Summary
Detta arbete presenterar utarbetandet av metionin funktionaliserade biokompatibla block sampolymerer (MBG) via reversibel addition-fragmentering Chain Transfer (RAFT) metod. Den plasmid-DNA-komplexbildare förmågan hos de erhållna MBG och deras verkningsgrad undersöktes också. FLOTTE metoden är mycket fördelaktigt för polymeriserande monomerer som innehåller särskilda funktionella grupper.
Abstract
Reversibel addition-fragmentering Chain Transfer (RAFT) polymerisation integrerar fördelarna med radikal polymerisation och levande polymerisation. Detta arbete presenterar utarbetandet av metionin funktionaliserade biokompatibla block sampolymerer via RAFT polymerisation. För det första, n, n-BIS(2-hydroxyethyl) methacrylamide-b-N-(3-AMINOPROPYL) metakrylamid (bnhema-b-apma, ba) syntetiserades via RAFT polymerisation med 4, 4 '-azobis (4-cyanovaleric acid) (ACVA) som en initierande medel och 4-cyanopentansyra ditiobenzoat (CTP) som kedje överförings medel. Därefter, n, n-BIS(2-hydroxyethyl) metakrylamid-b-N-(3-guanidinopropyl) metakrylamid (METIONIN ympade bnhema-b-gpma, MBG) BEREDDES genom att modifiera Amin grupper i apma med metionin och guanidin Grupper. Tre typer av block polymerer, mBG1, mBG2, och mBG3, var syntetiserade för jämförelse. En ninhydrin reaktion användes för att kvantifiera APMA-halten; mBG1, mBG2, och mBG3 hade 21%, 37%, och 52% av APMA, respektive. Resultaten av gelpermeationkromatografi (GPC) visade att BA-sampolymerer besitter molekylvikter på 16 200 (BA1), 20900 (BA2) och 27200 (BA3) g/mol. Den plasmid DNA (pdna) komplexbildare förmåga av de erhållna block sampolymer gen bärare undersöktes också. Laddkvoterna (N/P) var 8, 16 och 4 när pdna var komplex helt med mBG1, mBG2, mBG3, respectively. När N/P förhållandet mBG/pDNA polyplexes var högre än 1, Zeta potentialen av mBG var positiv. Vid ett N/P-förhållande mellan 16 och 32 var den genomsnittliga partikelstorleken för mBG/pDNA polyplexes mellan 100-200 nm. Sammantaget illustrerar detta arbete ett enkelt och bekvämt protokoll för blocket sampolymer Carrier syntes.
Introduction
Under de senaste åren, genterapi har dykt upp för den terapeutiska leveransen av nukleinsyror som läkemedel för att behandla alla typer av sjukdomar1. Utvecklingen av gen droger inklusive plasmid DNA (pDNA) och små störande RNA (siRNA) förlitar sig på stabiliteten och effektiviteten i drogen Delivery System (DDS)2. Bland alla DDS, katjoniska polymer bärare har fördelarna med god stabilitet, låg immunogenicitet, och facile beredning och modifiering, som ger katjoniska polymer bärare bred tillämpning utsikterna3,4. För praktiska tillämpningar inom biomedicin måste forskarna hitta en katjonpolymer bärare med hög verkningsgrad, låg toxicitet och god inriktnings förmåga5. Bland alla polymer bärare, block sampolymerer är en av de mest använda drogen leveranssystem. Block sampolymerer studeras intensivt för sina själv monterings egenskaper och förmågor för att bilda miceller, mikrosfärer och nanopartiklar i läkemedelsleverans5. Block sampolymerer kan syntetiseras via levande polymerisation eller klicka kemi metoder.
