hızını hesaplayın.
    Equation 2
    Not: Bu denemede, verim oranı% 82,0 olarak hesaplanır.

3. BA kopolimer içinde ninhidrin yöntemi ile APMA 'nın mol yüzdesini belirleyin

Not: spektrofotometri çok bileşenli amino asitlerin içeriğini belirlemek için kullanılır. Prensip olarak, emilikte amino asit içeriği ile ilişkili olduğu ninhidrin ve amino asitin renk reaksiyonu13,14.

  1. 125 mL kaynar damıtılmış su içinde ninhidrin 5 gr çözülür. Ayrıca, sıcak distile su 250 mL 'de C vitamini 5 g çözülür. Manyetik karıştırma altında ninhidrin solüsyona dropwise C vitamini çözeltisi 250 mL ekleyin. 15 dakika boyunca karıştırın ve sonra 4 °C buzdolabında reaksiyon solüsyonu Chill devam edin.
  2. Buzdolabından çözüm alın ve azaltılmış ninhidrin elde etmek için bir Buchner hunisi kullanarak emiş tarafından filtre. Çökeltmek toplamak ve bir fosfor pentoksit kurutucu içinde korumak.
  3. Çözülen 85 mg ninhidrin ve 15 mg azaltılmış ninhidrin 10 mL etilen glikol monomoetil eter içinde ninhidin-boyama çözeltisi hazırlamak için.
    Not: Ninhidin-boyama solüsyonu APMA 'da α-amino ile reaksiyon verebilir ve bir önceki çalışmada15' te açıklandığı gibi bir yapıya sahip bir menekşe bileşiği oluşturur.
  4. Seyreltici 1 mL 0, 1, 10, 100, 1.000 mg/mL APMA monomer çözeltileri 1 mL asetat tampon (2 M, pH 5,4), ve ardından 1 mL ninhidin-boyama solüsyonu ekleyin, sırasıyla.
  5. Bir kaynar su banyosunda 15 dakika için karışımları ısı ve sonra su çalışan kullanarak serin. Çözümler 5-10 dk oturmak ve 3 mL% 60 etil alkol ile seyreltmeli ve iyice karıştırın edelim. Bir spektrofotometre kullanarak 570 nm 'de emici ölçün ve standart eğri (Denklem 3) çizin.
    Equation 3
    Not: Denklem 3, 570 nm 'de APMA konsantrasyonuna karşı emilme doğrusal bağlantı öğesinden türetilmiştir.
  6. 1 mL damıtılmış suda 0,01 g BA çözülür; 1 ml asetat tamponu (2 M, pH 5,4) ve 1 mL ninhidrin boyama çözeltisi ekleyin. 570 nm de emici göre APMA molar içeriğini hesaplayın.
    Equation 4
    Equation 55
    Equation 6
    Not: hesaplama formülleri aşağıdaki gibidir (denklemler 3-6).

4. metiyonin grepi BA polimer sentezi (mBA)

  1. Çözülür 8,9 mg FOMC-Methionine 5 mL DMSO bir iyileşme Flask.
  2. Ekleme 6,92 mg 1-etil-3-(3-dimetylaminopropil) kardiimid hidroklorür (EDCl) ve 4,86 mg 1-hidroxybenzotriazol (HOBT) kurtarma Flask ve tepki 0 °C için 0,5 h.
  3. 5 mL DMSO çözeltisi içinde BA 2,59 g çözülür ve sonra 50 μL trimetilamin ekleyin; Kurtarma Flask bu çözüm dropwise ekleyin (adım 4,2) ve çözüm oda sıcaklığında 0,5 h için tepki izin.
  4. Dialyze bir diyaliz çantası (mwco 10 kDa) 24 saat için 2 L kabı kullanarak adım 4,3 ba çözümden DMSO ve trimetilamin kaldırmak için; her 6 saat deiyonize su yerine.
  5. Elde edilen mBA 'nin donma-kurumasını yapın ve denklem 7' ye göre verim oranını hesaplamak için tartın.
    Equation 7
    Not: Bu durumda, verim oranı% 71 olarak belirlendi.
  6. 570 nm 'de emilen metiyonin miktarını hesaplamak için emilme ölçmek suretiyle mBA içeren NH2 ' nin ölçülmesi. Denklem 8' e göre metiyoninin molar içeriğini hesaplayın.
    Equation 8

5. guanidinated ve metiyonin konjudik BNHEMA-b-apma polimer sentezi (MBG)

Not: üç farklı mBA1, mBA2 ve mBA3 kopolimer sentezlenmiş. mBA3 kopolimer aşağıdaki adımlarda örnek olarak kullanılır.

