Summary
עבודה זו מציגה את ההכנה של מתיונין פונקציונליות ביויונטית בלוק תואם (mBG) באמצעות הפיך תוספת-פיצול שרשרת העברת (רפסודה) שיטה. ה-DNA הפלסטיות משלימה את היכולת של mBG שהושג ואת היעילות שלהם הגלגול נחקרו גם. שיטת הרפסודה מועילה מאוד עבור מונמרים פולימרים המכילים קבוצות פונקציונליות מיוחדות.
Abstract
תוספת הפיכה-העברת שרשרת הפיצול (רפסודה) פולימור משלבת את היתרונות של פולימוניזציה רדיקלי וחיים פלוניזציה. עבודה זו מציגה את הכנת הסופולימרים של מתיונין התואמים באמצעות רפסודה פלוניזציה. ראשית, n, n-bis(2-הידרולקסיל) מתיאקרילאמיד-b-n-(3-aminopropyl) מתיונין (BNHEMA-b-APMA, BA) היה מסונתז באמצעות רפסודה פולימור באמצעות 4, 4 '-azobis (acva) כיום ליזום סוכן 4-cyanopentanoic חומצה dithiobenzoate (CTP) כמו סוכן העברת שרשרת. לאחר מכן, n, n-bis(2-הידרוגרקסיל) מתיונין-b-n-(3-guanidinopropyl) מתיאקרילאמיד (מתיונין מושתל BNHEMA-b-gpma, mbg) הוכנו על ידי שינוי קבוצות אמין באפיה עם מתיונין וגואנידין קבוצות. שלושה סוגים של פולימרים לחסום, mBG1, mBG2, ו mBG3, היו מסונתז להשוואה. תגובה ניפובית שימש לכמת את התוכן APMA; mBG1, mBG2, ו mBG3 היו 21%, 37%, ו 52% של APMA, בהתאמה. התוצאות של ג'ל חדירות (GPC) הראו כי בעלי סופולימרים בעלי משקולות מולקולרית של 16,200 (BA1), 20900 (BA2), 27200 (BA3) g/מול. ה-DNA פלמיד (pDNA) השלימה את היכולת של בלוק השיגה הספקים הגן המתקבל גם היה נחקר. יחסי האישום (N/P) היו 8, 16, ו 4 כאשר pDNA היה מלא לחלוטין עם mBG1, mBG2, mBG3, בהתאמה. כאשר היחס N/P של הפוליפיום של mBG/pDNA היה גבוה מ-1, הפוטנציאל הזטה של mBG היה חיובי. ביחס N/P בין 16 ל-32, גודל החלקיק הממוצע של משטח החלקיקים mBG/pDNA היה בין 100-200 nm. באופן כללי, עבודה זו ממחישה פרוטוקול פשוט ונוח עבור סינתזה הנושא בלוק סופולימר.
Introduction
בשנים האחרונות, טיפול גנטי התפתחה לאספקה טיפולית של חומצות גרעין כמו תרופות לטיפול בכל מיני מחלות1. התפתחות של תרופות גנטי כולל DNA פלמיד (pDNA) ו-RNA מתערב קטן (siRNA) מסתמך על היציבות והיעילות של מערכת אספקת הסמים (DDS)2. בין כל DDS, הספקים הפולימרים של החומרים הפולימריים יש את היתרונות של יציבות טובה, חיסוני נמוך, ו נתיישב הכנה ושינוי, אשר מעניקים מנשאים פולימריות הסיכויים ליישום3,4. עבור יישומים מעשיים ב ביודיצין, החוקרים חייבים למצוא מנשא פולימרי עם יעילות גבוהה, רעילות נמוכה, ויכולת מיקוד טוב5. בין כל הספקים הפולימריים, בלוק סופולימרים הם אחד ממערכות האספקה הנפוצות ביותר לאספקת סמים. בלוק סופולימרים לומדים באופן אינטנסיבי עבור הרכוש העצמי שלהם ואת היכולות ליצור מיקרולים, המיקרוספירות, ו חלקיקים במשלוח סמים5. בלוק סופולימרים יכולים להיות מסונתז דרך פלוניזציה או ללחוץ על שיטות כימיה.
בשנת 1956 העלה שוארג ואח ' את נושא החיים הפלוניזציה, המגדירים אותו כתגובה ללא תגובות מעבר שרשרת6,7. מאז פותחו טכניקות מרובות לסנתז פולימרים בשיטה זו; כך, החיים פולימוניזציה מוצג כאבן דרך של מדעי הפולימר8. ניתן לסווג את הפלמור החיים לתוך החיים האניוניים, החיים המנייזציה, והרפלזציה הניתנת לביטול הפיכה (RDRP)9. לחיות polyonic/החיים הפוליפוניים יש היקף מוגבל של היישום בשל תנאי תגובה קפדנית שלהם10. בשליטה/פולימלזציה רדיקלית (CRP) יש תנאי תגובה מתונים, שליטה נוחה, תשואה טובה, ובכך היה מוקד המחקר העיקרי בשנים האחרונות11. ב-CRP, רשתות הפצה פעילות מואבקים הפיכה לאלה רדומים כדי להפחית את הריכוז של רדיקלים חופשיים ולהימנע מהתגובה הביוולקולרית של הפצת רדיקלים בשרשרת. בנוסף, ניתן להמשיך לנוע רק אם הרשתות הממשיכות הרדומים אינן פעילות מונפשות לתוך הגורמים הקיצוניים בשרשרת. כאחת הצורות המבטיחים ביותר של הפלוניזציה הרדיקלי החיים, תוספת הפיך-פיצול שרשרת (רפסודה) פולימור היא שיטה הישימה לבלום פולימרים לחסום עם משקל מולקולרי מבוקרת מבנה, משקל מולקולרי צר הפצה, ונשיאת קבוצות פונקציונליות12. המפתח לרפסודה מוצלחת של רפסודת ההצלה הוא ההשפעה של סוכני העברת שרשרת, בדרך כלל dithioesters, אשר בעלי קבוע מאוד גבוהה העברת שרשרת.
בנייר זה, שיטת הרפסודה היתה מתוכננת להכין BNHEMA-b-apma בלוק פולימר, לקיחת 4, 4 '-azobis (4-חומצה ציאנואלאריק) (acva) כסוכן יוזם ו 4-cyanopentanoic חומצה dithiobenzoate (ctp) כסוכן העברת שרשרת. הרפסודה הייתה בשימוש פעמיים כדי להחדיר BNHEMA לתוך מנשאי הפולימר. לאחר מכן, הקבוצות של האמין בשרשרת APMA השתנו עם מתיונין והגואנינילציה מגיב 1-עמידיאדיאזול הידרוכלוריד. ביצוע השימוש החיובים החיוביים של מגיב הגואנילציה והשלד פולימר מתיאקרילמיד, היעילות ספיגת הסלולר של מנשאים לחסום פולימר שהושג השתפר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. סינתזה של פולימר BNHEMA (PBNHEMA)
- מתמוסס 1.87 g של n, n-bis(2-הידרוביקסיל) מתיאקרילאמיד (BNHEMA) ב 1 מ ל של מים מזוקקים בבקבוק פילמור.
הערה: בקבוק הפילמור הוא מבחנה עגולה עם פקק גומי ומערבב מגנטי. - התמוססות 0.03 g של 4-cyanopentanoic חומצה dithiobenzoate (CTP) ו 0.02 g של 4, 4 '-azobis (4-ציאנואליאבחומצת) (ACVA) ב 0.5 mL של 1, 4-dioxane בגביע 5 מ ל. לאחר מכן, הוסיפו את התמיסה CTP ו-ACVA לבקבוק הפילמור משלב 1.1.
- והדלק את מערכת התגובה בבקבוק הפילמור עם חנקן באמצעות שלושה מחזורי הקפאת המשאבה.
- בפירוט, הקפאת הפתרון בבקבוק הפילמור באמצעות מלכודת עיבוי, לתקן את בקבוק הפילמור לתמיכה ברזל, ולאחר מכן להזריק חנקן לתוך תערובת התגובה באמצעות הצינור עם מחט (#9 מחט, הפנימי קוטר 0.65 מ"מ, קוטר החיצוני 0.9 מ"מ). לאטום את בקבוק הפילמור ולהפשיר את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- חזור על מחזורי ההפשרה-הקפאה שלוש פעמים.
- הניחו את בקבוק הפילמור באמבט שמן ב70 ° c והניחו לפתרון להגיב 24 שעות מתחת לאווירת החנקן.
- הצנן את בקבוק הפילמור ב -0 ° צ' ופתח את פקק הגומי כדי לסיים את תהליך הפילמור.
- אצטון precool במקרר של 20 ° c עבור 2 h ולאחר מכן לערבב אותו עם פתרון התגובה של שלב 1.5 בשעה 50:1 (v/v). לאחר מכן, צנטריפוגה ב 8,200 x g עבור 10 דקות כדי להסיר אצטון ולאסוף את הזרז.
- כדי לטהר את PBNHEMA מסונתז, לפזר את הזרז שנאסף 2 מ ל של מים טהורים ולאחר מכן לערבב אותו עם 100 mL של אצטון מקורר, ביחס של 1:50 (v/v). צנטריפוגה את הפתרון ב 8,200 x g עבור 10 דקות ולאסוף את הזרז. חזור על תהליך זה שלוש פעמים.
- יבש את PBNHEMA המיוצר באמצעות מייבש ואקום 50 ° c. , פעם התייבשו. שוקלים את האבקה באיזון חשב את קצב התשואה בהתאם למשוואה 1.
1
הערה: בניסוי זה, התשואה שהושגה הייתה 77.2%.
12. סינתזה של BNHEMA-b-apma פולימר (BA)
- התמוססות 0.96 גרם של N-(3-aminopropyl) מתיאקרילאמיד הידרוכלוריד (apma) ו 0.93 g PBNHEMA ב 5 מ ל של מים מזוקקים בגביע של 10 מ ל.
- לפזר 0.01 g של 4, 4 '-azobis (4-חומצה ציאנואלאריק) (ACVA) ב 0.5 mL של 1, 4-dioxane ולערבב עם פתרון APMA-PBNHEMA מחלק 2.1.
- העבירו את התערובת לתוך בקבוק פילמור והוא מאוורר בחנקן יבש במשך 1 שעות.
- הניחו את בקבוק הפילמור באמבט שמן ב70 ° c והניחו לו להגיב ל -24 שעות מתחת לאווירת החנקן.
- הצנן את בקבוק הפילמור ב -0 ° צ' ופתח את פקק הגומי כדי לסיים את תהליך הפילמור.
- העבר את הפתרון אל אצטון מקורר משלב 1.6, ולאחר מכן צנטריפוגה את הפתרון ב 8,200 x g עבור 10 דקות כדי לזרז את ה-BA.
- מפזר את ה-BA ב-2 מ ל של מים מזוקקים ומזרז את הפולימר באצטון הצונן. . חזור שלוש פעמים
- לייבש את BA בייצור במייבש ואקום 50 ° c ושוקל את האבקה המתקבלת. חישוב קצב התשואה לפי משוואה 2.
הערה: בניסוי זה, שיעור התשואה חושב להיות 82.0%.
3. לקבוע את אחוז השומה של APMA ב-BA קופולימר באמצעות שיטת הניברז
הערה: ספקטרופוטומטר משמש לקביעת התוכן של חומצות אמינו מרובת רכיבים. העיקרון הוא תגובת צבע של נינדאין וחומצת אמינו שבהם הספיגה מקורלציה עם התוכן של חומצת האמינו במידה מסויימת13,14.
- מפזר 5 גר' ניברז ב 125 מ ל של מים מזוקקים רותחים. כמו כן, לפזר 5 גרם של ויטמין C ב 250 mL של מים חמים מזוקקים. הוסף את 250 mL של ויטמין C פתרון dropwise הפתרון ninהידרב תחת ערבוב מגנטי. להמשיך לערבב 15 דקות ולאחר מכן לצנן את פתרון התגובה במקרר 4 ° c.
- להוציא את הפתרון מהמקרר ולסנן על ידי יניקה באמצעות משפך Buchner לקבל ninהידרב מופחת. לאסוף את הזרז ולשמור אותו בתוך מייבש pentoxide זרחן.
- התמוססות 85 מ"ג של ninהידרב ו 15 מ ג של ninהידרב 10 מ ל של אתילן גליקול האתר כדי להכין את הפתרון nin, צביעה.
הערה: ניברז-פתרון לצביעה יכול להגיב עם α-אמינו ב APMA וליצור מתחם סגול עם מבנה כמתואר במחקר הקודם15. - לדלל 1 מ ל של 0, 1, 10, 100, 1,000 mg/mL APMA פתרונות מונומר עם 1 מ ל של מאגר אצטט (2 M, pH 5.4), ולאחר מכן להוסיף 1 מ ל של הניטים-צביעת פתרון, בהתאמה.
- מחממים את התערובות במשך 15 דקות באמבט מים רותחים ומצננים אותם באמצעות מים זורמים. תן לפתרונות לשבת 5-10 דקות ולדלל אותם עם 3 מ ל של 60% אתיל אלכוהול ולערבב אותם ביסודיות. למדוד את ספיגת ב 570 ננומטר באמצעות ספקטרוסקופיה ולצייר את עקומת רגיל (משוואה 3).
הערה: משוואה 3 נגזרת מההתאמה הליניארית של הספיגה ב570 ננומטר נגד ריכוז APMA. - מתמוסס 0.01 גרם של BA ב 1 מ ל של מים מזוקקים; להוסיף 1 מ ל של מאגר אצטט (2 M, pH 5.4) ו-1 מ ל של ניידרב-פתרון צביעה. חישוב התוכן הטוחנת של APMA בהתאם לספיגת ה570 nm.
(5)
הערה: נוסחאות החישוב הן כדלקמן (משוואות 3-6).
(5)
4. סינתזה של מתיונין מושתלים פולימר BA (mBA)
- מתמוסס 8.9 מ ג של מתיונין ב 5 מ ל של DMSO בבקבוקון התאוששות.
- הוסף 6.92 מ"ג של 1-אתיל-3-(3-dimethylaminopropyl) קרבודיאימיד הידרוכלוריד (EDCl) ו 4.86 מ"ג של 1-hydroxybenzotriazole (הובט) לבקבוקון התאוששות ולהגיב 0 ° c עבור 0.5 h.
- לפזר 2.59 g של BA בתוך 5 מ ל של פתרון DMSO ולאחר מכן להוסיף 50 μL של trimethyine; להוסיף את הפתרון dropwise לבקבוקון שחזור (שלב 4.2) ולתת לפתרון להגיב 0.5 h בטמפרטורת החדר.
- Dialyze כדי להסיר DMSO ו trimethylamine מן הפתרון BA בשלב 4.3 באמצעות שקית דיאליזה (MWCO 10 kDa) בגביע 2 L עבור 24 h; החליף את המים האלה כל 6 שעות.
- להקפיא יבש השיגה mBA ושוקלים לחשב את קצב התשואה על פי המשוואה 7.
הערה: במקרה זה, שיעור התשואה נקבע להיות 71%. - לכמת את NH2 המכיל mBA על ידי מדידת ספיגת ב570 nm כדי לחשב את כמות מתיונין מושתל. לחשב את התוכן הטוחנת של מתיונין על פי המשוואה 8.
5. סינתזה של guanidinated ו מתיונין BNHEMA-b-apma פולימר (mbg)
הערה: שלושה mBA1 שונים, mBA2 ו mBA3 סופולימר היו מסונתז. mBA3 סופולימר משמש כדוגמה בשלבים הבאים.
- התמוססות mBA3 המכילה 60 μa של קבוצת אמינו ב-5 מ ל של מים טהורים.
הערה: תוכן קבוצת האמינו היה מכמת באמצעות שיטת הניחות כמתואר בשלב 3.5. - התמוססות 40.6 מ"ג (300 μמול) של גואנידילציה מגיב 1-עמידיפיאדיפיאמיד הידרוכלוריד בפתרונות mBA.
- התאימו את ה-pH ל 9.0 עם התמיסה הרוויה של סודיום קרבונט ותנו לו להתייצב 24 שעות בטמפרטורת החדר.
- Dialyze מוצר mBG עם מים מיוהים באמצעות שקית דיאליזה בגביע (MWCO 10 kDa, 2 L) ולשמר אותו בצורה של אבקת הקפאה מיובש.
אחוז התשואה חושב להיות 85% באמצעות משוואה 8.
8 - התמוססות mBG אבקת D2O בצינורות nmr ולאפיין אותו באמצעות 1h ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (1h nmr)16.
86. הכנה ואפיון של הפוליפביסים של mBG/pDNA
- לפזר 50 μg של pDNA ב 50 μL של RNase/DNase-מים ללא תשלום.
- מתמוסס 1 מ ג של סופולימרים של mBG ב 1 מ ל של RNase/DNase-מים ללא תשלום.
- הוסף את הפתרון mBG סופולימרים ישירות לתוך הפתרון pDNA בהתאם ליחסי האכלה שונים, כלומר, יחסי N/P שונים (1:1, 4:1, 8:1, 16:1, ו 32:1).
הערה: היחס N/P מוגדר כמו היחס הטוחנת של הקבוצה guanidine בפולימר ואת הקבוצה פוספט ב pDNA, כלומר את היחס הטוחנת של שרשרת GPMA ב פולימר ומונוונואואס ב pDNA. יחס N/P מחושב בהתאם למשקולות המולקולריות של חנקן אמילי (N) בקבוצת mBG ו פוספט (P) ב-pDNA. - מערבבים את הפתרונות עם מערבל מערבולת ומאפשרים להם לעמוד 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לפזר את התערובת בתמיסה מאגר פוספט (PBS, pH 7.4) ולשמר את הפוליפונה mBG/pDNA ב -4 ° c עבור ניסויים מעקב.
הערה: גודל החלקיק הממוצע ופוטנציאל הזטה של mBG והתסביכים זוהו באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS)17. - לדלל 10 μL של הפתרונות mBG/pDNA עם 1 מ ל של PBS (pH 7.4) ב DLS ו זטה תאים לדוגמה פוטנציאליים.
הערה: גודל החלקיקים והזיהוי הפוטנציאלי של זיתא נערכו שלוש פעמים והממוצע של שלושת הערכים נלקח.
7. מפיגור חשמלי בניסוי של mBG/pDNA
הערה: ניסוי הפיגור האלקטרו-ממדי נערך כדי לקבוע את יחס החיוב המינימלי.
- לקחת חמש קבוצות של הפוליפונים mBG/pDNA עם יחס N/P שונה (1:1, 4:1, 8:1, 16:1, ו-32:1) המכיל 50 μg של pDNA.
- הוסף מאגר טעינת 6x לדוגמיות הפוליפונן של mBG/pDNA לריכוז סופי של 1x.
- הוסף את הפתרונות ל 1.5% agarose ג'לים ולהפעיל את ג'ל ב 90 mV עבור 15 דקות, באמצעות pDNA כפקד.
- לצלם את הג באמצעות מקבל ג'ל.
8. הרעלת ציטוזה של מגה בורג/pDNA
- זרע MCF-7 תאים לתוך 96-היטב צלחות בצפיפות של 104 תאים לכל טוב. לאחר מכן, תרבות התאים עבור 12 שימוש בינונית DMEM דיום (10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה) בתוך מחולל ש37 ° c חממה שסופקו עם 5% CO2.
- החלף את בינונית התרבות עם מדיה התרבות DMEM ללא אנטיביוטיקה המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו mBG/pDNA מיני ביחס של יחסי תשלום שונים (N/P 4, 8, 16, ו 32, n = 6) עבור 6 h, לקיחת תאים שנוספו עם כמויות שוות של פתרון PBS כמו הפקד. לאחר מכן, החלף את מדיום התרבות עם 150 μL של טריים 1640 בינונית ותרבות נוספת התאים עבור 24 שעות.
- להוסיף 5 מ"ג/mL 3-(4, 5-dimethylthiazole-2-yl)-2, 5-diפניליום ברומיד (MTT) פתרון (20 μL/ובכן) 96-טוב צלחות ותרבות נוספת התאים עבור 4 h.
- הסר את הפתרון והוסף 150 μL של DMSO לכל טוב ולטלטל את הצלחות 96-טוב 30 שניות.
- מדוד את הדחיסות האופטית (OD) ב 490 ננומטר עם קורא מיקרולוח כדי להציג את הכדאיות של התא. חשב את אחוזי הכדאיות של התא לפי משוואה 9.
הכדאיות של התא
% = (9)
% = (9)9. נצילות החוצה של mBG/GFP-Pdlexes
- לפזר 50 μg של pDNA המכיל את גן העיתונאי חלבון פלורסנט ירוק (GFP) pDNA (GFP-pDNA) ב 50 μL של RNase/DNase-מים ללא תשלום. לאחר מכן מתמוסס 1 מ ג סופולימרים של mBG ב 1 מ ל של RNase/DNase-מים ללא תשלום. מערבבים pDNA ו mBG פתרון ביחס תשלום (N/P) של 1:1, 4:1, 8:1, 16:1, ו-32:1 ו-דגירה עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר. לפזר את הפתרון mBG/GFP-pDNA באמצעות גלי אולטראסוניות (30 s) ולאחסן ב 4 ° c עבור ניסויים מעקב.
הערה: יחס N/P מחושב בהתאם למשקולות המולקולריות של חנקן אמילי (N) בקבוצת mBG ו פוספט (P) ב-pDNA. - זרע MCF-7 תאים בצפיפות של 2 × 105 תאים לכל טוב בצלחת 6-באר ותרבות אותם ב 37 ° c ו 5% CO2 בחממה מחולל לחות עבור 12 h.
- החלף את מדיום התרבות עם בינונית התרבות הטרייה המכילה mBG/GFP-pDNA של יחסי N/P שונים (4, 8, 16, ו 32) עבור 6 h.
- להחליף את המדיום עם 2 מ ל של RPMI1640 טריים בינוני ותרבות עבור 48 h.
- לאסוף את התאים ולזהות את הזריחה הירוקה עם cytometer זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BNHEMA הוזן בהתאם למידת המטרה של הפילמור המוצג בטבלה 1; הליך הסינתזה של mBG מוצג באיור 1. ראשית, BNHEMA homopolymer היה מוכן דרך הפיך תוספת-פיצול שרשרת העברת (רפסודה) שיטת המים dioxane במערכת, באמצעות 4-cyanopentanoic חומצה dithiobenzoate כסוכן העברת שרשרת. שנית, PBNHEMA שימש סוכן העברת שרשרת להכין BNHEMA-b-apma לחסום פולימר. Apma מונומר הוזן בהתאם לדרגת המטרה של הפילמור המוצגת בטבלה 1. בוצע כדי לזהות את המשקל המולקולרי של BA עם יחסי האכלה שונים (שולחן 1). התוכן של הטוחנת בפועל של שרשראות APMA ב-BA עם יחסי האכלה שונים זוהה באמצעות שיטת הניחות (שולחן 1). על פי המחקר המוקדם שלנו5, השתמשנו mBG3 במחקר הנוכחי כי יש לו את התוכן הגבוה ביותר apma. בסופו של דבר, מתיונין היה מושתל בשרשרת APMA ושרידי קבוצות האמין היו לגמרי בלתי מוכנים להכין mBG. איור 2 הוא הנתונים 1H Nmr של mbg. גודל החלקיקים הממוצע ואת הפוטנציאל זיטה של mBG/pDNA פוליפלסים היו 124 ננומטר + 15.7 mV, בהתאמה, ביחס N/P של 16 (איור 3).
פיגור חשמלי הוא טכניקה מהירה ופשוטה המערבת הפרדה של pDNA בלתי מאוגד ו סופולימר/pDNA פוליפקס מבוסס על הבדלים שלהם electrophoretic mobilities בתוך ג'ל agarose. פס ה-pDNA האינו מאוגד יכול לנוע בתוך הג בפעולה של השדה החשמלי. בניסוי הפיגור האלקטרו-ממדי (איור 4), pdna (עם יחס N/P של 0) יכול לנוע ללא איפוק בג agarose ונצפתה פס הג ג'ל. כאשר pDNA משלימה עם mBG, התנועה של pDNA הוא מפגר ולאחר מכן, בהירות הלהקה מופחתת. איור 4 מראה כי mbg יכול לכלול לחלוטין את pdna כאשר N/P גבוה יותר מ-4.
הרעילות של מחשב השדה mBG/pDNA נמדדה באמצעות שיטת ה-MTT הסטנדרטית (איור 5). התוצאות מראים כי mBG/pDNA פוליפולסים יש כמובן רעילות נמוכה יותר מאשר פיי/pDNA פוליפלסים ביחס N/P של 4, 8, 16, ו 32 ב קו תא MCF-7 (P < 0.05, N = 3, דרך אחת ANOVA). יתר על כן, הרעילות של הציטוגרם של mBG/pDNA מגדילה עם יחס N/P מוגבר. הגידול של הרעלת הרעלים של mBG/pDNA הפוליפלסים עם N/P מוגברת הוא תוצאה של רכיב GPMA טעונה באופן חיובי. mBG/pDNA פוליפאלה הראה הרעלת ציטומית פחות מאשר פוליפונים הפיי/pDNA, אשר עשוי להיות מיוחס לנוכחות של BNHEMA בסופולימרים להגן על המטען של המשטח של הפולימרים.
יחס N/P המשמש בניסוי התרגום של pDNA נבחר בהתאם לתוצאות הרעילות. כפי שמוצג באיור 6, יכולות החצייה של MBG1, mBG2, ו mBG3 הושוו על ידי מדידת עוצמת הקרינה של gfp והתוצאות הראו כי mBG3 היא נושאת הגנים האופטימלי. למרות פיי/pDNA פוליפלסים עם יחס N/P של 8 יש יעילות מעבר דומה כמו mBG3/pDNA פוליפלסים עם יחס N/P של 32, פיי יש הרעלת ציטוזה גבוה יותר ואין לו פונקציות כגון טעינת סמים, אשר מגביל את היישום שלו בתחום הביו-רפואי. התוצאות התגלו כי העלייה של תוכן ה-אמפא היא המפתח לשיפור יעילות התרגום של mBG קופולימר. כפי שהזכרנו במחקר מוקדם יותר5, תאי חודר תאים (cpps) הם 9-35 mer שמיםאו פפטידים האמפיפתיים עם יכולת לחדור קרום התא. קבוצת guanidine היא CPP מעלה כי ניתן להגיע מעלה לתוך פולימר כדי לשפר את הזיהום של פוליפונה פולימר/pDNA באמצעות חלבון עצמאי מסלול טרנסממבררית. לכן, mBG סופולימר משלבת יתרונות הנוגעים לקבוצות guanidine לחדירת תאים ולרכיב BNHEMA לצורך הגנה, המראה פוטנציאל גדול למשלוח גנטי אפקטיבי.
| דוגמה | בסמה-בי-אפמה | Mw | PDI | |
| ערך תיאורטי של תוכן APMA (%) | ערך בפועל של תוכן APMA (%) | |||
| BNHEMA90-ב-apma30(BA1) | 25 | 21 | 16200 | 1.25 |
| BNHEMA90-b-apma60(BA2) | 40% | 37% | 20900 | 1.21 |
| BNHEMA90-b-apma90(BA3) | 50% | 52% | 27200 | 1.25 |
שולחן 1: ההרכב של BNHEMA-b-apma על ידי הרפסודה.
איור 1: הליך הסינתזה הסכמטית של mBG. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: 1H nmr ספקטרום של Mbg ב D2O. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: גודל החלקיקים והפוטנציאל הזטה של הפוליפסים.
(א) גודל החלקיק של BA/pdna. (ב) גודל החלקיקים של mbg/pdna. (ג) זטה פוטנציאל של BA/pdna. (ד) זטה פוטנציאל של mbg/pdna. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: Agarose ג'ל אלקטרופורזה בתמונות של BA3
(א) , mBA3 (ב) ו-mBG3 (c) פוליפליסים ביחס שונה של חיוב.
איור 5: בעלי רעילות של mBG/pDNA ביחס של N/P שונים בMCF7 קו התא.
. שימש כפקד הנתונים הוצגו כממוצע ± SD (n = 3). * מציין p < 0.05 לעומת הקבוצה פיי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: התייעלות יעילה של mBG/pDNA ביחס של N/P של 4, 8, 16 ו 32 נמדדו על ידי הזרימה cytometer.
הנתונים הופיעו כממוצע ± SD (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר זה הציג סדרה של BNHEMA-b-APMA לחסום מנשאי הגנים הפולימרים של הפולימר. פולימרים אלה בלוק היו מסונתז באמצעות הפיך תוספת-פיצול שרשרת העברה (רפסודה) שיטה. החלק ההידרופיפילית BNHEMA הוצג כדי לשפר את מסיסות. קבוצות מתיונין וגואנידין שונו על מנת לשפר את יכולת היעד ואת היעילות המקבצת5. התוכן של שרשרת APMA גדל, והגרחון בתוך mBG סופולימר הפחיתה את גודל החלקיק של משטח החלקיקים mBG/pDNA. גודל החלקיקים ומשטח הפוטנציאל הופכים את המתחם לקל לרוחב קרום התא והוא ישים לזיהום. הנקודות הקריטיות בניסוי משקרות לחלוטין על היחס הטוחנת של BNHEMA מונומר ו-ctp ל-45:1, היחס הטוחנת של ctp ו-acva ל 2:1, ואת הטמפרטורה ל 70 ° c. במהלך תהליך טיהור, יחס נפח של אצטון מקורר ופתרון פולימרי חייב להיות גבוה יותר מ 50:1.
באמצעות אותו ערך N/P, יחד עם הגידול של שרשרת APMA, גודל החלקיקים של mBG/pDNA פוליפלסים פוחתת. תוצאות אלה מעידות על הגדלת תוכן השרשרת APMA ואת הגונידילציה יכולים להקטין את גודל החלקיקים. גודל החלקיקים ומשטח הפוטנציאל הופכים את המתחם לקל להעברה על פני קרום התא וישים לזיהום. אלקטרופורזה ג'ל שימש כדי לחקור את היחסים בין complexing ויחס N/P ואת הנתונים הראו כי N/P המינימלי הוא 4. מחקר זה יספק נתונים בסיסיים יקרי ערך למחקר נוסף של נושאות גנים שמים. עם זאת, BNHEMA-b-apma לא מושפל בקלות ותהליך חילוף החומרים שלה בvivo אינו ברור מספיק. לכן, יישום קליני הוא עדיין אתגר גדול עבור נושאות גנים פולימרים מפולימר.
יעילות גבוהה ורעילות נמוכה של נושאות גנים הם התנאים הדרושים לשימוש הקליני שלהם. וקטורים גנים פולימריים מסוגים שבהם יש יתרונות של יציבות טובה וללא חיסוני והוא יכול להיות מוכן ושונה בקלות.
הרפסודה משמשת רבות בפלוניזציה של המונמרים, כולל יריעות, מתיונין, אקרילוניטריל ואקרילאמיד. תהליך הפילמור הזה יכול להתבצע בטמפרטורה נמוכה. כמו כן, ניתן להשתמש ברפסודה פולימוניזציה לסנתז פולימרים של מבנים עדינים. הרפסודה המתוארת בפרוטוקול זה נחשבת לאחת מהשיטות הפוטנציאליות המבטיחות ביותר להכנת פולימרים ביו-רפואיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מאשרים כי אין ניגוד אינטרסים עם כל ארגון פיננסי בנוגע לחומר הנדון במאמר זה.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (No. 2016YFC0905900), הלאומית המדע הטבעי הקרן של סין (Nos. 81801827, 81872365), תוכנית מחקר בסיסית של מחוז ג'יאנגסו (קרן מדע הטבע, לא. BK20181086), ובבית החולים לסרטן ג'יאנגסו קרן המחקר המדעי (לא. ZK201605).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-hydroxybenzotriazole | Macklin Biochemical Co., Ltd,China | H810970 | ≥97.0% |
| 1,4-dioxane | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10008918 | AR |
| 1-amidinopyrazole Hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | A107935 | 98% |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | E106172 | AR |
| 4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) | Aladdin Co., Ltd., China | A106307 | Analytical reagent (AR) |
| 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid | Aladdin Co., Ltd., China | C132316 | >97%(HPLC) |
| Acetate | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 81014818 | AR |
| Acetone | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10000418 | AR |
| Agarose | Aladdin Co., Ltd., China | A118881 | High resolution |
| Ascorbic acid | Aladdin Co., Ltd., China | A103533 | AR |
| DMSO | Aladdin Co., Ltd., China | D103272 | AR |
| Ethylene glycol | Aladdin Co., Ltd., China | E103319 | AR |
| N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | N129096 | ≥98.0%(HPLC) |
| N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide | ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China | CF259748 | ≥98.0%(HPLC) |
| Ninhydrin | Aladdin Co., Ltd., China | N105629 | AR |
| PBS buffer | Aladdin Co., Ltd., China | P196986 | pH 7.4 |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | pDNA-EGFP | pDNA-EGFP |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | Pdna | pDNA |
| Sodium carbonate decahydrate | Aladdin Co., Ltd., China | S112589 | AR |
| Trimethylamine | Aladdin Co., Ltd., China | T103285 | AR |
References
- Flotte, T. R. Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead. Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).
- Huang, W., et al. Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).
- Wu, Y., et al. Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles. Colloids & Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).
- Quader, S., Kataoka, K. Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy. Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).
- Wu, Y., et al. Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR. Journal of Gene Medicine. 19, e2969 (2017).
- Szwarc, M. ‘Living’ Polymers. Nature. 178, 168-169 (1956).
- Szwarc, M., Rembaum, A. Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer. Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).
- Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. Living supramolecular polymerization. Science. 349, 241 (2015).
- Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization. European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).
- Wu, W., Wang, W., Li, J. Star polymers: Advances in biomedical applications. Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).
- Boyer, C., et al. Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications. Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).
- Keddie, D. J. A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization. Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).
- Wu, Y., et al. Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression. Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).
- Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).
- Friedman, M. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).
- Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).
- Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles. Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).