I 1956, Szwarc et al. tog upp ämnet levande polymerisation, definiera det som en reaktion utan kedjebrytande reaktioner6,7. Sedan dess har flera tekniker utvecklats för att syntetisera polymerer med denna metod; Sålunda, levande polymerisation ses som en milstolpe av polymer Science8. Living polymerisation kan klassificeras i levande anjoniska polymerisation, levande katjoniska polymerisation, och reversibel deaktivering radikal polymerisation (RDRP)9. Living anjoniska/katjoniska polymeriseringar har ett begränsat tillämpningsområde på grund av deras strikta reaktion villkor10. Kontrollerad/Living radikal polymerisation (CRP) har milda reaktions förhållanden, bekväm disposition, och god avkastning och har därmed varit ett stort forskningsfokus under de senaste åren11. I CRP, aktiva spridnings kedjor är reversibelt passiverat till vilande dem för att minska koncentrationen av fria radikaler och undvika den bimolekyl ära reaktionen av föröknings kedjan radikaler. Tillägget polymerisation kan fortsätta endast om inaktiva vilande föröknings kedjor är reversibelt animerade i kedjans radikaler. Som en av de mest lovande formerna av levande radikal polymerisation, reversibel addition-fragmentering Chain Transfer (RAFT) polymerisation är en metod som gäller för skörde block polymerer med kontrollerad molekylvikt och struktur, smal molekylvikt distribution och bärande funktionella grupper12. Det nyckel-till lyckad RAFT polymerisation är verkställa av kedjar överförings medel, vanligt dithioesters, som äger mycket kicken kedjar överförings konstanten.
I detta papper, en flotte polymerisation metod utformades för att förbereda BNHEMA-b-apma block polymer, med 4, 4 '-azobis (4-cyanovaleric acid) (ACVA) som en initierande agent och 4-cyanopentanoic Acid dithiobenzoate (CTP) som en kedje överföring agent. RAFT polymerisation användes två gånger för att införa BNHEMA i katjoniska polymer bärare. Därefter ändrades amingrupperna i APMA-kedjan med metionin och guanidinylationsreagens 1-amidinopyrazolhydroklorid. Att göra användningen av de positiva avgifterna för guanidinylation reagens och metakrylamid polymer skelett struktur, cellulära upptag effektiviteten hos de erhållna block polymer bärare förbättrades.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. syntes av BNHEMA polymer (PBNHEMA)
- Lös upp 1,87 g n, n-BIS(2-hydroxyethyl) METAKRYLAMID (Bnhema) i 1 ml destillerat vatten i en polymeriseringsflaska.
Obs: polymerisation flaskan är en rund-botten kolv med en gummipropp och en magnetisk omrörare. - Lös 0,03 g 4-cyanopentansyra ditiobenzoat (CTP) och 0,02 g 4, 4 '-azobis (4-cyanovalericacid) (ACVA) i 0,5 mL av 1,4-dioxan i en 5 mL-bägare. Tillsätt sedan CTP-och ACVA-lösningen till polymeriseringsflaskan från steg 1,1.
- Ventilera Reaktionssystemet i polymerisation flaskan med kväve via tre frys-pump-Tina cykler.
- I detalj, frysa lösningen i polymerisation flaskan med hjälp av en kondensat fälla, fixa polymerisation flaskan till järnstöd, och vacuumize och injicera kväve i reaktionsblandningen via en trumma tippas med en nål (#9 nål, inre diameter 0,65 mm, ytterdiameter 0,9 mm). Täta polymerisation flaskan och Tina lösningen vid rumstemperatur i 30 min.
- Upprepa frys-pump-Tina cykler tre gånger.
- Sätt polymerisation flaskan i en 70 ° c olja-bad och låt lösningen reagera för 24 h under kväve atmosfären.
- Kyla polymerisation flaskan vid 0 ° c och öppna gummiproppen för att avsluta polymerisation processen.
- Precool aceton i a-20 ° c kylskåp för 2 h och sedan blanda den med reaktions lösningen av steg 1,5 på 50:1 (v/v). Därefter Centrifugera vid 8 200 x g i 10 minuter för att ta bort aceton och samla upp fällatet.
