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Chemistry

मेथियोनीन कार्यात्मक जैव संगत ब्लॉक कोपॉलीमर लक्षित प्लास्मिड डीएनए डिलिवरी के लिए

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/58527
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 2, 3, 1, 2
1Research Center of Clinical Oncology, Jiangsu Cancer Hospital & Jiangsu Institute of Cancer Research & Nanjing Medical University Affiliated Cancer Hospital, 2Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 3School of Clinical Medicine, Xuzhou Medical University
* These authors contributed equally

Summary

यह काम विपर्यायीय योग-खंडन श्रृंखला स्थानांतरण (RAFT) विधि के माध्यम से methionine functionalized जैव संगत ब्लॉक copolymers (mBG) की तैयारी प्रस्तुत करता है। प्राप्त mBG की प्लाज्मिड डीएनए जटिल क्षमता और उनके transfection दक्षता भी जांच की गई. RAFT विधि विशेष कार्यात्मक समूहों युक्त monomers बहुलकीकरण के लिए बहुत फायदेमंद है।

Abstract

प्रतिवर्ती जोड़-विखंडन श्रृंखला स्थानांतरण (RAFT) बहुलकीकरण कट्टरपंथी बहुलकीकरण और रहने वाले बहुलकीकरण के लाभों को एकीकृत करता है। यह काम RAFT बहुलकीकरण के माध्यम से methionine कार्यात्मक जैव संगत ब्लॉक copolymers की तैयारी प्रस्तुत करता है. सबसे पहले, N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide-b-N-(3-aminopropyl)methacrylamide (BNHEMA-b -APMA, BA) RAFT बहुलकीकरण के माध्यम से संश्लेषित किया गया था 4,4'-azobis(4-cyanovaleric एसिड) (ACVA) एक के रूप में श्रृंखला स्थानांतरण एजेंट के रूप में एजेंट और 4-cyanopentanoic एसिड dithiobenzoate (सीटीपी) की शुरुआत। बाद में, N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide-b-N- (3-guanidinopropyl)मेथाक्रिलमाइड (मेथियोनीन कलम ित BNHEMA-b-GPMA, mBG) एपीएमए में एमिन समूहों को संशोधित करके तैयार किया गया था मेथियोनीन और गुनिडीन समूहों. ब्लॉक पॉलिमर, mBG1, mBG2, और mBG3 के तीन प्रकार, तुलना के लिए संश्लेषित किया गया. एक ninhydrin प्रतिक्रिया APMA सामग्री की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था; mBG1, mBG2, और mBG3 क्रमशः 21%, 37%, और APMA के 52% था. जेल permeation क्रोमैटोग्राफी (GPC) परिणामों से पता चला कि बीए copolymers 16,200 (BA1), 20,900 (BA2) के आणविक वजन के होते हैं, और 27,200 (BA3) जी / प्राप्त ब्लॉक सहबहुलक जीन वाहकों की प्लाज्मिड डीएनए (पीडीएनए) जटिल क्षमता की भी जांच की गई। आवेश अनुपात 8, 16 और 4 थे जब पीडीएनए क्रमशः mBG1, mBG2, mBG3 के साथ पूरी तरह से जटिल था। जब mBG/pDNA बहुप्लैक्स का N/P अनुपात 1 से अधिक था, तो mBG की जीटा क्षमता सकारात्मक थी। 16 और 32 के बीच N/P अनुपात में, mBG/pDNA बहुप्लेक्स का औसत कण आकार 100-200 दउ के बीच था। कुल मिलाकर, यह काम ब्लॉक copolymer वाहक संश्लेषण के लिए एक सरल और सुविधाजनक प्रोटोकॉल दिखाता है.

Introduction

हाल के वर्षों में, सभी प्रकार के रोगों के उपचार के लिएन्यूक्लिक एसिड ों की चिकित्सीय डिलीवरी के लिए जीन थेरेपी का पता चला है। प्लाज्मिड डीएनए (पीडीएनए) और छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिएनआरए) सहित जीन दवाओं का विकास दवा वितरण प्रणाली (डीडीएस)2की स्थिरता और दक्षता पर निर्भर करता है। सभी DDS के अलावा, धनायनी बहुलक वाहक अच्छी स्थिरता, कम इम्यूनोजेनिकता, और सुगम तैयारी और संशोधन के फायदे हैं, जो धनायनिक बहुलक वाहक व्यापक आवेदन संभावनाओं3,4दे . biomedicine में व्यावहारिक अनुप्रयोगों के लिए, शोधकर्ताओं को उच्च दक्षता, कम विषाक्तता, और अच्छा लक्ष्यीकरण क्षमता5के साथ एक cationic बहुलक वाहक खोजना होगा. सभी बहुलक वाहकों में, ब्लॉक सहबहुलक सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली औषध वितरण प्रणालियों में से एक हैं। ब्लॉक सहबहुलकों को दवा वितरण5में मिसेल, माइक्रोस्बिलऔर नैनोकणों के रूप में अपने आत्म-असेम्बली गुण और क्षमताओं के लिए गहन अध्ययन किया जाता है। ब्लॉक copolymers रहने वाले बहुलकीकरण के माध्यम से संश्लेषित किया जा सकता है या रसायन विज्ञान के तरीकों पर क्लिक करें.