  1. 5 mL saf suda 60 μmol amino grup içeren mBA3 çözülür.
    Not: amino grup içeriği 3,5 adımda açıklandığı gibi ninhidrin yöntemi kullanılarak niceleyilmiş.
  2. MBA çözümlerinde guanidinilasyon reaktifinde 1-amidinopyrazol hidroklorür 40,6 mg (300 μmol) çözülür.
  3. Sodyum karbonat doymuş çözeltisi ile 9,0 pH ayarlayın ve oda sıcaklığında 24 saat için stabilize edelim.
  4. MBG ürününü deiyonize su ile bir kabı içinde diyaliz çantası kullanarak (mwco 10 kDa, 2 L) Dialyze ve dondurmalı toz şeklinde koruyun.
    Verim yüzdesi denklem 8ile% 85 olarak hesaplanır.
    Equation 98
  5. NMR tüpleri D2O MBG tozu çözülür ve 1h nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (1h NMR)16kullanarak karakterize.

6. mBG/pDNA polyplexes hazırlama ve karakterizasyonu

  1. 50 μL RNase/DNase-serbest su içinde 50 μg pDNA çözülür.
  2. 1 mL RNase/DNase içermeyen su içinde 1 mg mBG kopolimer çözülür.
  3. MBG kopolimerler çözümünü, farklı besleme oranlarına göre doğrudan pDNA çözümüne ekleyin, yani farklı N/P oranları (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 ve 32:1).
    Not: N/P oranı, polimerde guanidin grubunun molar oranı ve pdna 'daki fosfat grubunda, yani polimer içinde gpma zincirinin molar oranı ve pdna 'daki mononükleotid olarak tanımlanır. N/P oranı, mBG 'de amino nitrojen (N) molekül ağırlıklarına ve pDNA 'daki fosfat grubunda (P) göre hesaplanır.
  4. Çözeltileri bir Vortex karıştırıcı ile karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika durmalarına izin verin. Bundan sonra, fosfat tampon çözeltisi (PBS, pH 7,4) karışımı dağıtmak ve takip denemeleri için 4 °C ' de elde edilen mBG/pDNA polyplexes korumak.
    Not: mBG ve kompleksleri ortalama parçacık boyutu ve Zeta potansiyeli dinamik ışık saçılma (DLS)17kullanılarak tespit edildi.
  5. DLS ve Zeta olası örnek hücrelerinde 1 mL PBS (pH 7,4) ile mBG/pDNA Polyplex çözümleri 10 μL seyreltmeli.
    Not: parçacık boyutu ve Zeta potansiyel algılama üç kez gerçekleştirilen ve üç değerin ortalama alınmıştır.

7. mBG/pDNA polyplexes elektroforetik retardasyon deneyi

Not: minimum şarj oranını belirlemek için elektroforetik bir gerilme deneyi yapılmıştır.

  1. MBG/pDNA polyplexes farklı N/P oranları (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 ve 32:1) içeren beş grup pDNA 50 μg alın.
  2. 6x yükleme arabelleği mBG/pDNA Polyplex örneklerine 1x son konsantrasyonuna ekleyin.
  3. Çözümler ekleyin 1,5% agaroz jelleri ve 90 MV at jel çalıştırmak 15 dakika, kontrol olarak pdna kullanarak.
  4. Jel görüntüleştirici kullanarak jellerin fotoğraflarını çekin.