- För att rena den syntetiserade pbnhema, lösa upp den insamlade fällning i 2 ml rent vatten och sedan blanda den med 100 ml av förhandskylda aceton, vid förhållandet 1:50 (v/v). Centrifugera lösningen vid 8 200 x g i 10 minuter och samla upp fällningsandet. Upprepa denna process tre gånger.
- Torka den producerade PBNHEMA med en 50 ° c vakuum tork. När torkat, väga pulvret med en balans. Beräkna avkastningsgraden enligt ekvation 1.
1
Anmärkning: i detta experiment, avkastningen erhölls var 77,2%.
12. syntes av BNHEMA-b-apma polymer (ba)
- Lös upp 0,96 g N-(3-aminopropyl) metakrylamidhydroklorid (apma) och 0,93 g PBNHEMA i 5 ml destillerat vatten i en 10 ml-bägare.
- Lös upp 0,01 g 4, 4 '-azobis (4-cyanovalerisk syra) (ACVA) i 0,5 mL 1,4-dioxan och blanda med APMA-PBNHEMA-lösningen från del 2,1.
- Överför blandningen till en polymerisation flaska och ventilera med torrt kväve för 1 h.
- Sätt polymerisation flaskan i en 70 ° c olja-bad och låt den reagera för 24 h under kväve atmosfären.
- Kyla polymerisation flaskan vid 0 ° c och öppna gummiproppen för att avsluta polymerisation processen.
- Överför lösningen till den kylda aceton från steg 1,6, och centrifugera sedan lösningen på 8 200 x g i 10 minuter för att fälla ut ba.
- Lös upp BA-värdet i 2 mL destillerat vatten och Fäll upp polymeren i kyld aceton. Upprepa tre gånger.
- Torka den producerade BA i en 50 ° c vakuum tork och väg det erhållna pulvret. Beräkna avkastningsgraden enligt ekvation 2.
Anmärkning: i detta experiment beräknades avkastningsgraden vara 82,0%.
3. Bestäm mol procent av APMA i BA sampolymer via ninhydrin metoden
Anmärkning: spektrofotometri används för att bestämma innehållet i multikomponentaminosyror. Principen är en färgreaktion av ninhydrin och aminosyra där absorbansen är korrelerad med aminosyran innehållet till en viss grad13,14.
- Lös 5 g ninhydrin i 125 mL kokande destillerat vatten. Lös också 5 g C-vitamin i 250 mL varmt destillerat vatten. Tillsätt 250 ml vitamin C-lösning droppvis till ninhydrinlösningen under magnetisk omrörning. Fortsätt att röra i 15 min och sedan kyla reaktions lösningen i en 4 ° c kylskåp.
- Ta lösningen ur kylskåpet och filtrera genom sug med en Buchner tratt för att få reducerad ninhydrin. Samla fällat och bevara den i en fosfor pentoxid dehydrator.
- Lös 85 mg ninhydrin och 15 mg reducerad ninhydrin i 10 mL etylenglykolmonometyleter för att framställa ninhydrin-färgningslösningen.
Obs: ninhydrin-färg lösning kan reagera med α-amino i APMA och bilda en violett förening med en struktur som beskrivs i en tidigare studie15. - Späd 1 mL 0, 1, 10, 100, 1 000 mg/mL APMA monomer lösningar med 1 mL acetatbuffert (2 M, pH 5,4), och tillsätt sedan 1 mL av ninhydrin-färg lösning, respektive.
- Värm blandningar för 15 min i kokande vattenbad och sedan kyla dem med rinnande vatten. Låt lösningarna sitta i 5-10 min och späd dem med 3 mL 60% etylalkohol och blanda dem noggrant. Mät absorbansen vid 570 nm med hjälp av en spektrofotometer och rita standardkurvan (ekvation 3).
Anmärkning: ekvation 3 härleddes från den linjära anpassningen av absorbansen vid 570 nm kontra APMA-koncentrationen. - Lös upp 0,01 g BA i 1 mL destillerat vatten. Tillsätt 1 mL acetatbuffert (2 M, pH 5,4) och 1 mL ninhydrin-färglösning. Beräkna den molar halten av APMA enligt absorbans vid 570 nm.
5
ANMÄRKNINGAR: beräkningsformlerna är följande (ekvationer 3-6).
5
4. syntes av metionin ympade BA polymer (mBA)
- Lös 8,9 mg FOMC-metionin i 5 mL DMSO i en återvinnings kolv.
- Tillsätt 6,92 mg 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl) carbodiimidhydroklorid (EDCl) och 4,86 mg 1-hydroxibensotriazol (HOBT) till återvinnings kolven och reagera vid 0 ° c för 0,5 h.
- Lös upp 2,59 g BA i 5 mL DMSO-lösning och tillsätt sedan 50 μL trimetylamin. Lägg till denna lösning droppvis till återvinnings kolven (steg 4,2) och låt lösningen reagera för 0,5 h vid rumstemperatur.
- Dialyze att ta bort DMSO och trimetylamin från BA-lösningen i steg 4,3 med hjälp av en dialys påse (mwco 10 kDa) i en 2 L bägare för 24 h; Byt ut avjoniserat vatten var 6 h.
- Frys-torka den erhållna mBA och väga för att beräkna avkastningsgraden enligt ekvation 7.
Anm.: i detta fall fastställdes avkastningsgraden till 71%. - Kvantifiera NH2 som innehåller mBA genom att mäta absorbansen vid 570 Nm för att beräkna mängden ympade metionin. Beräkna molar innehållet i metionin enligt ekvation 8.
5. syntes av guanidinated och metionin konjugerad BNHEMA-b-apma polymer (MBG)
Anmärkning: tre olika mBA1, mBA2 och mBA3 sampolymer syntetiseras. mBA3 sampolymer används som ett exempel i följande steg.
- Lös upp mBA3 som innehåller 60 μmol av aminogruppen i 5 mL rent vatten.
Anmärkning: Aminogruppens innehåll kvantifierades med hjälp av ninhydrin-metoden enligt beskrivningen i steg 3,5. - Lös 40,6 mg (300 μmol) av guanidinylationsreagens 1-amidinopyrazolhydroklorid i mBA-lösningar.
- Justera pH till 9,0 med den mättade lösningen av natriumkarbonat och låt den stabiliseras för 24 h vid rumstemperatur.
- Dialysera mBG-produkten med avjoniserat vatten med hjälp av en dialys påse i en bägare (MWCO 10 kDa, 2 L) och bevara den i form av ett frystorkat pulver.
Avkastningsprocenten beräknades vara 85% via ekvation 8.
8 - Lös upp mBG-pulvret i D2O i NMR-rören och karakterisera det med hjälp av 1h kärnmagnetisk resonans-spektroskopi (1h NMR)16.
86. beredning och karakterisering av mBG/pDNA polyplexes
- Lös upp 50 μg pDNA i 50 μL av RNase/DNase-fritt vatten.
- Lös upp 1 mg av mBG-sampolymerer i 1 mL RNase/DNase-fritt vatten.
- Tillsätt mBG-kopolymerlösningen direkt i pDNA-lösningen enligt olika matnings förhållanden, det vill, olika N/P-förhållanden (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 och 32:1).
Anm.: N/P-förhållandet definieras som molarkvoten för guanidingruppen i polymeren och fosfat gruppen i pDNA, nämligen molar-förhållandet i GPMA-kedjan i polymeren och mononukleotiden i pDNA. N/P-kvoten beräknas enligt molekylvikten för aminokväve (N) i mBG och fosfatgrupp (P) i pDNA. - Blanda lösningarna med en Vortex mixer och låt dem stå i 30 minuter vid rumstemperatur. Efter det, skingra blandningen i fosfatbuffertlösning (PBS, pH 7,4) och bevara de erhållna mBG/pDNA polyplexes vid 4 ° c för uppföljningsexperiment.
