Summary
Dette arbeidet presenterer utarbeidelse av metionin funksjonalisert biokompatible Block kopolymerer (mBG) via reversibel tillegg fragmentering kjeden Transfer (RAFT) metoden. Plasmider DNA-kompleks evne til den oppnådde mBG og deres transfeksjoner effektivitet ble også undersøkt. FLÅTEN metoden er svært gunstig for lysherde monomerer inneholder spesielle funksjonelle grupper.
Abstract
Reversibel tillegg-fragmentering kjede overføring (RAFT) polymerisering integrerer fordelene av radikale polymerisering og levende polymerisering. Dette arbeidet presenterer utarbeidelse av metionin funksjonalisert biokompatible blokk kopolymerer via RAFT polymerisering. For det første, n, n-BIS(2-hydroxyethyl) methacrylamide-b-N-(3-aminopropyl) METHACRYLAMIDE (BNHEMA-b-APMA, ba) ble syntetisert via flåte polymerisering ved bruk av 4, 4 '-azobis (4-cyanovaleric acid) (ACVA) som en og 4-cyanopentanoic acid dithiobenzoate (CTP) som kjede overføringsagenten. Senere, n, n-BIS(2-hydroxyethyl) methacrylamide-b-N-(3-GUANIDINOPROPYL) methacrylamide (metionin podet BNHEMA-b-GPMA, mBG) ble utarbeidet ved å endre Amin grupper i APMA med metionin og guaniniumtiocyanat Grupper. Tre typer blokk polymerer, mBG1, mBG2, og mBG3, ble syntetisert for sammenligning. En ninhydrin reaksjon ble brukt til å kvantifisere APMA-innholdet; mBG1, mBG2 og mBG3 hadde henholdsvis 21%, 37% og 52% av APMA. Gel gjennomtrengning kromatografi (GPC) resultater viste at BA kopolymerer ha molekylære vekter på 16 200 (BA1), 20900 (BA2), og 27200 (BA3) g/mol. Den plasmider DNA (pDNA) kompleks evne til de oppnådde blokk kopolymer gen bærere ble også undersøkt. Lade forholdene (N/P) var 8, 16 og 4 da pDNA ble complexed helt med mBG1, mBG2, mBG3, henholdsvis. Når N/P-forholdet mellom mBG/pDNA polyplexes var høyere enn 1, var Zeta-potensialet i mBG positiv. Ved et N/P-forhold mellom 16 og 32 var den gjennomsnittlige partikkelstørrelsen på mBG/pDNA-polyplexes mellom 100-200 NM. Samlet sett illustrerer dette arbeidet en enkel og praktisk protokoll for blokken kopolymer carrier syntese.
Introduction
I de senere årene har genterapi dukket opp for terapeutisk levering av nukleinsyre syrer som medikamenter for å behandle alle typer sykdommer1. Utviklingen av gen stoffer, inkludert plasmider DNA (pDNA) og små forstyrrende RNA (siRNA), er avhengig av stabiliteten og effektiviteten til legemiddel leveringssystemet (DDS)2. Blant alle DDS, kationiske polymer bærere har fordelene med god stabilitet, lav immunogenisitet, og facile forberedelse og modifikasjon, som gir kationiske polymer bærere bred søknad utsiktene3,4. For praktisk bruk i biomedisin, må forskerne finne en kationiske polymer carrier med høy effektivitet, lav toksisitet, og god målretting evne5. Blant alle polymer bærere, blokk kopolymerer er en av de mest brukte stoffet leveringssystemer. Block kopolymerer er intensivt studert for sin selv montering eiendom og evner til å danne miceller, mikrosfærer, og nanopartikler i stoffet levering5. Block kopolymerer kan være syntetisert via levende polymerisering eller klikk kjemi metoder.