8. mBG/pDNA polyplexes sitotoksisitesi

  1. Seed MCF-7 hücreler içine 96-kuyu plakaları bir yoğunlukta 104 hücreler başına iyi. Daha sonra,% 5 CO2ile sağlanan bir nemlendirilmiş 37 °c ' lik inkükote dmem Orta (% 10 FBS ve% 1 antibiyotik) kullanarak 12 h için hücreler kültür.
  2. Kültür ortamını, 6 h için% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve mBG/pDNA polyplexes (N/P 4, 8, 16, ve 32, n = 6) içeren antibiyotik içermeyen DMEM kültür medyası ile değiştirin, kontrol olarak PBS çözeltisi eşit hacimlerle eklenen hücreleri alarak. Daha sonra, kültür ortamını 150 μL taze 1640 orta ve daha fazla kültür ile değiştirmek için hücreler 24 saat.
  3. Ekle 5 mg/mL 3-(4, 5-dimethylthiazole-2-il)-2,5-difenyltetrazolium bromür (MTT) çözüm (20 μL/Well) 96-kuyu plakaları ve daha fazla kültür için hücreler 4 h.
  4. Çözümü çıkarın ve 150 μL DMSO her iyi için ekleyin ve 96-kuyu plakaları 30 saniye sallayın.
  5. Hücre viability göstermek için bir Mikroplaka Okuyucu ile 490 nm optik yoğunluğu (OD) ölçün. Denklem 9' a göre hücre canlılığı yüzdesini hesaplayın.
    Hücre canlılığı% = Equation 10 (9)

9. mBG/GFP-pDNA polyplexes transfeksiyon verimliliği

  1. 50 μL RNase/DNase-ücretsiz su içinde Reporter gen yeşil floresan protein (GFP) pDNA (GFP-pDNA) içeren pDNA 50 μg çözülür. Daha sonra 1 mg mBG kopolimer ' i 10 mL RNase/DNase-serbest suda eritin. PDNA ve mBG çözümünü 1:1, 4:1, 8:1, 16:1 ve 32:1 oranında bir ücret oranıyla (N/P) karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye yapın. Ultrasonik dalgalar (30 s) kullanarak mBG/GFP-pDNA polyplexes solüsyonu dağıtın ve takip denemeleri için 4 °C ' de saklayın.
    Not: N/P oranı, mBG 'de amino nitrojen (N) molekül ağırlıklarına ve pDNA 'daki fosfat grubunda (P) göre hesaplanır.
  2. Tohum MCF-7 hücrelerin bir yoğunluğu 2 × 105 hücreler başına iyi bir 6-kuyu plaka ve kültür onları 37 °c ve 5% Co2 için bir nemlendirici kuluçk 12 h.
  3. Kültür ortamını, 6 h için farklı N/P oranlarının (4, 8, 16 ve 32) mBG/GFP-pDNA polyplexes içeren taze kültür ortamı ile değiştirin.
  4. 48 h için taze RPMI1640 orta ve kültür 2 mL ile orta değiştirin.
  5. Hücreleri toplayın ve bir akış cytometer ile yeşil floresans algılayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

BNHEMA, Tablo 1' de gösterilen polimerizasyon derecesine göre beslendi; mBG sentezi prosedürü Şekil 1' de gösterilir. Öncelikle, BNHEMA homopomer, su-dioxane sistemindeki geri dönüşümlü ek parçalanma zinciri transferi (RAFT) yöntemi ile, bir zincir transfer ajanı olarak 4-cyanopentanoik asit dithiobenzoat kullanılarak hazırlanmıştır. İkincisi, PBNHEMA BNHEMA-b-apma blok polimer hazırlamak için bir zincir transfer ajanı olarak kullanılmıştır. APMA monomer, Tablo 1' de gösterilen polimerizasyon objektif derecesine göre beslendi. Jel nüfuz Kromatografi (GPC) farklı besleme oranları ile BA molekül ağırlığını algılamak için yapılmıştır (Tablo 1). Farklı besleme oranlarıyla BA 'da APMA zincirlerinin gerçek molar içeriği ninhidrin yöntemi ile tespit edildi (Tablo 1). Bizim önceki çalışma5göre, biz mevcut çalışmada mBG3 kullanılan çünkü en yüksek apma içeriği vardır. Son olarak, metiyonin APMA zincirine atfedildi ve kalan Amin grupları mBG hazırlamak için tamamen guanidinylated edildi. Şekil 2 MBG 1H NMR verilerdir. MBG/pDNA polyplexes ortalama parçacık boyutu ve Zeta potansiyeli 124 nm ve + 15,7 mV, sırasıyla, bir N/P oranı 16 (Şekil 3).