Notera: den genomsnittliga partikelstorleken och Zeta potentialen hos mBG och komplexen upptäcktes med hjälp av dynamisk ljusspridning (DLS)17. - Späd 10 μL av mBG/pDNA Polyplex lösningar med 1 mL PBS (pH 7,4) i DLS och Zeta potentiella prov celler.
Anmärkning: partikelstorlek och Zeta potentiell detektering utfördes tre gånger och ett genomsnitt av de tre värdena togs.
7. experiment med elektroforetisk utvecklingsstörning av MBG/pdna polyplexes
Anmärkning: ett elektroforetiskt utvecklingsstörning experiment utfördes för att fastställa den lägsta laddnings kvoten.
- Ta fem grupper av mBG/pDNA polyplexes med olika N/P nyckeltal (1:1, 4:1, 8:1, 16:1, och 32:1) som innehåller 50 μg pDNA.
- Tillsätt 6x lastbuffert till mBG/pDNA Polyplex prover till en slutlig koncentration av 1x.
- Tillsätt lösningarna till 1,5% aguppstod geler och kör gelen vid 90 mV i 15 min, med pDNA som kontroll.
- Ta bilder av geler med hjälp av en gel Imager.
8. cytotoxicitet av mBG/pDNA polyplexes
- Seed MCF-7 celler i 96-well plattor med en densitet på 104 celler per brunn. Sedan odla cellerna för 12 h med hjälp av DMEM medium (10% FBS och 1% antibiotika) i en Befuktad 37 ° c inkubator levereras med 5% CO2.
- Ersätt odlingsmediet med antibiotika fria DMEM-kulturmedia som innehåller 10% fetalt bovint serum (FBS) och mBG/pDNA-polyplexer med olika laddningsproportioner (N/P 4, 8, 16 och 32, n = 6) för 6 timmar, med celler tillagda med samma volymer PBS-lösning som kontrollen. Ersätt sedan odlingsmediet med 150 μL färskt 1640 medium och odla cellerna för 24 h.
- Tillsätt 5 mg/mL 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) lösning (20 μL/brunn) till 96-brunn plattor och ytterligare odling cellerna för 4 h.
- Ta bort lösningen och tillsätt 150 μL av DMSO till varje brunn och skaka 96-brunn plattorna 30 SEK.
- Mät den optiska densiteten (OD) vid 490 nm med en mikroplattläsare för att Visa cellernas lönsamhet. Beräkna cellernas genomförbarhet i procent enligt ekvation 9.
Cellernas genomförbarhet%
= (9)
= (9)9. transfektion effektivitet mBG/GFP-pDNA polyplexes
- Lös upp 50 μg pDNA som innehåller reportern-genen Green fluorescerande protein (GFP) pDNA (GFP-pDNA) i 50 μL av RNase/DNase-fritt vatten. Lös sedan 1 mg av mBG-sampolymerer i 1 mL RNase/DNase-fritt vatten. Blanda pDNA och mBG lösning med en avgift ratio (N/P) av 1:1, 4:1, 8:1, 16:1 och 32:1 och inkubera i 30 min vid rumstemperatur. Skingra mBG/GFP-pDNA polyplexes lösning med hjälp av ultraljudsvågor (30 s) och lagra vid 4 ° c för uppföljningsexperiment.
Anm.: N/P-kvoten beräknas enligt molekylvikten för aminokväve (N) i mBG och fosfatgrupp (P) i pDNA. - Seed MCF-7 celler vid en densitet av 2 × 105 celler per brunn i en 6-brunn tallrik och odla dem vid 37 ° c och 5% Co2 i en fuktad inkubator för 12 h.