1956 में, Szwarc एट अल. रहने वाले बहुलकीकरण के विषय उठाया, यह श्रृंखला तोड़ने प्रतिक्रियाओं के बिना एक प्रतिक्रिया के रूप में परिभाषित6,7. तब से, कई तकनीकों को इस विधि का उपयोग कर पॉलिमर संश्लेषित करने के लिए विकसित किया गया था; इस प्रकार, जीवित बहुलकीकरण बहुलक विज्ञान8के एक मील का पत्थर के रूप में देखा जाता है। जीवित बहुलकीकरण को जीवीय एनिओनिक बहुलकीकरण, जीवित धनात्मक बहुलकीकरण, और उत्क्रमणीय विसक्रियण मूलक बहुलकीकरण (आरडीआरपी)9में वर्गीकृत किया जा सकता है। जीवाण्ण ीय बहुलकीकरणों में उनकी कड़ी प्रतिक्रिया शर्तों के कारण आवेदन की सीमित गुंजाइशहोतीहै। नियंत्रित /जीवित कट्टरपंथी बहुलकीकरण (सीआरपी) में हल्की प्रतिक्रिया की स्थिति, सुविधाजनक स्वभाव, और अच्छी उपज होती है और इस प्रकार हाल के वर्षों में एक प्रमुख अनुसंधान ध्यान केंद्रित किया गया है11. सीआरपी में, सक्रिय संचरण शृंखलाएं मुक्त कणों की सांद्रता को कम करने और श्रृंखला के कणों के प्रचार की द्वि-अणुक अभिक्रिया से बचने के लिए निष्क्रिय लोगों में उत्क्रमणीय होती हैं। इसके अलावा बहुलकीकरण केवल तभी जारी रह सकता है जब निष्क्रिय निष्क्रिय प्रचार श्रृंखलाओं को पीछे की ओर श्रृंखला के कणों में एनिमेटेड किया जाता है। कट्टरपंथी बहुलकीकरण जीने का सबसे होनहार रूपों में से एक के रूप में, प्रतिवर्ती इसके अलावा-फ़्रेग्मेंटेशन श्रृंखला हस्तांतरण (RAFT) बहुलकीकरण नियंत्रित आणविक वजन और संरचना, संकीर्ण आणविक वजन के साथ ब्लॉक पॉलिमर उपज के लिए लागू एक विधि है वितरण, और कार्यात्मक समूहों को ले जाने12| सफल RAFT बहुलकन की कुंजी श्रृंखला हस्तांतरण एजेंटों, आमतौर पर dithioesters, जो बहुत उच्च श्रृंखला हस्तांतरण स्थिरक के अधिकारी का प्रभाव है।

इस पेपर में, एक RAFT बहुलकीकरण विधिBNHEMA-b-APMA ब्लॉक बहुलक तैयार करने के लिए डिजाइन किया गया था, ले 4,4'-azobis (4-cyanovaleric एसिड) (ACVA) एक प्रारंभिक एजेंट के रूप में और 4-cyanopentanoic एसिड dithiobenzoate (CTP) एक श्रृंखला हस्तांतरण एजेंट के रूप में. RAFT बहुलकन दो बार cationic बहुलक वाहक में BNHEMA परिचय करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. बाद में, APMA श्रृंखला में amine समूहों methionine और guanidinylation अभिकर्मक 1-amidinopyrazole हाइड्रोक्लोराइड के साथ संशोधित किया गया. ग्वानिडियलेशन अभिकर्मक और methacrylamide बहुलक कंकाल संरचना के सकारात्मक आरोपों का उपयोग करते हुए, प्राप्त ब्लॉक बहुलक वाहक के सेलुलर तेज दक्षता में सुधार किया गया था।

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Protocol

1. BNHEMA बहुलक का संश्लेषण (PBNHEMA)

  1. 1ण्87 ह, छ-बिस्(2-हाइड्रोक्सीएथिल)मेथैक्रिलमाइड (बीएनएचए) को बहुलकीकरण बोतल में आसुत जल के 1 एमएल में भंग करें।
    नोट: बहुलकीकरण बोतल एक रबर डाट और एक चुंबकीय उत्तेजक के साथ एक दौर नीचे फ्लास्क है।
  2. भंग 0.03 ग्राम 4-cyanopentanoic एसिड dithiobenzoate (CTP) और 0.02 ग्राम के 4,4'-azobis (4-cyanovalericacid ) (ACVA) के 0.5 एमएल में 1,4-dioxane के एक 5 एमएल बीकर में. उसके बाद, CTP और ACVA समाधान चरण 1.1 से बहुलकीकरण बोतल के लिए जोड़ें।
  3. तीन फ्रीज-पंप-थॉ व चक्र के माध्यम से नाइट्रोजन के साथ बहुलकीकरण बोतल में प्रतिक्रिया प्रणाली को हवादार करें।
    1. विस्तार से, एक संघनित जाल का उपयोग कर बहुलकीकरण बोतल में समाधान फ्रीज, लोहे के समर्थन के लिए बहुलकीकरण की बोतल को ठीक, और vacuumize और एक सुई के साथ tipped एक नाली के माध्यम से प्रतिक्रिया मिश्रण में नाइट्रोजन इंजेक्ट (#9 सुई, आंतरिक व्यास 0.65 मिमी, बाहरी व्यास 0.9 मिमी). बहुलकीकरण की बोतल को सील करें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर समाधान को थपथपाएं।
    2. फ्रीज-पंप-थॉव चक्र को तीन बार दोहराएं।
  4. बहुलकन बोतल को 70 डिग्री सेल्सियस तेल-स्नान में डाल दें तथा विलयन को नाइट्रोजन वायुमंडल के नीचे 24 ज के लिए अभिक्रिया करने दें।
  5. 0 डिग्री सेल्सियस पर बहुलकीकरण बोतल ठंडा और बहुलकीकरण प्रक्रिया को समाप्त करने के लिए रबर डाट खोलें।
  6. 2 h के लिए एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में पूर्व शांत एसीटोन और फिर यह कदम 1.5 की प्रतिक्रिया समाधान के साथ मिश्रण 50:1 (v/v) पर. उसके बाद, एसीटोन को हटाने और वेग इकट्ठा करने के लिए 10 मिनट के लिए 8,200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  7. संश्लेषित PBNHEMA को शुद्ध करने के लिए, शुद्ध पानी के 2 एमएल में एकत्र वेग भंग और फिर यह precooled एसीटोन के 100 एमएल के साथ मिश्रण, 1:50 के अनुपात में (v/ 10 मिनट के लिए 8,200 x ग्राम पर समाधान centrifuge और वेग इकट्ठा. इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएँ.
  8. 50 डिग्री सेल्सियस वैक्यूम सुखाने का उपयोग कर के उत्पादन PBNHEMA सूखी. एक बार सूख, एक संतुलन के साथ पाउडर वजन. समीकरण 1 के अनुसार उपज दर की गणना कीजिए।
    Equation 1(1)
    नोट: इस प्रयोग में प्राप्त उपज 77.2% थी।