I 1956, Szwarc et al. hevet temaet levende polymerisering, definere det som en reaksjon uten kjede-Breaking reaksjoner6,7. Siden da har flere teknikker blitt utviklet for å syntetisere polymerer ved hjelp av denne metoden; Dermed er levende polymerisering sett på som en milepæl av polymer vitenskap8. Levende polymerisering kan klassifiseres i levende anioniske polymerisering, levende kationiske polymerisering, og reversibel deaktivering radikal polymerisering (RDRP)9. Living anioniske/kationiske polymerisasjoner har et begrenset anvendelsesområde på grunn av deres strenge reaksjonsforhold10. Kontrollert/levende radikale polymerisering (CRP) har milde reaksjonsbetingelser, praktisk disposisjon, og god avkastning og har dermed vært en stor forsknings fokus de siste årene11. I CRP, aktive forplantning kjeder er reverserbart paddivert i sovende seg å redusere konsentrasjonen av frie radikaler og unngå bimolecular reaksjonen av spre kjeden radikaler. Den tillegg polymerisering kan fortsette bare hvis inaktive sovende overføre kjeder er reverserbart animert i kjeden radikaler. Som en av de mest lovende former for levende radikale polymerisering, reversibel tillegg-fragmentering kjede overføring (RAFT) polymerisering er en metode som gjelder for å gi blokkere polymerer med kontrollert molekylvekt og struktur, smal molekylvekt distribusjon og gjennomføring av funksjonsgrupper12. Nøkkelen til vellykket flåte polymerisering er effekten av kjede overførings midler, vanligvis dithioesters, som har svært høy kjede overføring konstant.
I dette papiret ble en flåte polymerisering metode designet for å forberede BNHEMA-b-APMA Block polymer, tar 4, 4 '-azobis (4-cyanovaleric acid) (ACVA) som en igangsetting agent og 4-cyanopentanoic acid DITHIOBENZOATE (CTP) som en kjede overføring agent. RAFT polymerisering ble brukt to ganger for å innføre BNHEMA i kationiske polymer bærere. Deretter ble Amin gruppene i APMA-kjeden modifisert med metionin og guanidinylation reagens 1-amidinopyrazole-hydrochloride. Å gjøre bruk av positive anklager om guanidinylation reagens og methacrylamide polymer skjelett struktur, mobilnettet opptaket effektiviteten av de oppnådde blokken polymer bærere ble forbedret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. syntese av BNHEMA polymer (PBNHEMA)
- Løs opp 1,87 g av n, n-BIS(2-HYDROXYETHYL) methacrylamide (BNHEMA) i 1 ml destillert vann i en polymerisering flaske.
Merk: polymerisering flasken er en kolbe med en gummipropp og en magnetisk rører. - Løs opp 0,03 g av 4-cyanopentanoic acid dithiobenzoate (CTP) og 0,02 g av 4, 4 '-azobis (4-cyanovalericacid) (ACVA) i 0,5 mL 1, 4-dioxane i et 5 mL beger. Deretter legger du til CTP-og ACVA-løsningen i polymerisering flasken fra trinn 1,1.
- Ventiler reaksjonssystemet i polymerisering flasken med nitrogen via tre fryse-pumpe-tine sykluser.
- I detalj, fryse løsningen i polymerisering flasken ved hjelp av en kondensat felle, fikse polymerisering flasken til jern støtte, og vacuumize og injisere nitrogen i reaksjonsblandingen via en kanal tippet med en nål (#9 nål, indre diameter 0,65 mm, ytre diameter 0,9 mm). Forsegle polymerisering flasken og tine oppløsningen ved romtemperatur i 30 min.
- Gjenta fryse-pumpe-tine sykluser tre ganger.
- Sett polymerisering flasken i et 70 ° c oljebad og la løsningen reagere i 24 timer under nitrogen atmosfæren.
- Chill den polymerisering flasken ved 0 ° c og åpne gummiproppen for å avslutte polymerisering prosessen.
- Forkjøle aceton i a-20 ° c kjøleskap for 2 h og bland det deretter med reaksjons løsningen til trinn 1,5 ved 50:1 (v/v). Etter det, sentrifuger på 8 200 x g for 10 min for å fjerne aceton og samle utfelling.