- Ersätt odlingsmediet med det färska odlingsmediet innehållande mBG/GFP-pDNA polyplexes av olika N/P-förhållanden (4, 8, 16 och 32) för 6 h.
- Byt ut mediet med 2 mL färskt RPMI1640 medium och kultur för 48 h.
- Samla in cellerna och detektera den gröna fluorescensen med en flödescytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BNHEMA utfodrades enligt den objektiva grad av polymerisation som visas i tabell 1. syntes proceduren för mBG visas i figur 1. För det första var BNHEMA homopolymer utarbetats via reversibel addition-fragmentering Chain Transfer (RAFT) metod i vatten-dioxan systemet, med hjälp av 4-cyanopentanoic Acid dithiobenzoate som en kedje överföring agent. För det andra, PBNHEMA användes som en kedje överföring agent för att förbereda BNHEMA-b-apma block polymer. APMA monomer utfodrades enligt den objektiva grad av polymerisation som visas i tabell 1. Gelpermeationskromatografi (GPC) utfördes för att påvisa molekylvikten hos BA med olika matnings förhållanden (tabell 1). Den faktiska molar halten av APMA kedjor i BA med olika matnings förhållanden upptäcktes via ninhydrin-metoden (tabell 1). Enligt vår tidigare studie5, vi använde mBG3 i den nuvarande studien eftersom den har den högsta apma innehåll. Slutligen var metionin ympas till APMA kedjan och resterande Amin grupper var helt guanidinylated att förbereda mBG. Figur 2 är MBG-data för 1H NMR. Den genomsnittliga partikelstorleken och Zeta potentialen för mBG/pDNA polyplexes var 124 nm respektive + 15,7 mV vid ett N/P-förhållande på 16 (figur 3).
Elektrofores utvecklingsstörning är en snabb och enkel teknik som innebär separation av obunden pdna och sampolymer/pdna Polyplex baserat på skillnader i deras elektrofores utbyten i agaros geler. Den obunden pDNA band kan flytta i aguppstod gel under verkan av det elektriska fältet. I det elektroforetiska utvecklingsstörning-experimentet (figur 4) kan pdna (med ett N/P-förhållande på 0) röra sig utan återhållsamhet i aguppstod-gelen och observerades som en rand i gelen Imager. När pDNA är komplex med mBG, är förflyttningen av pDNA efterbliv och därefter minskas bandets ljusstyrka. Figur 4 visar att MBG kan helt komplexa pdna när N/P är högre än 4.
Cytotoxiciteten hos mBG/pDNA polyplexes mättes med hjälp av standard MTT-analysen (figur 5). Resultaten visar att mBG/pDNA polyplexes har uppenbarligen lägre cytotoxicitet än PEI/pDNA polyplexes vid N/P förhållandet 4, 8, 16, och 32 i MCF-7 cellinjer (P < 0,05, N = 3, enkelriktad ANOVA). Vidare ökar cytotoxiciteten av mBG/pDNA polyplexes med ökat N/P-förhållande. Ökningen av cytotoxiciteten av mBG/pDNA polyplexes med en ökad N/P är ett resultat av positivt laddade GPMA komponent. MBG/pdna polyplexes visade mindre cytotoxicitet än Pei/pdna polyplexes, som kan hänföras till förekomsten av bnhema i sampolymerer avskärmning ytan laddningen av katjoniska polymerer.