Elektroforetik retardasyon agaroz jellerinde kendi elektroforetik hareketlilik farklılıkları dayalı ilişkisiz pdna ve kopolimer/pdna Polyplex ayrılması içeren hızlı ve basit bir tekniktir. İlişkisiz pdna bandı, elektrik alanının eyleminde agaroz jel içinde hareket edebilir. Elektroforetik gerilme deneyi (Şekil 4), pdna (0 bir N/P oranı ile) agaroz jel kısıtlama olmadan hareket edebilir ve jel görüntüleştirici bir şerit olarak gözlemlenmiştir. PDNA mBG ile kompleks olduğunda, pDNA hareketi özürlü ve daha sonra bant parlaklığını azalır. Şekil 4 , N/P 4 ' ten daha yüksek olduğunda MBG 'Nin pdna 'yı tamamen karmaşıklaşabilir olduğunu gösterir.

MBG/pDNA polyplexes sitotoksisitesi standart MTT tahlil kullanılarak ölçülmüştür (Şekil 5). Sonuçlara göre mBG/pDNA polyplexes, MCF-7 hücre hattında (P < 0.05, n = 3, tek yönlü ANOVA) 4, 8, 16 ve 32 N/P oranlarında PEI/pDNA polyplexes 'den daha düşük sitotoksisiteye sahiptir. Ayrıca, mBG/pDNA polyplexes sitotoksisitesi artan N/P oranı ile artar. MBG/pDNA polyplexes bir artan N/P ile sitotoksisite artış pozitif şarj GPMA bileşeni bir sonucudur. MBG/pdna polyplexes daha az sitotoksisite PEI/pdna polyplexes gösterdi, hangi katyonik polimerlerin yüzey şarj kalkanı kopolimerler bnhema varlığına atfedilen olabilir.

PDNA transfeksiyon deneyinde kullanılan N/P oranı sitotoksisite sonuçlarına göre seçilmiştir. Şekil 6' da görüldüğü gibi, MBG1, MBG2 ve mBG3 transfeksiyon YETENEKLERI Gfp floresans yoğunluğunu ölçerek karşılaştırıldı ve sonuçlar mBG3 optimum gen taşıyıcı olduğunu gösterdi. Bir N/P oranı 8 olan PEI/pDNA polyplexes mBG3/P oranı 32/pDNA polyplexes gibi benzer transfeksiyon verimliliği var rağmen, PEı daha yüksek sitotoksisite ve Biyomedikal alanda uygulama kısıtlar ilaç yükleme gibi hiçbir işlevi vardır. Sonuçlar, AMPA içeriğinin artışın mBG kopolimer transfeksiyon verimliliğini artırmak için anahtar olduğunu ortaya koydu. Daha önceki bir çalışmada belirtildiği gibi5, Cell penetran peptidler (cpps) olan 9-35 Mer katyonik veya amphipoathic peptidler hücre membranı nüfuz yeteneği ile. Guanidin grubu, polimer/pdna Polyplex transfeksiyon proteinden bağımsız bir transmembran yolu ile geliştirmek için bir polimer içine konjuk edilebilir bir katyonik cpp olduğunu. Bu nedenle, MBG kopolimer hücre penetrasyonu için guanidin grupları ve koruyucu için bnhema bileşeni ile ilgili avantajları entegre, etkili gen teslim için büyük bir potansiyel gösteren.