- For å rense syntetisert PBNHEMA, oppløse den innsamlede utfelling i 2 mL rent vann og bland det med 100 mL forkjøles aceton, i forholdet 1:50 (v/v). Sentrifuger løsningen på 8 200 x g for 10 min og samle utfelling. Gjenta denne prosessen tre ganger.
- Tørk den produserte PBNHEMA med en 50 ° c vakuum tørrere. Når tørket, veie pulveret med en balanse. Beregn avkastnings raten i henhold til Formel 1.
1
Merk: i dette eksperimentet, avkastningen innhentet var 77,2%.
12. syntese av BNHEMA-b-APMA POLYMER (ba)
- Løs opp 0,96 g av N-(3-aminopropyl) methacrylamide HYDROCHLORIDE (APMA) og 0,93 g PBNHEMA i 5 ml destillert vann i et 10 ml beger.
- Løs opp 0,01 g av 4, 4 '-azobis (4-cyanovaleric acid) (ACVA) i 0,5 mL på 1, 4-dioxane og bland med APMA-PBNHEMA-løsningen fra en del 2,1.
- Overfør blandingen til en polymerisering flaske og ventiler med tørr nitrogen i 1 time.
- Sett den polymerisering flasken i en 70 ° c oljebad og la den reagere i 24 timer under nitrogen atmosfæren.
- Chill den polymerisering flasken ved 0 ° c og åpne gummiproppen for å avslutte polymerisering prosessen.
- Overfør løsningen til kjølt aceton fra trinn 1,6, og deretter sentrifuger løsningen ved 8 200 x g i 10 min for å fremskynde ba.
- Oppløse BA i 2 mL destillert vann og utløse polymer i kjølt aceton. Gjenta tre ganger.
- Tørk den produserte BA i en 50 ° c vakuum tørrere og veie det oppnådde pulveret. Beregn avkastnings raten i henhold til formel 2.
Merk: i dette eksperimentet ble avkastnings raten beregnet til å være 82,0%.
3. Bestem muldvarp-prosenten av APMA i BA-kopolymer via ninhydrin-metoden
Merk: Spektrofotometri brukes til å bestemme innholdet av multikomponent aminosyrer. Prinsippet er en farge reaksjon av ninhydrin og aminosyre hvor absorbansen er korrelert med aminosyren innholdet til en viss grad13,14.
- Løs opp 5 g ninhydrin i 125 mL kokende destillert vann. Også oppløse 5 g vitamin C i 250 mL varmt destillert vann. Tilsett 250 mL vitamin C-oppløsning dråpevis til den ninhydrin løsningen under magnetisk omrøring. Fortsett å røre i 15 min og deretter chill reaksjons løsningen i et 4 ° c kjøleskap.
- Ta løsningen ut av kjøleskapet og Filtrer ved å suge ved hjelp av en Buchner trakt for å oppnå redusert ninhydrin. Samle utfelling og bevare den i en fosfor saltpetersyre dehydrator.
- Løs opp 85 mg ninhydrin og 15 mg redusert ninhydrin i 10 mL etylen glykol dipropylenglykolmetyleter Eter for å klargjøre ninhydrin-løsningen.
Merk: Ninhydrin-coloring løsning kan reagere med α-amino i APMA og danner en fiolett sammensatt med en struktur som beskrevet i en tidligere studie15. - Fortynne 1 mL av 0, 1, 10, 100, 1 000 mg/mL APMA monomer løsninger med 1 mL acetate buffer (2 M, pH 5,4), og deretter tilsett 1 mL ninhydrin-farge løsning, henholdsvis.
- Varm blandingen i 15 min i et kokende vannbad og Avkjøl dem ved hjelp av rennende vann. La løsningene sitte i 5-10 min og fortynne dem med 3 mL 60% etanol og bland dem grundig. Mål absorbansen ved 570 NM ved hjelp av en spektrofotometer og tegn standardkurven (ligning 3).
Merk: formel 3 er avledet fra den lineære tilpasningen av absorbansen ved 570 NM versus APMA-konsentrasjonen. - Løs opp 0,01 g BA i 1 mL destillert vann; Tilsett 1 mL av acetate buffer (2 M, pH 5,4) og 1 mL ninhydrin-coloring løsning. Beregn molar innholdet i APMA i henhold til absorbansen ved 570 NM.
5
Merk: beregningsformlene er som følger (ligninger 3-6).
5
4. syntese av metionin podet BA polymer (mBA)
- Oppløse 8,9 mg av FOMC-metionin i 5 mL DMSO i en utvinning kolbe.
- Tilsett 6,92 mg 1-etanol-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDCl) og 4,86 mg 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) til gjenvinning kolbe og reagerer på 0 ° c for 0,5 h.
- Løs opp 2,59 g BA i 5 mL DMSO-oppløsning og tilsett deretter 50 μL av trimetylamin; legge denne løsningen dråpevis til utvinning kolbe (trinn 4,2) og la løsningen reagere for 0,5 h ved romtemperatur.
- Dialyze fjerne DMSO og trimetylamin fra BA-løsningen i trinn 4,3 ved hjelp av en pose med dialyse (MWCO 10 kDa) i et 2 L beger for 24 timer; erstatte deionisert vann hver 6 h.
- Frys-tørk innhentet mBA og veie å beregne yield rate i henhold til ligningen 7.
Merk: i dette tilfellet var avkastningen rate bestemt på å være 71%. - Kvantifisere NH2 som inneholder mBA ved å måle absorbansen på 570 NM for å beregne mengden av podet metionin. Beregn molar innholdet i metionin i henhold til formel 8.
5. syntese av guanidinated og metionin bøyd BNHEMA-b-APMA polymer (mBG)
Merk: tre forskjellige mBA1, mBA2 og mBA3 kopolymer ble syntetisert. mBA3-kopolymer brukes som et eksempel i følgende trinn.
- Oppløse mBA3 som inneholder 60 mikromol av aminosyre i 5 mL rent vann.
Merk: innholdet i amino-gruppen ble kvantifisert ved hjelp av ninhydrin-metoden som beskrevet i trinn 3,5. - Løs opp 40,6 mg (300 mikromol) av guanidinylation reagens 1-amidinopyrazole hydrochloride i mBA-løsninger.
- Juster pH til 9,0 med den mettede løsningen av natrium og la den stabilisere seg i 24 timer ved romtemperatur.
- Dialyze mBG-produktet med deionisert vann ved hjelp av en pose med dialyse i et beger (MWCO 10 kDa, 2 L) og Bevar den i form av et fryse tørt pulver.
Prosentsatsen for avkastning ble beregnet til å være 85% via formel 8.
8 - Løs opp mBG-pulveret i D2O i NMR-rørene og karakterisere det med 1h kjernefysisk magnetisk resonans SPEKTROSKOPI (1H NMR)16.
86. tilberedning og karakterisering av mBG/pDNA polyplexes
- Løs opp 50 μg av pDNA i 50 μL av RNase/DNase vann.
- Løs opp 1 mg mBG-kopolymerer i 1 mL RNase/DNase vann.
- Legg til mBG-kopolymerer løsning direkte i pDNA-løsningen i henhold til forskjellige fôrings forhold, det vil si forskjellige N/P-forhold (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 og 32:1).
Merk: N/P-forhold er definert som molar forholdet mellom guaniniumtiocyanat gruppen i polymer og fosfat gruppen i pDNA, nemlig molar forholdet mellom GPMA-kjeden i polymer og mononucleotide i pDNA. N/P-forholdet beregnes i henhold til de molekylære vektene av amino nitrogen (N) i mBG og fosfat gruppe (P) i pDNA. - Bland løsningene med en Vortex mikser og la dem stå i 30 minutter ved romtemperatur. Etter det sprer du blandingen i fosfat buffer løsning (PBS, pH 7,4) og bevarer de oppnådde mBG/pDNA polyplexes ved 4 ° c for oppfølgingseksperimenter.
