दृश्य और ट्रैकिंग अंतर्जात MRNAs में लाइव Drosophila मेलेनोगैस्टर अंडे मंडलों
Summary
यहाँ, हम आणविक बीकन का उपयोग कर रहते Drosophila melanogaster अंडे कक्ष में अंतर्जात MRNA तस्करी के दृश्य, पता लगाने, विश्लेषण और ट्रैकिंग के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी, और खुला स्रोत विश्लेषण सॉफ्टवेयर.
Abstract
फ्लोरोसेंट आधारित इमेजिंग तकनीक, प्रकाश माइक्रोस्कोपी में विकास के साथ संयोजन में, कैसे सेल जीवविज्ञानी लाइव सेल इमेजिंग अध्ययन का संचालन क्रांति की है. RNAs का पता लगाने के लिए तरीके बहुत विस्तार किया है के बाद से मौलिक अध्ययन जीन अभिव्यक्ति विनियमन के लिए साइट-विशिष्ट MRNA स्थानीयकरण से जुड़े. गतिशील MRNA प्रक्रियाओं अब दृष्टिकोण है कि mRNAs का पता लगाने के माध्यम से कल्पना की जा सकती है, माइक्रोस्कोपी सेट अप है कि काफी तेजी से आणविक व्यवहार के गतिशील रेंज पर कब्जा करने के साथ युग्मित. आण्विक बीकन प्रौद्योगिकी एक संकरीकरण-आधारित दृष्टिकोण है जो जीवित कोशिकाओं में अंतर्जात प्रतिलिपिओं का प्रत्यक्ष पता लगाने में सक्षम है। आण्विक बीकन हैं हेयरपिन के आकार का, आंतरिक रूप से मज्जशीतन, एकल न्यूक्लिओटाइड विभेदकारी न्यूक्लिक एसिड जांच, जो केवल एक अद्वितीय लक्ष्य अनुक्रम के लिए संकरीकरण पर fluoresce. जब उन्नत फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ युग्मित, वे एक mRNAs के intracellular आंदोलन के स्थानिक और लौकिक ट्रैकिंग प्रदर्शन करने के लिए सक्षम. हालांकि इस तकनीक अंतर्जात प्रतिलिपि का पता लगाने में सक्षम एकमात्र तरीका है, सेल जीवविज्ञानियों अभी तक पूरी तरह से लाइव सेल इमेजिंग के लिए इस तरह की जांच डिजाइन करने में कठिनाइयों के कारण इस तकनीक को गले नहीं लगाया है. एक नया सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग, PinMol,सबसे अच्छा कुशलता से एक जीवित सेल के भीतर MRNA लक्ष्य क्षेत्रों को संकरित करने के लिए उपयुक्त जांच के बढ़ाया और तेजी से डिजाइन के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, उच्च संकल्प, वास्तविक समय छवि अधिग्रहण और वर्तमान, खुला स्रोत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर एक परिष्कृत डेटा उत्पादन के लिए अनुमति देते हैं, जटिलता की एक बेहतर मूल्यांकन करने के लिए अग्रणी गतिशील MRNA के जीवन चक्र में शामिल प्रक्रियाओं अंतर्निहित.
यहाँ हम डिजाइन और Drosophila melanogaster अंडे कक्षों में आणविक बीकन देने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. अंतर्जात मातृ MRNAs के प्रत्यक्ष और अत्यधिक विशिष्ट पता लगाने और दृश्य कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से किया जाता है. इमेजिंग डेटा संसाधित और Icy सॉफ्टवेयर में वस्तु का पता लगाने और ट्रैकिंग का उपयोग कर mRNAs, जो ले जाया जाता है और oocyte के भीतर विशेष क्षेत्रों के लिए स्थानीयकृत के गतिशील आंदोलन के बारे में विवरण प्राप्त करने के लिए विश्लेषण किया है।
Introduction
कोशिका जीव विज्ञान अध्ययन है कि स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ गतिशील घटनाओं कल्पना फ्लोरोसेंट आधारित लाइव सेल इमेजिंग तकनीक के विकास के द्वारा संभव बनाया गया है. वर्तमान में, विवो एमएमआरएनए दृश्य में प्रौद्योगिकियों के माध्यम से हासिल किया जाता है जो आरएनए एप्टीमर-प्रोटीन इंटरैक्शन पर आधारित होती हैं, आरएनए एप्टीमर-प्रेरित फ्लोरोसेंट कार्बनिक रंगों और न्यूक्लिक एसिड जांच के अनीलन1,2, 3. वे सभी उच्च विशिष्टता, संवेदनशीलता और संकेत-से-पृष्ठभूमि अनुपात प्रदान करते हैं। हालांकि, आरएनए aptamer केंद्रित दृष्टिकोण व्यापक आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता है, जहां एक transgene कृत्रिम संरचनात्मक रूपांकनों कि प्रोटीन या कार्बनिक डाई बाइंडिंग के लिए आवश्यक हैं के साथ एक आरएनए व्यक्त करने के लिए इंजीनियर है. उदाहरण के लिए, MS2/MCP प्रणाली एक transgene के सह-अभिव्यक्ति की आवश्यकता है एक आरएनए निर्माण बैक्टीरियोफेज MS2 कोट प्रोटीन (MCP) के लिए बाध्यकारी अनुक्रम के कई अग्रानुक्रम दोहराता युक्त व्यक्त, और एक और transgene एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग एमसीपी 4,5के लिए जुड़े . आरएनए में इस तरह के माध्यमिक संरचनात्मक रूपांकनों के अलावा, एक भारी फ्लोरोसेंटी टैग प्रोटीन के साथ, चिंता व्यक्त की है कि देशी आरएनए प्रक्रियाओं प्रभावित हो सकता है6. एक तकनीक है कि इस चिंता का समाधान और अतिरिक्त अद्वितीय लाभ प्रदान करता है न्यूक्लिक एसिड आधारित दृष्टिकोण, आणविक बीकन (MBs) है. एम बी अंतर्जात एमआरएनए के मल्टीप्लेक्स का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं, एकल न्यूक्लिओटाइड विविधताओं के भेदभाव, और लक्ष्य MRNA7,8के साथ संकरीकरण के तेजी से गतिकीय. एम बी ओलिगोन्यूक्लिओटाइड जांच कर रहे हैं जो एक बार वे अपने लक्ष्यों को संकरित करने के बाद एक फ्लोरोजेनिक अनुरूप परिवर्तन से गुजरने से पहले एक शंकाबाल पिन गुना में रहते हैं (चित्र 1 सी)9. कई समूहों दोनों गैर-कोडिंग आरएनए (microRNAs और lncRNAs)10,11,12,13, आरएनए रेट्रोवायरस14 और गतिशील डीएनए प्रोटीन का पता लगाने के लिए MBs का उपयोग करने में सफलता मिली है बातचीत15| वे सफलतापूर्वक विभिन्न जीवों और ऊतकों में इमेजिंग के लिए नियोजित किया गया है, जैसे ज़ेब्राफ़िश भ्रूण16, न्यूरॉन्स13, ट्यूमर ऊतक17, भेद कार्डियोमायोसाइट्स18, और साल्मोनेला 19.
यहाँ हम एक माइक्रोस्कोपी सेट अप है कि सक्रिय आणविक परिवहन के गतिशील रेंज पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त है के साथ मिलकर रहने वाले डी मेलेनोगैस्टर अंडे कक्षों में अंतर्जात MRNAs के लिए डिजाइन, वितरण और पता लगाने के दृष्टिकोण का वर्णन. डी मेलेनोगैस्टर अंडा चैम्बर ने विकास अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक आदर्श बहुकोशिकीय मॉडल प्रणाली के रूप में कार्य किया है, प्रारंभिक जर्मलाइन स्टेम सेल डिवीजन और मातृ जीन अभिव्यक्ति से खंडीय शरीर योजना20के उत्पादन के लिए, 21| अंडे कक्षों आसानी से अलग कर रहे हैं, बड़े और पारदर्शी, और पूर्व vivo विश्लेषण के घंटे का सामना करने में सक्षम, उन्हें अत्यधिक इमेजिंग प्रयोगों के लिए अनुकूल बना रही है. बहुत काम सक्रिय रूप से अनुवाद किया जा रहा से पहले असतत subcellular क्षेत्रों के लिए मातृ प्रतिलिपि के असममित स्थानीयकरण पर ध्यान केंद्रित किया है. विशेष रूप से, oskar MRNA स्थानीयकरण और oocyte