N/P-kvoten som användes i pDNA-transfektionexperimentet valdes enligt cytotoxicitetsresultaten. Som framgår av figur 6jämfördes transfektionförmågorna MBG1, MBG2 och mBG3 genom att mäta intensiteten i GFP-fluorescensen och resultaten visade att mBG3 är den optimala gen bäraren. Även om PEI/pDNA polyplexes med ett N/P-förhållande på 8 har liknande transfektionseffektivitet som mBG3/pDNA polyplexes med ett N/P-förhållande på 32, har PEI högre cytotoxicitet och har inga funktioner såsom drog belastning, vilket begränsar dess tillämpning inom det biomedicinska fältet. Resultaten visade att ökningen av AMPA innehåll är nyckeln till att förbättra transfektion effektiviteten av mBG sampolymer. Som vi nämnde i en tidigare studie5, cell genomträngande peptider (cpps) är 9-35 mer katjoniska eller amfipatiska peptider med en förmåga att tränga igenom cellmembranet. Den metyl gruppen är en katjoniska cpp som kan konjugerat till en polymer för att förbättra transfektion av polymer/pdna Polyplex genom en protein-oberoende transmembranen väg. Därför integrerar MBG sampolymer fördelar som rör metyl grupper för cell penetration och bnhema komponent för avskärmning, visar stor potential för effektiv gen leverans.
| Prov | BHEMA-b-APMA | Mw | Pdi | |
| Teoretiskt värde av APMA-halten (%) | Faktiskt värde av APMA-halten (%) | |||
| BNHEMA90-b-apma30(Ba1) | 25 | 21 | 16200 | 1,25 |
| BNHEMA90-b-apma60(Ba2) | 40% | 37% | 20900 | 1,21 |
| BNHEMA90-b-apma90(Ba3) | 50% | 52% | 27200 | 1,25 |
Tabell 1: sammansättningen av BNHEMA-b-apma genom flotte polymerisation.
Figur 1: Schematisk syntes procedur för mBG. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: 1H NMR Spectra av MBG i D2O. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: partikelstorlek och Zeta potential av polyplexes.
Apartikelstorleken för BA/pdna. Bpartikelstorleken för MBG/pdna. C) Zeta potential för BA/pdna. DZeta potential för MBG/pdna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: agaros gel elektrofores bilder av BA3
(a) , mBA3 (b) och mBG3 (c) polyplexes vid olika avgifts förhållanden.
Figur 5: cytotoxicitet av mBG/pDNA polyplexes vid olika N/P-förhållande i MCF7 cellinjer.
PEI/pDNA Polyplex användes som kontroll. Data visades som medelvärdet ± SD (n = 3). * indikerar p < 0,05 jämfört med PEI-gruppen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Transfektionseffektiviteten hos mBG/pDNA polyplexes vid N/P-förhållandet 4, 8, 16 och 32 mättes med flödescytometer.
Data visades som medelvärdet ± SD (n = 3). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie introducerade en serie av BNHEMA-b-APMA block polymer katjoniska gen bärare. Dessa block polymerer var syntetiseras via den reversibla addition-fragmentering Chain Transfer (RAFT) metod. Det hydrofila segmentet BNHEMA introducerades för att förbättra lösligheten. Metionin och guanidin grupper ändrades för att förbättra mål förmågan och transfektion effektivitet5. Den APMA kedjans innehåll ökat och guanidinylation i mBG sampolymer minskat partikelstorlek mBG/pDNA polyplexes. Partikelstorlek och ytpotential gör komplexet lätt att över cellmembranet och gäller för transfektion. De kritiska punkterna i experimentet ligger i att strikt kontrollera molar förhållandet mellan BNHEMA monomer och CTP till 45:1, molar förhållandet mellan CTP och ACVA till 2:1, och temperaturen till 70 ° c. Under reningsprocessen måste volymförhållandet för förkylnings aceton och polymerlösning vara högre än 50:1.