Merk: den gjennomsnittlige partikkelstørrelsen og Zeta-potensialet til mBG og komplekser ble oppdaget ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS)17. - Fortynne 10 μL av mBG/pDNA polyplex løsninger med 1 mL PBS (pH 7,4) i DLS og Zeta potensielle sample celler.
Merk: partikkelstørrelse og Zeta potensiell deteksjon ble utført tre ganger og et gjennomsnitt av de tre verdiene ble tatt.
7. Elektroforetiske retardasjon eksperiment av mBG/pDNA polyplexes
Merk: en Elektroforetiske retardasjon eksperimentet ble gjennomført for å fastslå minimum kostnad ratio.
- Ta fem grupper av mBG/pDNA-polyplexes med forskjellige N/P-forhold (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 og 32:1) som inneholder 50 μg av pDNA.
- Legg til 6 ganger laste buffer i mBG/pDNA polyplex prøver til en endelig konsentrasjon på 1x.
- Legg løsningene til 1,5% agarose gels og kjøre gel på 90 mV i 15 min, med pDNA som kontroll.
- Ta bilder av gels ved hjelp av en gel Imager.
8. cytotoksisitet av mBG/pDNA polyplexes
- Seed MCF-7 celler inn i 96-brønn plater i en tetthet på 104 celler per brønn. Deretter kultur cellene for 12 h bruker DMEM medium (10% FBS og 1% antibiotika) i en fuktet 37 ° c inkubator leveres med 5% CO2.
- Erstatt kulturen medium med antibiotika-fri DMEM kultur medier som inneholder 10% fosterets storfe serum (FBS) og mBG/pDNA polyplexes av ulike kostnader prosenter (N/P 4, 8, 16, og 32, N = 6) for 6 h, tar celler lagt med like volumer av PBS løsning som kontroll. Deretter erstatter kultur mediet med 150 μL av fersk 1640 medium og videre kultur cellene for 24 h.
- Tilsett 5 mg/mL 3-(4, 5-dimethylthiazole-2-YL)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) løsning (20 μL/brønn) til 96-brønn plater og videre kultur cellene for 4 h.
- Fjern løsningen og tilsett 150 μL av DMSO til hver brønn og riste 96-brønn plater 30 sek.
- Mål det optisk tettheten (OD) for 490 NM med en mikroplate leseren å viser cellen levedyktighet. Beregn prosenten for levedyktigheten i cellen i henhold til formel 9.
Celle levedyktighet%
= (9)
= (9)9. transfeksjoner effektivitet av mBG/GFP-pDNA polyplexes
- Løs opp 50 μg av pDNA som inneholder reporteren genet grønt fluorescerende protein (GFP) pDNA (GFP-pDNA) i 50 μL av RNase/DNase-fritt vann. Deretter oppløses 1 mg av mBG-kopolymerer i 1 mL RNase/DNase-fritt vann. Bland pDNA-og mBG-løsningen med et lade forhold (N/P) på 1:1, 4:1, 8:1, 16:1 og 32:1 og ruge i 30 minutter ved romtemperatur. Spre mBG/GFP-pDNA polyplexes løsning ved hjelp av ultralydbølger (30 s) og oppbevar ved 4 ° c for oppfølgingseksperimenter.
Merk: N/P-forholdet beregnes i henhold til de molekylære vektene av amino nitrogen (N) i mBG og fosfat gruppe (P) i pDNA. - Seed MCF-7 celler i en tetthet på 2 × 105 celler per brønn i en 6-brønn plate og kultur dem ved 37 ° c og 5% co2 i en fuktet inkubator for 12 h.
- Erstatt kultur mediet med det ferske kultur mediet med mBG/GFP-pDNA-polyplexes med forskjellige N/P-forhold (4, 8, 16 og 32) i 6 timer.