2. BNHEMA का संश्लेषण-बी-APMA बहुलक (बीए)

  1. 0.96 ग्राम एन-(3-एमिनोप्रोपिल)मेथाक्रिलमाइड हाइड्रोक्लोराइड (एपीएमए) और 0.93 ग्राम पीबीएनएचए को 10 एमएल बीकर में आसुत जल के 5 एमएल में भंग करें।
  2. 1,4-dioxane के 0.5 एमएल में 4,4'-azobis (4-cyanovaleric एसिड) (ACVA) के 0.01 ग्राम भंग और भाग 2.1 से APMA-PBNHEMA समाधान के साथ मिश्रण.
  3. मिश्रण को एक बहुलकीकरण बोतल में स्थानांतरित करें और 1 ज के लिए सूखी नाइट्रोजन के साथ हवादार करें।
  4. बहुलकन बोतल को 70 डिग्री सेल्सियस तेल-स्नान में डाल कर नाइट्रोजन वायुमंडल के नीचे 24 ज के लिए अभिक्रिया करें।
  5. 0 डिग्री सेल्सियस पर बहुलकीकरण बोतल ठंडा और बहुलकीकरण प्रक्रिया को समाप्त करने के लिए रबर डाट खोलें।
  6. चरण 1.6 से ठंडा एसीटोन के लिए समाधान स्थानांतरण, और फिर 10 मिनट के लिए 8,200 x ग्राम पर समाधान centrifuge बीए वेग.
  7. आसुत पानी के 2 एमएल में बीए भंग और ठंडा एसीटोन में बहुलक वेग. तीन बार दोहराएँ.
  8. 50 डिग्री सेल्सियस वैक्यूम सुखाने में उत्पादित बीए सूखी और प्राप्त पाउडर वजन. समीकरण 2के अनुसार उपज दर की गणना कीजिए।
    Equation 2
    नोट: इस प्रयोग में, उपज दर 82.0% होने की गणना की गई थी।

3. ninhydrin विधि के माध्यम से बीए copolymer में APMA के तिल प्रतिशत का निर्धारण

नोट: स्पेक्ट्रोफोटोमिति बहुघटक अमीनो एसिड की सामग्री को निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. सिद्धांत निनहाइड्रिन और एमिनो अम्ल की एक रंग प्रतिक्रिया है जहां अवशोषण एक निश्चित सीमातक एमिनो एसिड सामग्री के साथ सहसंबद्ध है 13,14.

  1. उबलते आसुत जल के 125 एमएल में 5 ग्राम निनहाइड्रिन को भंग करें। इसके अलावा, गर्म आसुत पानी के 250 एमएल में 5 ग्राम विटामिन सी को भंग करें। चुंबकीय सरगर्मी के तहत निनहाइड्रिन समाधान में 250 एमएल विटामिन सी घोल ड्रॉपवार जोड़ें। 15 मिनट के लिए हलचल जारी है और फिर एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में प्रतिक्रिया समाधान ठंडा.
  2. कम ninhydrin प्राप्त करने के लिए एक Buchner कीप का उपयोग कर चूषण द्वारा फ्रिज और फिल्टर से बाहर समाधान ले लो. वेग लीजिए और यह एक फास्फोरस पेंटऑक्साइड dehydrator में संरक्षित.
  3. निनहाइड्रिन की 85 मिलीग्राम और 15 मिलीग्राम कम निनहाइड्रिन को 10 एमएल एथिलीन ग्लाइकोल मोनोमेथिल ईथर में भंग करें ताकि निनहाइड्रिन-रंग समाधान तैयार किया जा सके।
    नोट: Ninhydrin रंग समाधान APMA में जेड-एमिनो के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं और एक संरचना के साथ एक बैंगनी यौगिक के रूप में एक पिछले अध्ययन में वर्णित के रूप में15.
  4. 0, 1, 10, 10, 100, 1,000 मिलीग्राम/एमएल एपीमा मोनोमर समाधान ों के साथ 1 एमएल एसीटेट बफर (2 एम, पीएच 5.4) के साथ 1 एमएल को पतला करें, और फिर क्रमशः 1 एमएल निहाइड्रिन-रंग समाधान जोड़ें।
  5. उबलते पानी के स्नान में 15 मिनट के लिए मिश्रण गरम करें और फिर उन्हें बहते पानी का उपयोग करके ठंडा करें। समाधान 5-10 मिनट के लिए बैठते हैं और उन्हें 60% एथिल शराब के 3 एमएल के साथ पतला और उन्हें अच्छी तरह से मिश्रण करते हैं। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर 570 एनएम पर अवशोषण को मापने और मानक वक्र आकर्षित (समीकरण 3).
    Equation 3
    नोट: समीकरण 3 570 एनएम बनाम APMA एकाग्रता पर अवशोषण के रैखिक फिटिंग से प्राप्त किया गया था।
  6. आसुत जल के 1 एमएल में बीए के 0.01 ग्राम भंग; एसीटेट बफर (2 एम, पीएच 5.4) और 1 एमएल ninhydrin-रंग समाधान के 1 एमएल जोड़ें। 570 दउ पर अवशोषण के अनुसार APMA की मोलर सामग्री की गणना करें।
    Equation 4
    Equation 5(5)
    Equation 6
    नोट: परिकलन सूत्र निम्नानुसार हैं (समीकरण 3-6)।

4. मेथियोनीन कलम बीए बहुलक (mBA) का संश्लेषण

  1. एक वसूली फ्लास्क में DMSO के 5 एमएल में Fomc-Methionine की 8.9 मिलीग्राम भंग.
  2. जोड़ें 6.92 मिलीग्राम 1-एथिल-3-(3-dimethylaminopropyl ) carbodiimide हाइड्रोक्लोराइड (EDCl) और 4.86 मिलीग्राम 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) वसूली फ्लास्क के लिए और 0.5 एच के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया.
  3. DMSO समाधान के 5 एमएल में बीए के 2.59 ग्राम भंग करें और फिर ट्राइमेथिलामाइन के 50 डिग्री एल जोड़ें; वसूली फ्लास्क (चरण 4.2) के लिए इस समाधान dropwise जोड़ें और समाधान कमरे के तापमान पर 0.5 एच के लिए प्रतिक्रिया करते हैं।
  4. डायलीज 24 ज के लिए एक 2 एल बीकर में एक डायलिसिस बैग (MWCO 10 केडीए) का उपयोग कर चरण 4.3 में बीए समाधान से DMSO और trimethylamine को दूर करने के लिए; deionized पानी की जगह हर 6 ज.
  5. प्राप्त MBA फ्रीज-सूखी और समीकरण 7के अनुसार उपज दर की गणना करने के लिए वजन।
    Equation 7
    नोट: इस मामले में, उपज दर 71% होना निर्धारित किया गया था।
  6. 570 एनएम पर अवशोषण को मापने के द्वारा mBA युक्त एनएच2 की मात्रा को कलम युक्त methionine की राशि की गणना करने के लिए परिमाणित करें। समीकरण 8के अनुसार मेथियोनीन की मोलर सामग्री की गणना करें।
    Equation 8

5. ग्वानिनेटेड और मेथियोनिन संयुग्मी BNHEMA-बी-एपीएमए बहुलक (mBG) का संश्लेषण

नोट: तीन अलग MBA1, MBA2 और MBA3 copolymer संश्लेषित किया गया. MBA3 सहबहुलक निम्न चरणों में एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है।

  1. शुद्ध जल के 5 एमएल में एमबीए3 को 60 डिग्री सेल्सियस अमीनो समूह से विनिविष्ट करें।
    नोट: एमिनो समूह सामग्री के रूप में चरण 3.5 में वर्णित ninhydrin विधि का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया गया था.
  2. एमबीए समाधान में ग्वानिडियलेशन अभिकर्मक 1-एडिनिनोपिराज़ोल हाइड्रोक्लोराइड के 40.6 मिलीग्राम (300 डिग्रीमोल) को भंग करें।
  3. सोडियम कार्बोनेट के संतृप्त विलयन के साथ पीएच को 9.0 तक समायोजित करें और इसे कमरे के तापमान पर 24 ज के लिए स्थिर करें।
  4. एक बीकर (MWCO 10 kDa, 2 L) में एक डायलिसिस बैग का उपयोग कर deionized पानी के साथ mBG उत्पाद dialyze और यह एक फ्रीज सूखे पाउडर के रूप में संरक्षित.
    समीकरण 8के माध्यम से उपज प्रतिशत 85% होने की गणना की गई .
    Equation 9(8)
  5. एनएमआर ट्यूबों में डी2ओ में एम बीजी पाउडर को भंग करें और इसे 1एच परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (1एच एनएमआर )16का उपयोग करके इसकी विशेषता बनाते हैं।

6. MBG/PDNA बहुप्लेक्स की तैयारी और विशेषता

  1. 50 डिग्री सेल्सियस आरएनसे/डीएनएस-मुक्त जल में 50 डिग्री ग्राम पीडीएनए को भंग करें।
  2. 1 एमएल आरनेस/DNase-मुक्त जल में 1 मिलीग्राम mBG copolymers भंग करें।
  3. MBG copolymers समाधान सीधे pDNA समाधान में भिन्न खिला अनुपात के अनुसार जोड़ें, अर्थात्, भिन्न N/P अनुपात (1:1, 4:1, 8:1, 16:1, और 32:1)।
    Note: N/P अनुपात बहुलक में ग्वानिडीन समूह के मोलर अनुपात और pDNA में फॉस्फेट समूह के रूप में परिभाषित किया गया है, अर्थात् बहुलक में जीपीएमए श्रृंखला के मोलर अनुपात और pDNA में mononucleotide. छ/च अनुपात की गणना एमिनो नाइट्रोजन (छ) के आण्विक भारों के अनुसार चदना में एमबीजी तथा फॉस्फेट समूह (च) में की जाती है।
  4. एक भंवर मिक्सर के साथ समाधान मिक्स और उन्हें कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए खड़े करने के लिए अनुमति देते हैं। उसके बाद, इस मिश्रण को फॉस्फेट बफर घोल (पीबीएस, पीएच 7-4) में फैलाएं और अनुवर्ती प्रयोगों के लिए प्राप्त mBG/pDNA बहुप्लेक्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित रखें।
    नोट: औसत कण आकार और mBG और परिसरों की जीटा क्षमता गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (DLS)17का उपयोग कर पाया गया.
  5. डीएलएस और जीटा संभावित नमूना कोशिकाओं में पीबीएस (पीएच 7.4) के 1 एमएल के साथ mBG/pDNA बहुप्लेक्स समाधानों का 10 डिग्री सेल्सियस का पतला करना।
    नोट: कण आकार और जीटा संभावित पता लगाने तीन बार किया गया और तीन मानों का एक औसत लिया गया था।

7. MBG/pDNA बहुप्लेक्स के इलेक्ट्रोफोरेटिक मंदन प्रयोग

नोट: न्यूनतम आवेश अनुपात निर्धारित करने के लिए एक इलेक्ट्रोफोरेटिक मंदन प्रयोग किया गया था।

  1. विभिन्न N/P अनुपात (1:1, 4:1, 8:1, 16:1, और 32:1) के साथ mBG/pDNA बहुप्लेक्स के पांच समूहों को लें जिसमें 50 डिग्री ग्राम pDNA है।
  2. 1x के एक अंतिम एकाग्रता के लिए mBG/pDNA बहुप्लैक्स नमूने के लिए बफर लोड हो रहा है 6x जोड़ें।
  3. 1.5% agarose जैल के लिए समाधान जोड़ें और 15 मिनट के लिए 90 एमवी पर जेल चलाने के लिए, नियंत्रण के रूप में pDNA का उपयोग कर .
  4. एक जेल imager का उपयोग कर जैल की तस्वीरें ले लो.

8. mBG/pDNA बहुप्लेक्स की Cytotoxicity

  1. बीज MCF-7 कोशिकाओं 96 अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से 104 कोशिकाओं के घनत्व पर 96 अच्छी प्लेटों में. फिर, एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर 5% सीओ2के साथ आपूर्ति में DMEM माध्यम (10% FBS और 1% एंटीबायोटिक) का उपयोग कर 12 एच के लिए कोशिकाओं संस्कृति।
  2. एंटीबायोटिक मुक्त DMEM संस्कृति मीडिया युक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और विभिन्न आरोप अनुपात के mBG/pDNA polyplexes युक्त संस्कृति माध्यम बदलें (N/P 4, 8, 16, और 32, n $6) 6 एच के लिए, नियंत्रण के रूप में पीबीएस समाधान के बराबर मात्रा के साथ जोड़ा कोशिकाओं ले. फिर, संस्कृति माध्यम को ताजा 1640 माध्यम के 150 डिग्री सेल्सियस के साथ बदलें और आगे की संस्कृति 24 ज के लिए कोशिकाओं को।
  3. 96-वेल प्लेट्स में 5 मिलीग्राम/एमएल 3-(4,5-डाइमेथिथियाज़ोल-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (एमटीटी) समाधान (20 डिग्री सेल्सियस/अच्छी तरह से) जोड़ें और आगे की संस्कृति कोशिकाओं को 4 ज के लिए।
  4. समाधान निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए DMSO के 150 $L जोड़ें और 96 अच्छी तरह से प्लेटें 30 सेकंड हिला.
  5. सेल व्यवहार्यता दिखाने के लिए एक माइक्रोप्लेट रीडर के साथ 490 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) को मापें। समीकरण 9के अनुसार सेल व्यवहार्यता प्रतिशत की गणना कीजिए।
    सेल व्यवहार्यता Equation 10 % ] (9)

9. mBG/ GFP-PDNA बहुप्लेक्स की ट्रांसफेक्शन दक्षता

  1. बीआरनेजीन जीन ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) पीडीएनए (जीएफपी-पीडीएनए) को 50 डिग्री एल आरएनसे/डीएनएसे-मुक्त पानी में शामिल किया गया है। फिर 1 एमएल आरनेस/DNase-मुक्त जल में 1 मिलीग्राम mBG copolymers भंग करें। 1:1, 4:1, 8:1, 16:1, और 32:1 के आवेश अनुपात (N/P) पर pDNA और mBG समाधान मिलाएं और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अल्ट्रासोनिक तरंगों (30 s) का उपयोग कर MBG/GFP-pDNA polyplexes समाधान फैलाएं और अनुवर्ती प्रयोगों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: द/च च अनुपात की गणना एमिनो नाइट्रोजन (छ) के आण्विक भार ों के अनुसार मम्बी तथा फॉस्फेट समूह (च) में चदना के अनुसार की जाती है।
  2. बीज MCF-7 कोशिकाओं के घनत्व पर 2 - 105 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से एक 6 अच्छी तरह से थाली में और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 12 एच के लिए एक humidified इनक्यूबेटर में संस्कृति.
  3. 6 ज के लिए विभिन्न N/P अनुपात (4, 8, 16, और 32) के MBG/GFP-pDNA बहुप्लेक्स युक्त ताजा संस्कृति माध्यम के साथ संस्कृति माध्यम को बदलें।
  4. 48 ज के लिए ताजा RPMI1640 मध्यम और संस्कृति के 2 एमएल के साथ मध्यम बदलें.
  5. कोशिकाओं को ले लीजिए और एक प्रवाह cytometer के साथ हरी फ्लोरोसेंट का पता लगाने.

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Representative Results

BNHEMA तालिका 1में दिखाया गया बहुलकीकरण के उद्देश्य की डिग्री के अनुसार खिलाया गया था; mBG के संश्लेषण प्रक्रिया चित्र 1में दिखाया गया है. सबसे पहले, BNHEMA homopolymer एक श्रृंखला हस्तांतरण एजेंट के रूप में 4-cyanopentanoic एसिड dithiobenzoate का उपयोग कर, पानी-डाइऑक्सेन प्रणाली में प्रतिवर्ती योग-विखंडन श्रृंखला हस्तांतरण (RAFT) विधि के माध्यम से तैयार किया गया था। दूसरे, PBNHEMA एक श्रृंखला हस्तांतरण एजेंट के रूपमें इस्तेमाल किया गया था BNHEMA-b -APMA ब्लॉक बहुलक तैयार करने के लिए. एपीएमए मोनोमर को सारणी 1में दर्शाए गए बहुलकीकरण की वस्तुनिष्ठ डिग्री के अनुसार खिलाया गया था। विभिन्न आहार अनुपातों के साथ बीए के आण्विक भार का पता लगाने केलिए जेल परमीशन क्रोमैटोग्राफी (जीपीसी) की गई थी। विभिन्न आहार अनुपातों के साथ बीए में एपीएमए श्रृंखलाओं की वास्तविक मोलर सामग्री का पता निनहाइड्रिन विधि (सारणी 1) के माध्यम से पाया गया। हमारे पहले के अध्ययन के अनुसार5, हम वर्तमान अध्ययन में mBG3 इस्तेमाल किया क्योंकि यह सबसे अधिक APMA सामग्री है. अंत में, methionine APMA श्रृंखला के लिए grafted किया गया था और अवशिष्ट amine समूहों पूरी तरह से mBG तैयार करने के लिए guanidinylated थे. चित्र 2 एम बीजी का 1एच एनएमआर डाटा है। mBG/pDNA बहुप्लेक्स का औसत कण आकार और जीटा विभव क्रमशः 124 दउ तथा +15.7 उ.मी., 16केN/P अनुपात में 124 दउ तथा +15.7 उ.मी.

इलेक्ट्रोफोरेटिक मंदन एक तीव्र और सरल तकनीक है जिसमें अबंधित पीडीएनए और सहबहुलक/पीडीएनए पॉलीप्लेक्स को अगरोस जैल में उनके इलेक्ट्रोफोरेटिक मोबिलिटीज में अंतर के आधार पर अलग करना शामिल है। असीम pDNA बैंड बिजली के क्षेत्र की कार्रवाई के तहत agarose जेल में स्थानांतरित कर सकते हैं. इलेक्ट्रोफोरेटिक मंदन प्रयोग में (चित्र 4), pDNA (0 के N/P अनुपात के साथ) अगारोस जेल में संयम के बिना स्थानांतरित कर सकता है और जेल इमेजर में धारी के रूप में देखा गया था। जब pDNA MBG के साथ जटिल है, pDNA की गति मंद है और बाद में, बैंड की चमक कम हो जाती है। चित्र 4 से पता चलता है कि जब छधप् 4 से अधिक हो तो mBG PDNA को पूरी तरह जटिल कर सकता है।

mBG/pDNA बहुप्लेक्स की cytotoxicity मानक एमटीटी परख का उपयोग कर के लिए मापा गया था (चित्र 5) . परिणाम ों से पता चलता है कि MBG/PDNA बहुप्लेक्स स्पष्ट रूप से PEI/PDNA बहुप्लेक्स की तुलना में कम cytotoxicity है 4/ इसके अलावा, एमबीजी/पीडीएनए बहुप्लेक्स की साइटोटॉक्सिसिटी एन/पी अनुपात में वृद्धि के साथ बढ़ जाती है। वृद्धि N/P के साथ mBG/pDNA बहुप्लेक्स की साइटोटॉक्सिसिटी की वृद्धि धनावेशित जीपीएमए घटक का परिणाम है। mBG/pDNA बहुप्लैक्स PEI/pDNA बहुप्लैक्स की तुलना में कम साइटोटॉक्सिसिटी दिखाया, जो कि धनात्मक पॉलिमर की सतह के प्रभारी को ढालने वाले सहबहुलकों में BNHEMA की उपस्थिति के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है।

पीडीएनए ट्रांसफेक्शन प्रयोग में प्रयुक्त N/P अनुपात साइटोटॉक्सिसिटी परिणामों के अनुसार चुना गया था। जैसा कि चित्र 6में दर्शाया गया है, mBG1, mBG2, और mBG3 के transfection क्षमताओं GFP फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने के द्वारा तुलना में थे और परिणाम से पता चला कि mBG3 इष्टतम जीन वाहक है. यद्यपि 8 के N/P अनुपात वाले PEI/PDNA बहुप्लेक्स में 32 के N/P अनुपात के साथ mBG3/PDNA बहुप्लेक्स के समान ट्रांसफेक्शन दक्षता होती है, पीई ई के पास अधिक साइटोटॉक्सिसिटी होती है और इसमें दवा लोड िंग जैसे कोई कार्य नहीं होते हैं, जो जैव चिकित्सा क्षेत्र में इसके अनुप्रयोग को प्रतिबंधित करता है। परिणामों से पता चला है कि AMPA सामग्री की वृद्धि mBG copolymer के transfection दक्षता में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है. जैसा कि हम एक पहले के अध्ययन में उल्लेख किया5, सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स (CPPs) कर रहे हैं 9-35 सेल झिल्ली घुसना करने की क्षमता के साथ 9-35 मेर धनायनी या उभयरोग पेप्टाइड्स. ग्वानिडीन समूह एक धनायनी सीपीपी है जिसे एक बहुलक में एक प्रोटीन-स्वतंत्र ट्रांसमेम्ब्रेन मार्ग के माध्यम से बहुलक/पीडीएनए पॉलीप्लेक्स के ट्रांसफेक्शन को बढ़ाने के लिए संयुग्मी किया जा सकता है। इसलिए, mBG copolymer सेल प्रवेश के लिए ग्वानिडीन समूहों और परिरक्षण के लिए BNHEMA घटक से संबंधित लाभों को एकीकृत करता है, प्रभावी जीन वितरण के लिए महान क्षमता दिखा.

नमूना भीमा -बी-एपीएमए मेगावाट Pdi
APMA सामग्री का सैद्धांतिक मान (%) APMA सामग्री का वास्तविक मान (%)
BNHEMA90-b-APMA30(BA1) 25% 21% 16200 1.25
BNHEMA90-b-APMA60(BA2) 40% 37% 20900 1.21
BNHEMA90-b-APMA90(BA3) 50% 52% 27200 1.25

तालिका 1: RAFT बहुलीकरण द्वारा BNHEMA-b-APMA की संरचना।

Figure 1
चित्र 1: MBG के Schematic संश्लेषण प्रक्रिया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: 1एच एनएमआर स्पेक्ट्रम एमबीजी में डी2हे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: कण आकार और बहुप्लेक्स की जीटा क्षमता।
(ए) बीए/पीडीएनए का कण आकार। (बी) एम बीजी/ (सी) बीए/पीडीएनए की जीटा क्षमता। (डी) mBG/pDNA की जीटा क्षमता। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: Agarose जेल electrophoresis BA3 की छवियों
(एक) , mBA3 (b) और mBG3 (ग) विभिन्न आवेश अनुपातों पर बहुप्लेक्स।

Figure 5
चित्र 5: एमसीएफ7 सेल लाइन में विभिन्न छ/पी अनुपात पर एम बीजीजी/पीडीएनए बहुप्लेक्स की Cytotoxicity।
PEI/PDNA बहुप्लेक्स नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. डेटा मतलब के रूप में दिखाया गया था - एसडी (n $3). * PEI समूह की तुलना में पी एंड टी एल;0.05 इंगित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: 4, 8, 16 तथा 32 के N/P अनुपात में mBG/PDNA बहुधाओं की संक्रमण दक्षता को प्रवाह साइटोमीटर द्वारा मापा गया था।
डेटा मतलब के रूप में दिखाया गया था - एसडी (n $3). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस अध्ययन में BNHEMA-b-APMA ब्लॉक बहुलक धनात्मक जीन वाहक की एक श्रृंखला शुरू की. इन ब्लॉक पॉलिमर प्रतिवर्ती जोड़-खंडन श्रृंखला हस्तांतरण (RAFT) विधि के माध्यम से संश्लेषित किया गया. जलरागी खंड BNHEMA घुलनशीलता में सुधार करने के लिए शुरू किया गया था। मेथियोनिन और ग्वानिडीन समूहों को लक्ष्य क्षमता और ट्रांसफेक्शन दक्षता5में सुधार करने के लिए संशोधित किया गया . APMA श्रृंखला सामग्री में वृद्धि हुई है और mBG copolymer में guanidinylation mBG/pDNA बहुप्लेक्स के कण आकार कम. कण आकार और सतह क्षमता जटिल कोशिका झिल्ली भर में आसान बनाने के लिए और transfection के लिए लागू है. प्रयोग में महत्वपूर्ण बिंदुBNHEMA मोनोमर और CTP के मोलर अनुपात को 45:1, सीटीपी और एसीवीए का मोलर अनुपात 2:1 और तापमान को 70 डिग्री सेल्सियस तक कड़ाई से नियंत्रित करने में हैं। शुद्ध प्रक्रिया के दौरान, precooled एसीटोन और बहुलक समाधान की मात्रा अनुपात 50:1 से अधिक होना चाहिए।

उसी N/P मान के साथ, APMA श्रृंखला के अनुपात में वृद्धि के साथ, mBG/pDNA बहुप्लेक्स का कण आकार कम हो जाता है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि APMA श्रृंखला सामग्री में वृद्धि और guanidinylation कण आकार को कम कर सकते हैं. कण आकार और सतह क्षमता जटिल कोशिका झिल्ली भर में परिवहन और transfection के लिए लागू करने के लिए आसान बनाते हैं। जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस का उपयोग जटिल और छ/पी अनुपात के बीच संबंध की जांच करने के लिए किया गया था और आंकड़ों से पता चला कि न्यूनतम छ/ यह अध्ययन धनायनिक जीन वाहकों के आगे अध्ययन के लिए मूल्यवान मूल आंकड़े उपलब्ध कराएगा। हालांकि, BNHEMA-बी-APMA आसानी से अपमानित नहीं है और विवो में इसकी चयापचय प्रक्रिया काफी स्पष्ट नहीं है. इसलिए, नैदानिक आवेदन अभी भी cationic बहुलक जीन वाहक के लिए एक बड़ी चुनौती है.

उच्च दक्षता और जीन वाहक की कम विषाक्तता उनके नैदानिक उपयोग के लिए आवश्यक शर्तें हैं. Cationic बहुलक जीन वैक्टर अच्छा स्थिरता और कोई इम्यूनोजेनिकता के फायदे हैं और वे तैयार किया जा सकता है और आसानी से संशोधित.

RAFT बहुलकन व्यापक रूप से styrene, methacrylate, acrylonitrile, और acrylamide सहित monomers के बहुलकीकरण में प्रयोग किया जाता है। इस प्रकार की बहुलकन प्रक्रिया कम तापमान पर की जा सकती है। इसके अलावा, RAFT बहुलकीकरण ठीक संरचनाओं के पॉलिमर संश्लेषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित RAFT बहुलकन को जैव चिकित्सा बहुलकों की तैयारी के लिए सबसे आशाजनक संभावित विधियों में से एक माना जाता है।

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Disclosures

लेखक प्रमाणित करते हैं कि इस आलेख में चर्चा की गई सामग्री के बारे में किसी भी वित्तीय संगठन के साथ हितों का कोई विरोध नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (नहीं 2016YFC0905900), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (सं. 81801827, 81872365), Jiangsu प्रांत के बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम (प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन, नहीं) द्वारा समर्थित किया गया था. BK20181086), और Jiangsu कैंसर अस्पताल वैज्ञानिक अनुसंधान कोष (नहीं. $K201605).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-hydroxybenzotriazole Macklin Biochemical Co., Ltd,China H810970 ≥97.0%
1,4-dioxane Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China 10008918 AR
1-amidinopyrazole Hydrochloride Aladdin Co., Ltd., China A107935 98%
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride Aladdin Co., Ltd., China E106172 AR
4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) Aladdin Co., Ltd., China A106307 Analytical reagent (AR)
4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid Aladdin Co., Ltd., China C132316 >97%(HPLC)
Acetate Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China 81014818 AR
Acetone Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China 10000418 AR
Agarose Aladdin Co., Ltd., China A118881 High resolution
Ascorbic acid Aladdin Co., Ltd., China A103533 AR
DMSO Aladdin Co., Ltd., China D103272 AR
Ethylene glycol Aladdin Co., Ltd., China E103319 AR
N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride Aladdin Co., Ltd., China N129096 ≥98.0%(HPLC)
N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China CF259748 ≥98.0%(HPLC)
Ninhydrin Aladdin Co., Ltd., China N105629 AR
PBS buffer Aladdin Co., Ltd., China P196986 pH 7.4
Plasmid DNA BIOGOT Co., Ltd, China pDNA-EGFP pDNA-EGFP
Plasmid DNA BIOGOT Co., Ltd, China Pdna pDNA
Sodium carbonate decahydrate Aladdin Co., Ltd., China S112589 AR
Trimethylamine Aladdin Co., Ltd., China T103285 AR

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References

  1. Flotte, T. R. Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead. Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).
  2. Huang, W., et al. Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).
  3. Wu, Y., et al. Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles. Colloids & Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).
  4. Quader, S., Kataoka, K. Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy. Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).
  5. Wu, Y., et al. Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR. Journal of Gene Medicine. 19, e2969 (2017).
  6. Szwarc, M. ‘Living’ Polymers. Nature. 178, 168-169 (1956).
  7. Szwarc, M., Rembaum, A. Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer. Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).
  8. Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. Living supramolecular polymerization. Science. 349, 241 (2015).
  9. Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization. European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).
  10. Wu, W., Wang, W., Li, J. Star polymers: Advances in biomedical applications. Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).
  11. Boyer, C., et al. Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications. Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).
  12. Keddie, D. J. A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization. Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).
  13. Wu, Y., et al. Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression. Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).
  14. Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).
  15. Friedman, M. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).
  16. Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).
  17. Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles. Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).

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रसायन विज्ञान अंक 150 प्रतिवर्ती अतिरिक्त-विखंडन श्रृंखला स्थानांतरण RAFT दवा वितरण प्रणाली DDS methionine guanidine एन-(3-एमिनोप्रोपिल)मेथाक्रिलमाइड हाइड्रोक्लोराइड APMA एन,एन-बिस(2-हाइड्रोक्सी) मेथाक्रिलमाइड बीएनएचए
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Wu, Y., Zhang, W., Zhang, J., Mao, Z. X., Ding, L., Li, H., Ma, R., Tang, J. H. Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery. J. Vis. Exp. (150), e58527, doi:10.3791/58527 (2019).

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