Med samma N/P-värde, tillsammans med ökningen av andelen APMA kedjan, minskar partikelstorleken på mBG/pDNA polyplexes. Dessa resultat tyder på att APMA kedjans innehåll ökar och guanidinylation kan minska partikelstorleken. Partikelstorlek och ytpotential gör komplexet lätt att transportera över cellmembranet och gäller för transfektion. Gel elektrofores användes för att undersöka sambandet mellan komplexbildare och n/p-förhållande och data visade att den minsta N/p är 4. Denna studie kommer att ge värdefulla grundläggande data för vidare studier av katjoniska gen bärare. Emellertid, BNHEMA-b-apma är inte lätt degraderas och dess metabolism process in vivo är inte tillräckligt klar. Därför är klinisk tillämpning fortfarande en stor utmaning för katjoniska polymer gen bärare.
Hög verkningsgrad och låg toxicitet hos gen bärare är de nödvändiga förutsättningarna för deras kliniska användning. Cationic polymer gen vektorer har fördelar med god stabilitet och ingen immunogenicitet och de kan förberedas och modifieras lätt.
RAFT polymerisation används ofta i polymerisation av monomerer inklusive styren, metakrylat, akrylnitril, och akrylamid. Denna typ av polymerisation process kan utföras vid låg temperatur. Dessutom kan RAFT polymerisation användas för att syntetisera polymerer av fina strukturer. RAFT polymerisation beskrivs i detta protokoll anses vara en av de mest lovande möjliga metoder för beredning av biomedicinska polymerer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna intygar att det inte finns någon intressekonflikt med någon finansiell organisation om det material som diskuteras i denna artikel.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av den nationella centrala forsknings-och utvecklingsprogram i Kina (nr 2016YFC0905900), National Natural Science Foundation i Kina (nos. 81801827, 81872365), grundläggande forskningsprogram i Jiangsu-provinsen (Natural Science Foundation, No. BK20181086), och Jiangsu Cancer Hospital vetenskaplig forskningsfond (No. ZK201605).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-hydroxybenzotriazole | Macklin Biochemical Co., Ltd,China | H810970 | ≥97.0% |
| 1,4-dioxane | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10008918 | AR |
| 1-amidinopyrazole Hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | A107935 | 98% |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | E106172 | AR |
| 4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) | Aladdin Co., Ltd., China | A106307 | Analytical reagent (AR) |
| 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid | Aladdin Co., Ltd., China | C132316 | >97%(HPLC) |
| Acetate | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 81014818 | AR |
| Acetone | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10000418 | AR |
| Agarose | Aladdin Co., Ltd., China | A118881 | High resolution |
| Ascorbic acid | Aladdin Co., Ltd., China | A103533 | AR |
| DMSO | Aladdin Co., Ltd., China | D103272 | AR |
| Ethylene glycol | Aladdin Co., Ltd., China | E103319 | AR |
| N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | N129096 | ≥98.0%(HPLC) |
| N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide | ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China | CF259748 | ≥98.0%(HPLC) |
| Ninhydrin | Aladdin Co., Ltd., China | N105629 | AR |
| PBS buffer | Aladdin Co., Ltd., China | P196986 | pH 7.4 |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | pDNA-EGFP | pDNA-EGFP |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | Pdna | pDNA |
| Sodium carbonate decahydrate | Aladdin Co., Ltd., China | S112589 | AR |
| Trimethylamine | Aladdin Co., Ltd., China | T103285 | AR |
References
- Flotte, T. R. Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead. Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).
- Huang, W., et al. Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).
- Wu, Y., et al. Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles. Colloids & Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).
- Quader, S., Kataoka, K. Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy. Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).
- Wu, Y., et al. Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR. Journal of Gene Medicine. 19, e2969 (2017).
- Szwarc, M. ‘Living’ Polymers. Nature. 178, 168-169 (1956).
- Szwarc, M., Rembaum, A. Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer. Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).
- Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. Living supramolecular polymerization. Science. 349, 241 (2015).
- Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization. European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).
- Wu, W., Wang, W., Li, J. Star polymers: Advances in biomedical applications. Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).
- Boyer, C., et al. Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications. Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).
- Keddie, D. J. A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization. Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).
- Wu, Y., et al. Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression. Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).
- Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).
- Friedman, M. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).
- Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).
- Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles. Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).