- Bytt medium med 2 mL fersk RPMI1640 medium og kultur for 48 h.
- Samle cellene og oppdage den grønne fluorescens med en strømnings flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BNHEMA ble matet i henhold til den objektive graden av polymerisering vist i tabell 1; syntese av mBG er vist i figur 1. For det første, BNHEMA homo ble utarbeidet via reversibel tillegg-fragmentering Chain Transfer (RAFT) metoden i vann-dioxane system, ved hjelp av 4-cyanopentanoic acid dithiobenzoate som en kjede overføring agent. For det andre ble PBNHEMA brukt som en kjede overføringsagent for å forberede BNHEMA-b-APMA Block polymer. APMA monomer ble matet i henhold til den objektive graden av polymerisering vist i tabell 1. Gel gjennomtrengning kromatografi (GPC) ble utført for å påvise Molekylvekten av BA med ulike fôring forhold (tabell 1). Den faktiske molar innhold av APMA kjeder i BA med ulike fôring prosenter ble oppdaget via ninhydrin metode (tabell 1). Ifølge våre tidligere studie5, vi brukte mBG3 i denne studien fordi den har den høyeste APMA innhold. Til slutt ble metionin podet til APMA-kjeden, og de resterende Amin gruppene ble fullstendig guanidinylated for å forberede mBG. Figur 2 er 1H NMR data av mBG. Den gjennomsnittlige partikkelstørrelsen og Zeta-potensialet i mBG/pDNA-polyplexes var 124 NM og + 15,7 mV, på et N/P-forhold på 16 (Figur 3).
Elektroforetiske retardasjon er en rask og enkel teknikk som innebærer separasjon av ubundet pDNA og kopolymer/pDNA polyplex basert på forskjeller i deres Elektroforetiske mobilities i agarose gels. Den ubundne pDNA bandet kan bevege seg i agarose gel under påvirkning av det elektriske feltet. I Elektroforetiske retardasjon eksperimentet (Figur 4), pDNA (med et N/P-forhold på 0) kan bevege seg uten tilbakeholdenhet i agarose gel og ble observert som en stripe i gel Imager. Når pDNA er complexed med mBG, bevegelsen av pDNA er tilbakestående og senere, er lysstyrken i bandet redusert. Figur 4 viser at mBG kan være fullstendig sammensatt av PDNA når N/P er høyere enn 4.
Cytotoksisitet av mBG/pDNA-polyplexes ble målt ved hjelp av standard MTT-analysen (figur 5). Resultatene viser at mBG/pDNA-polyplexes har åpenbart lavere cytotoksisitet enn PEI/pDNA-polyplexes ved N/P-forholdene på 4, 8, 16 og 32 i MCF-7-cellelinjen (P < 0,05, N = 3, enveis ANOVA). Videre øker cytotoksisitet til mBG/pDNA polyplexes med økt N/P-forhold. Økningen av cytotoksisitet av mBG/pDNA-polyplexes med økt N/P er et resultat av den positivt ladet GPMA-komponenten. mBG/pDNA polyplexes viste mindre cytotoksisitet enn PEI/pDNA polyplexes, som kan tilskrives tilstedeværelsen av BNHEMA i kopolymerer skjerming overflaten ansvaret for kationiske polymerer.
N/P-forholdet som brukes i pDNA transfeksjoner-eksperimentet, ble valgt i henhold til de cytotoksisitet resultatene. Som vist i figur 6, ble de transfeksjoner evnene til MBG1, MBG2 og mBG3 sammenlignet ved å måle GFP fluorescens intensitet og resultatene viste at mBG3 er den optimale gen bærer. Selv PEI/pDNA polyplexes med en N/P ratio på 8 har lignende transfeksjoner effektivitet som mBG3/pDNA polyplexes med en N/P ratio på 32, har PEI høyere cytotoksisitet og har ingen funksjoner som narkotika lasting, som begrenser dens anvendelse i biomedisinsk feltet. Resultatene viste at økningen av AMPA-innhold er nøkkelen til å forbedre transfeksjoner effektivitet i mBG-kopolymer. Som vi nevnte i en tidligere studie5, celle gjennomtrengende peptider (annonseinnholdspartnere) er 9-35 mer kationiske eller amfipatiske peptider med en evne til å trenge gjennom cellemembranen. Den guaniniumtiocyanat gruppen er en kationiske CPP som kan bøyes inn i en polymer for å forbedre transfeksjoner av polymer/pDNA polyplex gjennom en protein-uavhengig transmembrane veien. Derfor integrerer mBG-kopolymer fordeler knyttet til guaniniumtiocyanat grupper for celle penetrasjon og BNHEMA-komponenten for skjerming, og viser et stort potensial for effektiv gen levering.
| Eksempel | BHEMA-b-APMA | Mw | Pdi | |
| Teoretisk verdi av APMA-innhold (%) | Faktisk verdi av APMA-innhold (%) | |||
| BNHEMA90-b-APMA30(BA1) | 25 | 21 | 16200 | 1,25 |
| BNHEMA90-b-APMA60(BA2) | 40 prosent | 37 prosent | 20900 | 1,21 |
| BNHEMA90-b-APMA90(Ba3) | 50 prosent | 52 prosent | 27200 | 1,25 |
Tabell 1: sammensetningen av BNHEMA-b-APMA by RAFT polymerisering.
Figur 1: skjematisk syntese prosedyre av mBG. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: 1H NMR Spectra av mBG i D2O. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: partikkelstørrelse og Zeta-potensiale i polyplexes.
(A) partikkelstørrelsen på ba/pDNA. (B) partikkelstørrelsen på MBG/pDNA. (C) Zeta potensialet i ba/pDNA. (D) Zeta-potensiale for MBG/pDNA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Agarose gel elektroforese bilder av BA3
(a) , mBA3 (b) og mBG3 (c) polyplexes ved forskjellige lade prosenter.
Figur 5: cytotoksisitet av mBG/pDNA-polyplexes ved forskjellige N/P-forhold i MCF7 cellelinje.
PEI/pDNA polyplex ble brukt som kontroll. Dataene ble vist som gjennomsnittet ± SD (n = 3). * indikerer p < 0,05 i forhold til PEI-gruppen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Transfeksjoner effektiviteten til mBG/pDNA-polyplexes ved N/P-forholdet mellom 4, 8, 16 og 32 ble målt ved strømnings flowcytometer.
Dataene ble vist som gjennomsnittet ± SD (n = 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien introduserte en rekke BNHEMA-b-APMA blokk polymer kationiske gen bærere. Disse blokk polymerer ble syntetisert via reversibel tillegg-fragmentering kjede overføring (RAFT)-metoden. Det hydrofile segmentet BNHEMA ble innført for å forbedre løselighet. Metionin og guaniniumtiocyanat grupper ble modifisert for å forbedre målet evne og transfeksjoner effektivitet5. APMA kjede innhold økte og guanidinylation i mBG-kopolymer reduserte partikkelstørrelsen til mBG/pDNA-polyplexes. Partikkelstørrelsen og overflate potensialet gjør komplekset lett å krysse cellemembranen og gjelder for transfeksjoner. De kritiske punktene i eksperimentet ligger i strengt kontrollere molar forholdet mellom BNHEMA monomer og CTP til 45:1, molar forholdet mellom CTP og ACVA til 2:1, og temperaturen til 70 ° c. Under renseprosessen må Volumforholdet mellom forkjøles aceton og polymer oppløsning være høyere enn 50:1.