Örnek BHEMA-b-APMA Mw Pdı
APMA içeriğinin teorik değeri (%) APMA içeriğinin fiili değeri (%)
BNHEMA90-b-apma30(BA1) 25 21 16200 1,25
BNHEMA90-b-apma60(Ba2) 40% 37% 20900 1,21
BNHEMA90-b-apma90(Ba3) 50% 52% 27200 1,25

Tablo 1: RAFT polimerizasyonu ile BNHEMA-b-apma bileşimi.

Figure 1
Resim 1: mBG 'Nin şematik sentezi prosedürü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: 1H NMR Spectra MBG D2O. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: partikül boyutu ve polyplexes Zeta potansiyeli.
(A) ba/pdna parçacık boyutu. (B) MBG/pdna parçacık boyutu. (C) ba/pdna Zeta potansiyeli. (D) MBG/pdna Zeta potansiyeli. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: BA3 Agarose jel elektroforez görüntüleri
(a) , mBA3 (b) ve mBG3 (c) farklı şarj oranlarında polyplexes.

Figure 5
Şekil 5: MCF7 hücre hattında farklı N/P oranındaki mBG/pDNA polyplexes sitotoksisitesi.
Kontrol olarak PEI/pDNA Polyplex kullanıldı. Veriler ortalama ± SD (n = 3) olarak gösterildi. * PEı grubuna kıyasla p < 0.05 gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6:4, 8, 16 ve 32 N/P oranındaki mBG/pDNA polyplexes transfeksiyon verimliliği akış sitometresi ile ölçülmüştür.
Veriler ortalama ± SD (n = 3) olarak gösterdi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada bir dizi BNHEMA-b-APMA blok polimer cationıc gen taşıyıcıları tanıtıldı. Bu blok polimerleri, geri dönüşümlü toplama-parçalanma zinciri transferi (RAFT) yöntemi ile sentezlenmiş. Hidrofilik segment BNHEMA çözünürlüğünü artırmak için tanıtıldı. Metionin ve guanidin grupları hedef yeteneği ve transfeksiyon verimliliğini artırmak için değiştirilmiş5. APMA zincir içeriği arttı ve mBG kopolimer guanidinylation mBG/pDNA polyplexes parçacık boyutunu azalttı. Parçacık boyutu ve yüzey potansiyeli karmaşık hücre membranı boyunca kolay ve transfeksiyon için uygulanabilir hale. Deneydeki kritik noktalar, BNHEMA monomer ve CTP 'in 45:1 için molar oranını, 2:1 için CTP ve ACVA 'nın molar oranını ve 70 °C ' ye sıcaklığa karşı kesinlikle kontrol altına almak. Arıtma işlemi sırasında, presoğutmalı aseton ve polimer çözeltinin hacim oranı 50:1 'den daha yüksek olmalıdır.

Aynı N/P değeri ile birlikte APMA zincirinin oranının artması ile mBG/pDNA polyplexes parçacık boyutu azalır. Bu sonuçlar APMA zincir içerik artışı ve guanidinylation parçacık boyutunu azaltabilir gösterir. Parçacık boyutu ve yüzey potansiyeli karmaşık hücre membranı boyunca taşıma ve transfeksiyon için uygulanabilir kolaylaştırır. Jel elektroforezi, kompleks ve N/P oranı arasındaki ilişkiyi araştırmak için kullanılmıştır ve veriler minimum N/P 'nin 4 olduğunu göstermiştir. Bu çalışma, katyonik gen taşıyıcıların daha fazla çalışması için değerli temel veriler sağlayacaktır. Ancak, BNHEMA-b-apma kolayca bozulmaz ve metabolizma süreci içinde vivo yeterince net değildir. Bu nedenle, klinik uygulama hala katyonik polimer gen taşıyıcıları için büyük bir zorluk olduğunu.

Yüksek verimlilik ve gen taşıyıcıları düşük toksisitesi klinik kullanımı için gerekli koşullar vardır. Cationic polimer gen vektörler iyi stabilite avantajları vardır ve hiçbir immünogenisite ve kolayca hazırlanabilir ve değiştirilebilir.