के पीछे पोल पर इसके बाद अनुवाद एक कसकर विनियमित तरीके से एक घातक bicaudal भ्रूण phenotype22से बचने के लिए होना चाहिए. ऑस्कर एनआरएनए को 15 जर्मलाइन कोशिकाओं में लिखा जाता है, जिसे नर्स कोशिकाएं कहा जाता है, और सक्रिय रूप से कोशिकाद्रव्यी पुलों के माध्यम से ले जाया जाता है, जिसे वलय नहरों कहा जाता है, अंडाणु में, जर्मलाइन कोशिका जो परिपक्व अंडा बन जाती है और अंततः निषेचित होती है (चित्र 1क ). गतिशील भर्ती और oskar MRNP से करने के लिए और से प्रोटीन कारकों के आदान-प्रदान के बारे में पहले से ही उपलब्ध जानकारी की काफी राशि, अपनी लंबी दूरी की intracellular यात्रा के साथ, oskar अध्ययन करने के लिए एक पसंदीदा उम्मीदवार बनाते हैं MRNA जीवन चक्र की कई प्रक्रियाओं. MBs MRNA स्थानीयकरण की प्रक्रिया के बारे में विवरण खुलासा करने और प्रोटीन कारकों है कि Drosophila oogenesis के दौरान MRNA परिवहन को नियंत्रित करने के विनियमन और समारोह को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है. विशेष रूप से, नर्स कोशिकाओं में MBs microin्यइजेक्टिंग और लाइव सेल इमेजिंग प्रयोगों प्रदर्शन द्वारा, अंतर्जात mRNAs की ट्रैकिंग संभव है8,23.
यहाँ प्रस्तुत रोडमैप एक पूरी प्रक्रिया के कदम प्रदान करता है, एक जीवित सेल इमेजिंग प्रयोग बाहर ले जाने से MBs का उपयोग कर, इमेजिंग डेटा प्राप्त करने के लिए, डेटा विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए अपने मूल सेलुलर वातावरण में अंतर्जात MRNA ट्रैक. कदम संशोधित किया जा सकता है और आगे अपने स्वयं के प्रयोगशाला सेटिंग के भीतर अन्य ऊतकों / सेल प्रकार के साथ काम कर रहे शोधकर्ताओं की जरूरतों को पूरा करने के लिए अनुकूलित.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila अंडे कक्षों में अंतर्जात MRNA तस्करी का लाइव दृश्य अब आसानी से PinMol सॉफ्टवेयर के साथ डिजाइन किया जा सकता है, जो विशिष्ट, कुशल, और nuclease प्रतिरोधी MBs, के उपयोग पर निर्भर करता है। MBs एक लक्ष्य MRNA के भीतर अद?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ऑसकर-MS2 के लिए Salvatore A.E. Marras (सार्वजनिक स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान केंद्र, Rutgers विश्वविद्यालय) के संश्लेषण, लेबलिंग और आणविक बीकन के शुद्धिकरण के लिए धन्यवाद, और डैनियल सेंट जॉन्स्टन (गर्दन संस्थान, कैम्ब्रिज विश्वविद्यालय) के लिए MCP-GFP ट्रांसजेनिक मक्खी स्टॉक. इस काम को एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन केअर अवार्ड 1149738 और डीपीबी को व्यावसायिक स्टाफ कांग्रेस-CUNY पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Spectrofluorometer | Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon | n/a | Photon counting spectrofluorometer |
| Quartz cuvette | Fireflysci (former Precision Cells Inc.) | 701MFL | |
| Dumont #5 tweezer | World Precision Instruments | 501985 | Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Cover slip No.1 22 x 40mm | VWR | 48393-048 | |
| Dissecting microscope | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| CO2 fruit fly anesthesia pad | Genesee Scienific | 59-114 | |
| Tris-HCL pH7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Spinning disc confocal microscope | Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera | Hamamatsu | n/a | |
| PatchMan NP 2 Micromanipulator | Eppendorf Inc. | 920000037 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf Inc. | 920010504 | |
| Injection needle: Femtotips II | Eppendorf Inc. | 930000043 | |
| Loading tip: 20ul Microloader | Eppendorf Inc. | 930001007 | |
| Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
| Dry yeast | Any grocery store | n/a | |
| Computer, > 20 GB RAM | Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing |
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