Med samme N/P-verdi, sammen med økningen av andelen av APMA-kjeden, reduseres partikkelstørrelsen til mBG/pDNA-polyplexes. Disse resultatene tyder på at APMA kjede innhold øker og guanidinylation kan redusere partikkelstørrelsen. Partikkelstørrelsen og overflate potensialet gjør komplekset lett å transportere over cellemembranen og gjelder for transfeksjoner. Gel elektroforese ble brukt til å undersøke forholdet mellom kompleks og N/P-forhold, og dataene viste at minimum N/P er 4. Denne studien vil gi verdifulle grunnleggende data for videre studier av kationiske gen bærere. Imidlertid er BNHEMA-b-APMA ikke lett degradert og dens metabolisme prosess in vivo er ikke klart nok. Derfor er klinisk anvendelse fortsatt en stor utfordring for kationiske polymer gen bærere.
Høy effektivitet og lav toksisitet av gen bærere er de nødvendige forutsetningene for deres klinisk bruk. Kationiske polymer gen vektorer har fordeler med god stabilitet og ingen immunogenisitet og de kan være forberedt og modifisert enkelt.
RAFT-polymerisering er mye brukt i polymerisering av monomerer, inkludert styren, akrylat, akrylnitril og akrylamid. Denne typen polymerisering prosessen kan utføres ved lav temperatur. Også, kan RAFT polymerisering brukes til å syntetisere polymerer av fine strukturer. RAFT polymerisering beskrevet i denne protokollen regnes som en av de mest lovende mulige metoder for utarbeidelse av biomedisinsk polymerer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne bekrefter at det er ingen interessekonflikt med noen finansiell organisasjon om materialet omtalt i denne artikkelen.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av den nasjonale nøkkel forskning og utviklings program i Kina (nr. 2016YFC0905900), National Natural Science Foundation i Kina (NOS 81801827, 81872365), Basic Research program av Jiangsu Province (Natural Science Foundation, nr. BK20181086), og Jiangsu Cancer Hospital Scientific Research Fund (nr. ZK201605).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-hydroxybenzotriazole | Macklin Biochemical Co., Ltd,China | H810970 | ≥97.0% |
| 1,4-dioxane | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10008918 | AR |
| 1-amidinopyrazole Hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | A107935 | 98% |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | E106172 | AR |
| 4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) | Aladdin Co., Ltd., China | A106307 | Analytical reagent (AR) |
| 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid | Aladdin Co., Ltd., China | C132316 | >97%(HPLC) |
| Acetate | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 81014818 | AR |
| Acetone | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10000418 | AR |
| Agarose | Aladdin Co., Ltd., China | A118881 | High resolution |
| Ascorbic acid | Aladdin Co., Ltd., China | A103533 | AR |
| DMSO | Aladdin Co., Ltd., China | D103272 | AR |
| Ethylene glycol | Aladdin Co., Ltd., China | E103319 | AR |
| N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | N129096 | ≥98.0%(HPLC) |
| N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide | ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China | CF259748 | ≥98.0%(HPLC) |
| Ninhydrin | Aladdin Co., Ltd., China | N105629 | AR |
| PBS buffer | Aladdin Co., Ltd., China | P196986 | pH 7.4 |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | pDNA-EGFP | pDNA-EGFP |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | Pdna | pDNA |
| Sodium carbonate decahydrate | Aladdin Co., Ltd., China | S112589 | AR |
| Trimethylamine | Aladdin Co., Ltd., China | T103285 | AR |
References
- Flotte, T. R. Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead. Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).
- Huang, W., et al. Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).
- Wu, Y., et al. Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles. Colloids & Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).
- Quader, S., Kataoka, K. Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy. Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).
- Wu, Y., et al. Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR. Journal of Gene Medicine. 19, e2969 (2017).
- Szwarc, M. ‘Living’ Polymers. Nature. 178, 168-169 (1956).
- Szwarc, M., Rembaum, A. Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer. Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).
- Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. Living supramolecular polymerization. Science. 349, 241 (2015).
- Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization. European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).
- Wu, W., Wang, W., Li, J. Star polymers: Advances in biomedical applications. Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).
- Boyer, C., et al. Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications. Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).
- Keddie, D. J. A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization. Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).
- Wu, Y., et al. Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression. Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).
- Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).
- Friedman, M. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).
- Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).
- Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles. Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).