RAFT polimerizasyon, Stiren, metakrilat, akrilonitril ve akrilamid gibi monomerlerin polimerizasyonu için yaygın olarak kullanılır. Bu tür polimerizasyon süreci düşük sıcaklıkta yapılabilir. Ayrıca, RAFT polimerizasyon ince yapıların polimerleri sentezlemek için kullanılabilir. Bu protokolde açıklanan RAFT polimerizasyon Biyomedikal polimerlerin hazırlanması için en umut verici potansiyel yöntemlerden biri olarak kabul edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar bu makalede tartışılan malzeme ile ilgili herhangi bir mali organizasyon ile ilgili hiçbir çatışma olduğunu teyit.

Acknowledgments

Bu araştırma Çin Ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı (No. 2016YFC0905900), Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (NOS. 81801827, 81872365), Jiangsu Eyaleti temel araştırma programı (doğal Bilim Vakfı, hayır tarafından desteklenmektedir. BK20181086), ve Jiangsu Kanser Hastanesi bilimsel araştırma fonu (No. ZK201605).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-hydroxybenzotriazole Macklin Biochemical Co., Ltd,China H810970 ≥97.0%
1,4-dioxane Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China 10008918 AR
1-amidinopyrazole Hydrochloride Aladdin Co., Ltd., China A107935 98%
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride Aladdin Co., Ltd., China E106172 AR
4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) Aladdin Co., Ltd., China A106307 Analytical reagent (AR)
4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid Aladdin Co., Ltd., China C132316 >97%(HPLC)
Acetate Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China 81014818 AR
Acetone Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China 10000418 AR
Agarose Aladdin Co., Ltd., China A118881 High resolution
Ascorbic acid Aladdin Co., Ltd., China A103533 AR
DMSO Aladdin Co., Ltd., China D103272 AR
Ethylene glycol Aladdin Co., Ltd., China E103319 AR
N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride Aladdin Co., Ltd., China N129096 ≥98.0%(HPLC)
N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China CF259748 ≥98.0%(HPLC)
Ninhydrin Aladdin Co., Ltd., China N105629 AR
PBS buffer Aladdin Co., Ltd., China P196986 pH 7.4
Plasmid DNA BIOGOT Co., Ltd, China pDNA-EGFP pDNA-EGFP
Plasmid DNA BIOGOT Co., Ltd, China Pdna pDNA
Sodium carbonate decahydrate Aladdin Co., Ltd., China S112589 AR
Trimethylamine Aladdin Co., Ltd., China T103285 AR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flotte, T. R. Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead. Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).
  2. Huang, W., et al. Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).
  3. Wu, Y., et al. Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles. Colloids & Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).
  4. Quader, S., Kataoka, K. Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy. Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).
  5. Wu, Y., et al. Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR. Journal of Gene Medicine. 19, e2969 (2017).
  6. Szwarc, M. ‘Living’ Polymers. Nature. 178, 168-169 (1956).
  7. Szwarc, M., Rembaum, A. Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer. Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).
  8. Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. Living supramolecular polymerization. Science. 349, 241 (2015).
  9. Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization. European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).
  10. Wu, W., Wang, W., Li, J. Star polymers: Advances in biomedical applications. Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).
  11. Boyer, C., et al. Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications. Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).
  12. Keddie, D. J. A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization. Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).
  13. Wu, Y., et al. Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression. Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).
  14. Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).
  15. Friedman, M. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).
  16. Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).
  17. Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles. Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).

Tags

Kimya sayı 150 geri dönüşümlü ek-parçalanma zinciri transferi RAFT ilaç teslim sistemi DDS metiyonin guanidine n-(3-aminoprotransl) methacrylamid hidroklorür apma n,n-bis(2-hidroksietil) metakrilamid BNHEMA
Hedeflenen Plasmid DNA teslim için metiyonin functionalized biyouyumlu blok kopolimerler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, Y., Zhang, W., Zhang, J., Mao,… More

Wu, Y., Zhang, W., Zhang, J., Mao, Z. X., Ding, L., Li, H., Ma, R., Tang, J. H. Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery. J. Vis. Exp. (150), e58527, doi:10.3791/58527 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter