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Chemistry

Copolymères de bloc biocompatibles biocompatibles de methionine pour la livraison ciblée de Plasmid d'ADN

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/58527
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 2, 3, 1, 2
1Research Center of Clinical Oncology, Jiangsu Cancer Hospital & Jiangsu Institute of Cancer Research & Nanjing Medical University Affiliated Cancer Hospital, 2Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 3School of Clinical Medicine, Xuzhou Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Ce travail présente la préparation des copolymères biocompatibles biocompatibles de bloc de méthionine (mBG) par l'intermédiaire de la méthode réversible de transfert de chaîne d'addition-fragmentation (RAFT). La capacité de complexation d'ADN plasmide du MBG obtenu et de leur efficacité de transfection ont été également étudiées. La méthode RAFT est très bénéfique pour les monomères polymérisantes contenant des groupes fonctionnels spéciaux.

Abstract

La polymérisation réversible du transfert de chaîne de fragmentation-ajout (RAFT) intègre les avantages de la polymérisation radicale et de la polymérisation vivante. Ce travail présente la préparation des copolymères biocompatibles biocompatibles fonctionnales de méthionine par l'intermédiaire de la polymérisation de RAFT. Tout d'abord, N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide-b-N-(3-aminopropyl)methacrylamide (BNHEMA-b-APMA, BA) a été synthétisé via la polymérisation RAFT à l'aide de 4,4'-azobis(4-acide cyanovaleric) (ACVA) comme un l'agent d'initiation et le dithiobenzoate d'acide 4-cyanopentanoic (CTP) comme agent de transfert de chaîne. Par la suite, N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide-b-N-(3-guanidinopropyl)methacrylamide (méthionine greffée BNHEMA-b-GPMA, mBG) a été préparée en modifiant les groupes d'amine en APMA avec de la méthionine et de la guanidine Groupes. Trois types de polymères de bloc, mBG1, mBG2, et mBG3, ont été synthétisés pour la comparaison. Une réaction de ninhydrin a été employée pour quantifier le contenu d'APMA ; mBG1, mBG2 et mBG3 avaient respectivement 21 %, 37 % et 52 % d'APMA. Les résultats de la chromatographie de perméation de gel (GPC) ont prouvé que les copolymères de BA possèdent des poids moléculaires de 16.200 (BA1), 20.900 (BA2), et 27.200 (BA3) g/mol. La capacité de complexation de l'ADN plasmide (pDNA) des porteurs de gènes copolymères de bloc obtenus a également été étudiée. Les rapports de charge (N/P) étaient 8, 16, et 4 quand le pDNA a été complexe complètement avec mBG1, mBG2, mBG3, respectivement. Lorsque le rapport N/P des polyplexes de mBG/pDNA était plus élevé que 1, le potentiel Zeta de mBG était positif. À un rapport N/P entre 16 et 32, la taille moyenne des particules de polyplexes mBG/pDNA se siant entre 100 et 200 nm. Dans l'ensemble, ce travail illustre un protocole simple et pratique pour la synthèse du porte-avions de copolymère de bloc.

Introduction

Ces dernières années, la thérapie génique a émergé pour la livraison thérapeutique d'acides nucléiques comme médicaments pour traiter toutes sortes de maladies1. Le développement de médicaments géniques, y compris l'ADN plasmide (pDNA) et le petit ARN interférant (siRNA) repose sur la stabilité et l'efficacité du système d'administration de médicaments (DDS)2. Parmi tous les Porteurs de Polymère Cationic, les porteurs de polymères cationic ont les avantages d'une bonne stabilité, d'une faible immunogénicité, et d'une préparation et d'une modification faciles, qui donnent aux porteurs de polymères cationic de larges perspectives d'application3,4. Pour des applications pratiques en biomédecine, les chercheurs doivent trouver un porteur depolymère cationic avec l'efficacité élevée, la faible toxicité, et la bonne capacité de ciblage 5. Parmi tous les porteurs de polymères, les copolymères de bloc sont l'un des systèmes de livraison de médicaments les plus utilisés. Les copolymères de bloc sont intensivement étudiés pour leur propriété d'auto-assemblage et leurs capacités à former des micelles, des microsphères, et des nanoparticules dans la livraisondedrogue 5. Les copolymères de bloc peuvent être synthétisés par l'intermédiaire des méthodes vivantes de polymérisation ou de chimie de clic.

En 1956, Szwarc et coll. ont soulevé le sujet de la polymérisation vivante, la définissant comme une réaction sans réactions en chaîne6,7. Depuis lors, plusieurs techniques ont été développées pour synthétiser les polymères à l'aide de cette méthode; ainsi, la polymérisation vivante est considérée comme un jalon de la science des polymères8. La polymérisation vivante peut être classée dans la polymérisation anionique vivante, lapolymérisation cationic vivante, et la polymérisation radicale de désactivation réversible (RDRP) 9. Les polymérisations anioniques/cationiques vivantes ont une portée limitée d'application en raison de leurs conditions de réaction strictes10. La polymérisation radicale contrôlée/vivante (CRP) a des conditions de réaction douces, disposition commode, et bon rendement et a donc été un foyer de recherche important ces dernières années11. Dans le CRP, les chaînes de propagation actives sont réversiblement passivated en dormantes pour réduire la concentration des radicaux libres et éviter la réaction bimoléculaire des radicaux de chaîne de propagation. La polymérisation d'addition ne peut se poursuivre que si les chaînes de propagation dormantes inactives sont réversiblement animées en radicaux de chaîne. En tant que l'une des formes les plus prometteuses de polymérisation radicale vivante, la polymérisation réversible de transfert de chaîne d'addition-fragmentation (RAFT) est une méthode applicable aux polymères de bloc de rendement avec le poids et la structure moléculaires contrôlés, le poids moléculaire étroit distribution, et portant les groupes fonctionnels12. La clé du succès de la polymérisation RAFT est l'effet des agents de transfert de chaîne, généralement dithioesters, qui possèdent une constante de transfert de chaîne très élevé.

Dans cet article, une méthode de polymérisation RAFT a été conçue pour préparer le polymère de bloc BNHEMA-b-APMA, prenant 4,4'-azobis(4-cyanovaleric acid) (ACVA) comme agent initiateur et 4-cyanopentanoic acide dithiobenzoate (CTP) comme agent de transfert de chaîne. La polymérisation RAFT a été utilisée deux fois pour introduire BNHEMA dans les porteurs de polymères cationiques. Par la suite, les groupes d'amine dans la chaîne d'APMA ont été modifiés avec la méthionine et le réagent de guanidinylation 1-amidinopyrazole hydrochlorure. En faisant l'utilisation des charges positives du réactif de guanidinylation et de la structure de squelette de polymère de methacrylamide, l'efficacité cellulaire d'apaisement des porteurs obtenus de polymère de bloc a été améliorée.

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Protocol

1. Synthèse du polymère BNHEMA (PBNHEMA)

  1. Dissoudre 1,87 g de N, N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide (BNHEMA) dans 1 ml d'eau distillée dans une bouteille de polymérisation.
    REMARQUE : La bouteille de polymérisation est un flacon à fond rond avec un bouchon en caoutchouc et un agitateur magnétique.
  2. Dissoudre 0,03 g de 4-cyanopentanoic acide dithiobenzoate (CTP) et 0,02 g de 4,4'-azobis (4-cyanovalericacid ) (ACVA) en 0.5 mL de 1,4-dioxane dans un beaker de 5 mL. Ensuite, ajoutez la solution CTP et ACVA à la bouteille de polymérisation à partir de l'étape 1.1.
  3. Ventiler le système de réaction dans la bouteille de polymérisation avec de l'azote via trois cycles de gel-pompe-dégel.
    1. Dans le détail, congelez la solution dans la bouteille de polymérisation à l'aide d'un piège à condensat, fixez la bouteille de polyminisation au support de fer, et aspirez et injectez de l'azote dans le mélange de réaction par un conduit incliné avec une aiguille (#9 aiguille, diamètre intérieur 0,65 mm, diamètre externe de 0,9 mm). Sceller la bouteille de polymérisation et décongeler la solution à température ambiante pendant 30 min.
    2. Répétez les cycles de gel-pompe-dégel trois fois.
  4. Placez la bouteille de polymérisation dans un bain à huile de 70 oC et laissez la solution réagir pendant 24 h sous l'atmosphère azotée.
  5. Refroidir la bouteille de polymérisation à 0 oC et ouvrir le bouchon en caoutchouc pour mettre fin au processus de polymérisation.
  6. Prérefroidir l'acétone dans un réfrigérateur de -20 oC pendant 2 h, puis mélanger avec la solution de réaction de l'étape 1.5 à 50:1 (v/v). Après cela, centrifugeà 8 200 x g pendant 10 min pour enlever l'acétone et recueillir le précipité.
  7. Pour purifier le PBNHEMA synthétisé, dissoudre le précipité collecté dans 2 ml d'eau pure, puis mélanger avec 100 ml d'acétone prérefroidie, au ratio de 1:50 (v/v). Centrifuger la solution à 8 200 x g pendant 10 min et recueillir le précipité. Répétez ce processus trois fois.
  8. Séchez le PBNHEMA produit à l'aide d'un séchoir à vide de 50 oC. Une fois séchée, peser la poudre avec un équilibre. Calculer le taux de rendement selon l'équation 1.
    Equation 1(1)
    REMARQUE : Dans cette expérience, le rendement obtenu était de 77,2 %.

2. Synthèse de BNHEMA-b-APMA polymère (BA)

  1. Dissoudre 0,96 g de N-(3-aminopropyl)hydrochlorure de méthacrylamide (APMA) et 0,93 g de PBNHEMA dans 5 ml d'eau distillée dans un bécher de 10 ml.
  2. Dissoudre 0,01 g de 4,4'-azobis (4-cyanovaleric acid) (ACVA) en 0.5 ml de 1,4-dioxane et mélanger avec la solution APMA-PBNHEMA de la partie 2.1.
  3. Transférer le mélange dans une bouteille de polymérisation et ventiler avec de l'azote sec pendant 1 h.
  4. Placez la bouteille de polymérisation dans un bain d'huile de 70 oC et laissez-la réagir pendant 24 h sous l'atmosphère azotée.
  5. Refroidir la bouteille de polymérisation à 0 oC et ouvrir le bouchon en caoutchouc pour mettre fin au processus de polymérisation.
  6. Transférer la solution à l'acétone réfrigéré e à partir de l'étape 1.6, puis centrifuger la solution à 8.200 x g pendant 10 min pour précipiter le BA.
  7. Dissoudre le BA dans 2 ml d'eau distillée et précipiter le polymère dans de l'acétone réfrigéré. Répétez trois fois.
  8. Séchez le BA produit dans un séchoir à vide de 50 oC et pesez la poudre obtenue. Calculer le taux de rendement selon l'équation 2.
    Equation 2
    REMARQUE : Dans cette expérience, le taux de rendement a été calculé à 82,0 %.

3. Déterminer le pourcentage de taupe de l'APMA dans le copolymère BA par l'intermédiaire de la méthode de ninhydrin

REMARQUE : La spectrophotométrie est utilisée pour déterminer le contenu des acides aminés multicomposants. Le principe est une réaction de couleur de la ninhydrique et de l'acide aminé où l'absorption est corrélée avec la teneur en acides aminés dans une certaine mesure13,14.

  1. Dissoudre 5 g de ninhydrique dans 125 ml d'eau distillée bouillante. En outre, dissoudre 5 g de vitamine C dans 250 ml d'eau chaude distillée. Ajouter les 250 ml de solution de vitamine C dans le sens de la ninhydrin sous agitation magnétique. Continuer à remuer pendant 15 min, puis réfrigérer la solution de réaction dans un réfrigérateur à 4 oC.
  2. Sortez la solution du réfrigérateur et filtrez par aspiration à l'aide d'un entonnoir Buchner pour obtenir une teneur réduite en ninhydrique. Recueillir le précipité et le conserver dans un déshydrateur de pentoxide au phosphore.
  3. Dissoudre 85 mg de ninhydrin et 15 mg de ninhydrin réduit dans 10 ml d'éthylène monométhyl éthylique pour préparer la solution de coloration de la ninhydrin.
    REMARQUE : La solution de coloration de Ninhydrin peut réagir avec l'amino de 'amino dans l'APMA et former un composé violet avec une structure comme décrit dans une étude précédente15.
  4. Diluer 1 mL de 0, 1, 10, 100, 1 000 mg/mL aPMA solutions monomer avec 1 mL de tampon d'acétate (2 M, pH 5,4), puis ajouter 1 mL de solution de ninhydrin-colorant, respectivement.
  5. Chauffer les mélanges pendant 15 min dans un bain d'eau bouillante, puis les refroidir à l'eau courante. Laissez les solutions s'asseoir pendant 5-10 min et diluez-les avec 3 ml d'alcool éthylique de 60% et mélangez-les soigneusement. Mesurer l'absorption à 570 nm à l'aide d'un spectrophotomètre et dessiner la courbe standard (Équation 3).
    Equation 3
    REMARQUE : L'équation 3 a été dérivée de l'ajustement linéaire de l'absorption à 570 nm par rapport à la concentration d'APMA.
  6. Dissoudre 0,01 g de BA dans 1 ml d'eau distillée; ajouter 1 ml de tampon d'acétate (2 M, pH 5,4) et 1 ml de solution de coloration de la ninhydrin. Calculer la teneur en molaire de l'APMA en fonction de l'absorption à 570 nm.
    Equation 4
    Equation 5(5)
    Equation 6
    REMARQUE: Les formules de calcul sont les suivantes (Équations 3-6).

4. Synthèse du polymère BA greffé de méthionine (mBA)

  1. Dissoudre 8,9 mg de Fomc-Methionine dans 5 mL de DMSO dans un flacon de récupération.
  2. Ajouter 6,92 mg de 1-éthyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochlorure (EDCl) et 4,86 mg de 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) à la flacon de récupération et réagir à 0 oC pendant 0,5 h.
  3. Dissoudre 2,59 g de BA dans 5 ml de solution DMSO, puis ajouter 50 l de triméthylamine; ajouter cette solution dans le sens goutte à la fiole de récupération (étape 4.2) et laisser la solution réagir pendant 0,5 h à température ambiante.
  4. Dialyser pour retirer le DMSO et la triméthylamine de la solution BA à l'étape 4.3 à l'aide d'un sac de dialyse (MWCO 10 kDa) dans un bécher de 2 L pendant 24 h; remplacer l'eau déionisée toutes les 6 h.
  5. Séchez le mBA obtenu et pesez pour calculer le taux de rendement selon l'équation 7.
    Equation 7
    REMARQUE : Dans ce cas, le taux de rendement a été déterminé à 71 %.
  6. Quantifier le NH2 contenant mBA en mesurant l'absorption à 570 nm pour calculer la quantité de méthionine greffée. Calculer la teneur en molaire de la méthionine selon l'équation 8.
    Equation 8

5. Synthèse de la bnHEMA guanidinated et méthionine conjuguée-b-APMA polymère (mBG)

REMARQUE : Trois copolymères mBA1, mBA2 et mBA3 différents ont été synthétisés. le copolymère mBA3 est utilisé comme exemple dans les étapes suivantes.

  1. Dissoudre le mBA3 contenant 60 'mol de groupe aminé dans 5 ml d'eau pure.
    REMARQUE : Le contenu du groupe Amino a été quantifié à l'aide de la méthode de la ninhydrique telle que décrite à l'étape 3.5.
  2. Dissoudre 40,6 mg (300 'mol) de réagent de guanidinylation 1-amidinopyrazole hydrochlorure dans les solutions mBA.
  3. Ajuster le pH à 9,0 avec la solution saturée de carbonate de sodium et laisser se stabiliser pendant 24 h à température ambiante.
  4. Dialyser le produit mBG avec de l'eau déionisée à l'aide d'un sac de dialyse dans un bécher (MWCO 10 kDa, 2 L) et le conserver sous la forme d'une poudre lyophilisée.
    Le pourcentage de rendement a été calculé à 85 % par l'intermédiaire de l'équation 8.
    Equation 9(8)
  5. Dissoudre la poudre de mBG dans D2O dans les tubes RMN et la caractériser à l'aide de 1H spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (1H RmN)16.

6. Préparation et caractérisation des polyplexes mBG/pDNA

  1. Dissoudre 50 g de pDNA dans 50 oL d'eau sans RNase/DNase.
  2. Dissoudre 1 mg de copolymères mBG dans 1 ml d'eau sans RNase/DNase.
  3. Ajoutez la solution de copolymères mBG directement dans la solution pDNA selon différents rapports d'alimentation, c'est-à-dire différents rapports N/P (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 et 32:1).
    REMARQUE : Le rapport N/P est défini comme le rapport molaire du groupe de guanidine dans le polymère et le groupe de phosphate dans le pDNA, à savoir le rapport molaire de la chaîne de GPMA dans le polymère et le mononucléotide dans le pDNA. Le rapport N/P est calculé en fonction du poids moléculaire de l'azote aminé (N) dans le groupe mBG et phosphate (P) en pDNA.
  4. Mélanger les solutions avec un mélangeur à vortex et leur permettre de reposer pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, disperser le mélange dans une solution tampon de phosphate (PBS, pH 7.4) et préserver les polyplexes mBG/pDNA obtenus à 4 oC pour les expériences de suivi.
    REMARQUE : La taille moyenne des particules et le potentiel Zeta de mBG et les complexes ont été détectés à l'aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS)17.
  5. Diluer 10 L des solutions polyplex mBG/pDNA avec 1 mL de PBS (pH 7,4) dans les cellules d'échantillon potentield DLS et Zeta.
    REMARQUE : La taille des particules et la détection potentielle zeta ont été effectuées trois fois et une moyenne des trois valeurs a été prise.

7. Expérience de retardement électrophoretic des polyplexes de mBG/pDNA

REMARQUE : Une expérience de retard électrophoretic a été conduite pour déterminer le rapport minimum de charge.

  1. Prenez cinq groupes de polyplexes mBG/pDNA avec différents rapports N/P (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 et 32:1) contenant 50 g de pDNA.
  2. Ajouter un tampon de chargement 6x aux échantillons polyplex mBG/pDNA jusqu'à une concentration finale de 1x.
  3. Ajouter les solutions aux gels agarose de 1,5% et faire fonctionner le gel à 90 mV pendant 15 min, en utilisant la pDNA comme contrôle.
  4. Prenez des photos des gels à l'aide d'un imageur de gel.

8. Cytotoxicité des polyplexes mBG/pDNA

  1. Seed MCF-7 cellules dans les plaques de 96 puits à une densité de 104 cellules par puits. Ensuite, la culture des cellules pendant 12 h en utilisant le milieu DMEM (10% FBS et 1% antibiotique) dans un incubateur humidifié de 37 oC fourni avec 5% de CO2.
  2. Remplacer le milieu de culture par un milieu de culture DMEM sans antibiotiques contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et des polyplexes mBG/pDNA de différents rapports de charge (N/P 4, 8, 16 et 32, n-6) pendant 6 h, en prenant des cellules ajoutées avec des volumes égaux de solution PBS que le contrôle. Ensuite, remplacez le milieu de culture par 150 L de 1640 frais milieu et plus de culture des cellules pendant 24 h.
  3. Ajouter 5 mg/mL 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromure (MTT) solution (20 L/well) aux plaques de 96 puits et la culture des cellules pour 4 h.
  4. Retirez la solution et ajoutez 150 L de DMSO à chaque puits et secouez les plaques de 96 puits 30 sec.
  5. Mesurer la densité optique (OD) à 490 nm avec un lecteur de microplaque pour montrer la viabilité de la cellule. Calculer le pourcentage de viabilité cellulaire selon l'équation 9.
    Viabilité des Equation 10 cellules % (9)

9. Efficacité de transfection des polyplexes mBG/GFP-pDNA

  1. Dissoudre 50 g de pDNA contenant la protéine fluorescente verte (GFP) du gène reporter (GFP) pDNA (GFP-pDNA) dans 50 'L d'eau sans RNase/DNase. Dissoudre ensuite 1 mg de copolymères mBG dans 1 ml d'eau sans RNase/DNase. Mélanger la solution pDNA et mBG à un rapport de charge (N/P) de 1:1, 4:1, 8:1, 16:1 et 32:1 et incuber pendant 30 min à température ambiante. Dispersez la solution de polyplexes mBG/GFP-pDNA à l'aide d'ondes ultrasoniques (30 s) et entreposez-les à 4 oC pour les expériences de suivi.
    REMARQUE : Le rapport N/P est calculé en fonction du poids moléculaire de l'azote aminé (N) dans le groupe mBG et phosphate (P) en pDNA.
  2. Seed MCF-7 cellules à une densité de 2 à 105 cellules par puits dans une plaque de 6 puits et les culture à 37 oC et 5% CO2 dans un incubateur humidifié pendant 12 h.
  3. Remplacez le milieu de culture par le milieu de culture frais contenant des polyplexes mBG/GFP-pDNA de différents rapports N/P (4, 8, 16 et 32) pendant 6 h.
  4. Remplacer le milieu par 2 ml de moyen RPMI1640 frais et la culture pendant 48 h.
  5. Recueillir les cellules et détecter la fluorescence verte avec un cytomètre de flux.

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Representative Results

La BNHEMA a été alimentée en fonction du degré objectif de polymérisation indiqué dans le tableau1; la procédure de synthèse de mBG est montrée dans la figure 1. Tout d'abord, l'homopolymère de BNHEMA a été préparé par l'intermédiaire de la méthode réversible de transfert de chaîne d'addition-fragmentation (RAFT) dans le système d'eau-dioxane, utilisant le dithiobenzoate d'acide 4-cyanopentanoic comme agent de transfert de chaîne. Deuxièmement, PBNHEMA a été utilisé comme agentde transfert de chaîne pour préparer le polymère de bloc BNHEMA- b-APMA. Le monomère APMA a été nourri selon le degré objectif de polymérisation indiqué dans le tableau 1. La chromatographie par perméation des gels (GPC) a été réalisée pour détecter le poids moléculaire de BA avec différents rapports d'alimentation (tableau 1). La teneur réelle en molaires des chaînes APMA dans BA avec différents rapports d'alimentation a été détectée par la méthode de la ninhydrique (tableau 1). Selon notre étude précédente5, nous avons utilisé mBG3 dans la présente étude parce qu'il a le contenu le plus élevé APMA. Enfin, la méthionine a été greffée à la chaîne d'APMA et les groupes résiduels d'amine ont été complètement guanidinylated pour préparer mBG. La figure 2 est la1 H données RMN de mBG. La taille moyenne des particules et le potentiel Zeta des polyplexes mBG/pDNA étaient respectivement de 124 nm et de 15,7 mV, à un rapport N/P de 16 (figure 3).

Le retardement électrophoretique est une technique rapide et simple qui implique la séparation de l'AIndin non lié et du polymère/pDNA polyplex basé sur les différences dans leurs mobilités électrophorèstiques dans les gels d'agarose. La bande de pDNA non liée peut se déplacer dans le gel d'agarose sous l'action du champ électrique. Dans l'expérience de retard électrophoretic (Figure 4), pDNA (avec un rapport N/P de 0) peut se déplacer sans retenue dans le gel d'agarose et a été observé comme une bande dans l'imageur de gel. Lorsque le pDNA est complexe avec du mBG, le mouvement de pDNA est retardé et, par la suite, la luminosité de la bande est réduite. La figure 4 montre que le mBG peut complètement complexe le pDNA lorsque le N/P est supérieur à 4.

La cytotoxicité des polyplexes mBG/pDNA a été mesurée à l'aide de l'analyse Standard mTT (Figure 5). Les résultats montrent que les polyplexes mBG/pDNA ont évidemment une cytotoxicité plus faible que les polyplexes de l'Ile-du-Prince-Édouard/PDNA aux ratios N/P de 4, 8, 16 et 32 dans la lignée cellulaire MCF-7 (p-lt;0,05, n-3, aNOVA à sens unique). En outre, la cytotoxicité des polyplexes de mBG/pDNA augmente avec le rapport N/P accru. L'augmentation de la cytotoxicité des polyplexes de mBG/pDNA avec un N/P accru est le résultat de la composante de GPMA chargée positivement. Les polyplexes de mBG/pDNA ont montré moins de cytotoxicité que les polyplexes de l'Ile-du-Prince-Édouard/pDNA, qui peuvent être attribués à la présence de BNHEMA dans les copolymères protégeant la charge de surface des polymères cationic.

Le rapport N/P utilisé dans l'expérience de transfection de pDNA a été sélectionné en fonction des résultats de cytotoxicité. Comme le montre la figure 6, les capacités de transfection de mBG1, mBG2 et mBG3 ont été comparées en mesurant l'intensité de la fluorescence GFP et les résultats ont montré que le mBG3 est le porteur génétique optimal. Bien que les polyplexes de l'Ile-du-Prince-Édouard/PDNA ayant un rapport N/P de 8 aient une efficacité de transfection similaire à celle des polyplexes mBG3/pDNA avec un rapport N/P de 32, l'Ile-du-Prince-Édouard a une cytotoxicité plus élevée et n'a pas de fonctions telles que la charge de médicaments, ce qui limite son application dans le domaine biomédical. Les résultats ont révélé que l'augmentation du contenu AMPA est essentielle pour améliorer l'efficacité de la transfection du copolymère mBG. Comme nous l'avons mentionné dans une étude antérieure5, peptides pénétrants de cellules (PPC) sont 9-35 peptides cationic ou amphipathiques mer avec une capacité de pénétrer la membrane cellulaire. Le groupe de guanidine est un CPP cationic qui peut être conjugué dans un polymère pour augmenter la transfection du polymère/pDNA polyplex par une voie transmembrane protéine-indépendante. Par conséquent, le copolymère de mBG intègre des avantages relatifs aux groupes de guanidine pour la pénétration de cellules et au composant de BNHEMA pour le blindage, montrant le grand potentiel pour la livraison efficace de gène.

échantillon BHEMA -b-APMA Mw Pdi
Valeur théorique du contenu APMA (%) Valeur réelle du contenu APMA (%)
BNHEMA90-b-APMA30(BA1) 25% 21% 16200 1.25
BNHEMA90-b-APMA60(BA2) 40% 37% 20900 1.21
BNHEMA90-b-APMA90(BA3) 50% 52% 27200 1.25

Tableau 1 : Composition de BNHEMA-b-APMA par raft polymérisation.

Figure 1
Figure 1 : Procédure de synthèse schématique de mBG. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : 1Spectre S NMR de mBG en D2O. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Taille des particules et potentiel Zeta des polyplexes.
(A) La taille des particules de BA/pDNA. (B) La taille des particules de mBG/pDNA. (C) Zeta potentiel de BA/pDNA. (D) Zeta potentiel de mBG/pDNA. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Images d'électrophoresis de gel d'Agarose de BA3
(a) , mBA3 (b) et mBG3 (c) polyplexes à différents rapports de charge.

Figure 5
Figure 5 : Cytotoxicité des polyplexes mBG/pDNA à différents rapports N/P dans la lignée cellulaire MCF7.
Le polyplex de l'Ile-du-Prince-Édouard/pDNA a été utilisé comme contrôle. Les données ont été présentées comme moyennes et SD (n-3). indique le p-lt;0,05 par rapport au groupe de l'Ile-du-Prince-Édouard. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : L'efficacité de la transfection des polyplexes mBG/pDNA au rapport N/P de 4, 8, 16 et 32 a été mesurée par cytomètre d'écoulement.
Les données ont été montrées comme moyennes EtA (n-3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Cette étude a introduit une série de porteurs de gènes cationiques de polymère de bloc de BNHEMA-b-APMA. Ces polymères de bloc ont été synthétisés par l'intermédiaire de la méthode réversible de transfert de chaîne d'addition-fragmentation (RAFT). Le segment hydrophile BNHEMA a été introduit pour améliorer la solubilité. Les groupes de méthionine et de guanidine ont été modifiés pour améliorer la capacité cible et l'efficacité de la transfection5. Le contenu de la chaîne APMA a augmenté et la guanidinylation en copolymère mBG a réduit la taille des particules des polyplexes mBG/pDNA. La taille des particules et le potentiel de surface rendent le complexe facile à traverser la membrane cellulaire et applicable à la transfection. Les points critiques de l'expérience résident dans le contrôle strict du rapport molaire du monomère bnHEMA et du CTP à 45:1, du rapport molaire de CTP et d'ACVA à 2:1, et de la température à 70 oC. Pendant le processus de purification, le rapport de volume de l'acétone prérefroidi et de la solution de polymère doit être supérieur à 50:1.

Avec la même valeur N/P, avec l'augmentation de la proportion de la chaîne APMA, la taille des particules des polyplexes mBG/pDNA diminue. Ces résultats indiquent que l'augmentation du contenu de la chaîne APMA et la guanidinylation peuvent réduire la taille des particules. La taille des particules et le potentiel de surface rendent le complexe facile à transporter à travers la membrane cellulaire et applicable à la transfection. L'électrophorèse de gel a été employée pour étudier la relation entre le complexing et le rapport de N/P et les données ont montré que le N/P minimum est 4. Cette étude fournira des données de base précieuses pour une étude plus approfondie des porteurs de gènes cationiques. Cependant, BNHEMA-b-APMA n'est pas facilement dégradé et son processus de métabolisme in vivo n'est pas assez clair. Par conséquent, l'application clinique est toujours un grand défi pour les porteurs de gène de polymère cationic.

L'efficacité élevée et la faible toxicité des porteurs de gène sont les conditions nécessaires à leur utilisation clinique. Les vecteurs de gènes polymères cationiques ont des avantages de bonne stabilité et aucune immunogénicité et ils peuvent être préparés et modifiés facilement.

La polymérisation RAFT est largement utilisée dans la polymérisation des monomères, y compris le styrène, le méthacrylate, l'acrylonitrile et l'acrylamide. Ce type de processus de polymérisation peut être effectué à basse température. En outre, la polymérisation RAFT peut être utilisée pour synthétiser les polymères des structures fines. La polymérisation RAFT décrite dans ce protocole est considérée comme l'une des méthodes potentielles les plus prometteuses pour la préparation des polymères biomédicaux.

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Disclosures

Les auteurs certifient qu'il n'y a pas de conflit d'intérêts avec une organisation financière concernant les documents discutés dans cet article.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue par le National Key Research and Development Program of China (No. 2016YFC0905900), National Natural Science Foundation of China (Nos. 81801827, 81872365), Basic Research Program of Jiangsu Province (Natural Science Foundation, No. BK20181086), et Jiangsu Cancer Hospital Scientific Research Fund (No. ZK201605).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-hydroxybenzotriazole Macklin Biochemical Co., Ltd,China H810970 ≥97.0%
1,4-dioxane Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China 10008918 AR
1-amidinopyrazole Hydrochloride Aladdin Co., Ltd., China A107935 98%
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride Aladdin Co., Ltd., China E106172 AR
4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) Aladdin Co., Ltd., China A106307 Analytical reagent (AR)
4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid Aladdin Co., Ltd., China C132316 >97%(HPLC)
Acetate Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China 81014818 AR
Acetone Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China 10000418 AR
Agarose Aladdin Co., Ltd., China A118881 High resolution
Ascorbic acid Aladdin Co., Ltd., China A103533 AR
DMSO Aladdin Co., Ltd., China D103272 AR
Ethylene glycol Aladdin Co., Ltd., China E103319 AR
N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride Aladdin Co., Ltd., China N129096 ≥98.0%(HPLC)
N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China CF259748 ≥98.0%(HPLC)
Ninhydrin Aladdin Co., Ltd., China N105629 AR
PBS buffer Aladdin Co., Ltd., China P196986 pH 7.4
Plasmid DNA BIOGOT Co., Ltd, China pDNA-EGFP pDNA-EGFP
Plasmid DNA BIOGOT Co., Ltd, China Pdna pDNA
Sodium carbonate decahydrate Aladdin Co., Ltd., China S112589 AR
Trimethylamine Aladdin Co., Ltd., China T103285 AR

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Chimie Numéro 150 Transfert de chaîne de fragmentation réversible RAFT système d'administration de médicaments DDS méthionine guanidine N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochlorure APMA N,N-bis(2-hydroxyethyl) méthacrylamide BNHEMA
Copolymères de bloc biocompatibles biocompatibles de methionine pour la livraison ciblée de Plasmid d'ADN
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Wu, Y., Zhang, W., Zhang, J., Mao,… More

Wu, Y., Zhang, W., Zhang, J., Mao, Z. X., Ding, L., Li, H., Ma, R., Tang, J. H. Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery. J. Vis. Exp. (150), e58527, doi:10.3791/58527 (2019).

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