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Biology

Visualización y seguimiento de ARNm endógenos en cámaras de huevo Drosophila melanogaster en vivo

Published: June 4, 2019 doi: 10.3791/58545
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1Biological Sciences Department Hunter College, City University of New York, 2Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Graduate Center, City University of New York

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la visualización, detección, análisis y seguimiento del tráfico endógeno de ARNm en cámara de óvulos Drosophila melanogaster en vivo utilizando balizas moleculares, microscopía confocal de disco giratorio y análisis de código abierto Software.

Abstract

Las técnicas de diagnóstico por imágenes basadas en la fluorescencia, en combinación con los desarrollos de la microscopía ligera, han revolucionado la forma en que los biólogos celulares realizan estudios de imágenes de células vivas. Los métodos para detectar ARN se han ampliado considerablemente desde que los estudios seminales vincularon la localización de ARNm específica del sitio con la regulación de la expresión génica. Los procesos dinámicos de ARNm ahora se pueden visualizar a través de enfoques que detectan ARNm, junto con configuraciones de microscopía que son lo suficientemente rápidas como para capturar el rango dinámico de comportamiento molecular. La tecnología de baliza molecular es un enfoque basado en la hibridación capaz de detectar directamente transcripciones endógenas en células vivas. Las balizas moleculares son sondas de ácido nucleico con forma de horquilla, acondicionadas internamente y discriminantes de un solo nucleótido, que fluoran sólo tras la hibridación a una secuencia de diana única. Cuando se combina con microscopía de fluorescencia avanzada e imágenes de alta resolución, permiten realizar un seguimiento espacial y temporal del movimiento intracelular de ARNm. Aunque esta tecnología es el único método capaz de detectar transcripciones endógenas, los biólogos celulares aún no han adoptado completamente esta tecnología debido a las dificultades en el diseño de este tipo de sondas para la toma de imágenes de células vivas. Una nueva aplicación de software, PinMol,permite un diseño mejorado y rápido de las sondas más adecuadas para hibridar eficientemente a las regiones objetivo de ARNm dentro de una célula viva. Además, la adquisición de imágenes en tiempo real y el software de análisis de imágenes actual de código abierto permiten una salida de datos refinada, lo que conduce a una evaluación más fina de la complejidad subyacente a los procesos dinámicos involucrados en el ciclo de vida del ARNm.

Aquí presentamos un protocolo integral para diseñar y entregar balizas moleculares en cámaras de óvulos Drosophila melanogaster. La detección y visualización directa y muy específica de arNM maternos endógenos se realiza mediante microscopía confocal de disco giratorio. Los datos de imagen se procesan y analizan mediante la detección y seguimiento de objetos en el software Icy para obtener detalles sobre el movimiento dinámico de los ARNm, que se transportan y localizan a regiones especializadas dentro del ovocitos.

Introduction

Los estudios de biología celular que visualizan eventos dinámicos con resolución espacial y temporal han sido posibles gracias al desarrollo de técnicas de imagen de células vivas basadas en fluorescencia. En la actualidad, la visualización in vivo de ARNm se logra a través de tecnologías basadas en interacciones de aptámero-proteína de ARN, fluorescencia inducida por aptámero de ARN de tintes orgánicos y recocido de la sonda de ácido nucleico1,2, 3. Todos ellos ofrecen alta especificidad, sensibilidad y relación señal-fondo. Sin embargo, los enfoques centrados en el ARN requieren una manipulación genética extensiva, donde un transgén está diseñado para expresar un ARN con motivos estructurales artificiales que son necesarios para la unión a proteínas o tintes orgánicos. Por ejemplo, el sistema MS2/MCP requiere la coexpresión de un transgén que exprese una construcción de ARN que contenga múltiples repeticiones en tándem de la secuencia de unión para la proteína de recubrimiento del bacteriófago MS2 (MCP), y otro transgén que codifica una proteína fluorescente fusionado con MCP4,5. La adición de estos motivos estructurales secundarios al ARN, junto con una proteína voluminosa con etiqueta fluorescente, ha suscitado preocupaciones de que los procesos de ARN nativos puedan verse afectados6. Una tecnología que aborda esta preocupación y ofrece ventajas únicas adicionales es el enfoque basado en ácido nucleico, balizas moleculares (MB). Los MB permiten la detección múltiplex de ARNm endógenos, la discriminación de variaciones de nucleótidos individuales y la rápida cinética de la hibridación con ARNm7objetivo,8. Los MF son sondas de oligonucleótidos que permanecen en un pliegue de horquilla apenada antes de someterse a un cambio de conformación fluorogénica una vez que hibridan a sus objetivos (Figura1C)9. Varios grupos han tenido éxito en el uso de MBs para detectar ARN no codificantes (microRNAs y lncRNAs)10,11,12,13, retrovirus de ARN14 y proteínas de ADN dinámicas interacciones15. Se han empleado con éxito para la toma de imágenes en diversos organismos y tejidos, tales como embriones de pez cebra16, neuronas13, tejido tumoral17, cardiomiocitos diferenciadores18,y Salmonella 19.

Aquí describimos el enfoque de diseño, entrega y detección de ARNm endógenos en cámaras de huevo D. melanogaster vivas junto con una configuración de microscopía que es lo suficientemente rápida como para capturar el rango dinámico del transporte molecular activo. La cámara de óvulos D. melanogaster ha servido como un sistema modelo multicelular ideal para una amplia gama de estudios de desarrollo, desde la división temprana de células madre germinales y la expresión génica materna hasta la generación de plan corporal segmentado20, 21. Las cámaras de huevo son fácilmente aisladas, grandes y translúcidas, y son capaces de soportar horas de análisis ex vivo, lo que las hace altamente susceptibles a experimentos de imágenes. Mucho trabajo se ha centrado en la localización asimétrica de transcripciones maternas a regiones subcelulares discretas antes de ser traducidas activamente. En particular, la localización del ARNm de oskar y su posterior traducción en el polo posterior del ovocitos deben producirse de manera estrictamente regulada para evitar un fenotipo22de embrión bicaudalletal letal. el ARNm de oskar se transcribe en las 15 células germinales, llamadas células de la barulgante, y se transporta activamente a través de puentes citoplásmicos, llamados canales de anillo, en el ovocitos, la célula germinal que se convierte en el óvulo maduro y, en última instancia, se fertiliza (Figura1A ). La considerable cantidad de información ya disponible sobre el reclutamiento dinámico y el intercambio de factores proteicos hacia y desde oskar mRNP, junto con sus viajes intracelulares de largo alcance, hacen de Oskar un candidato preferido para estudiar los muchos procesos del ciclo de vida del ARNm. Los MB han sido fundamentales para revelar detalles sobre el proceso de localización de ARNm y descifrar la regulación y función de los factores proteicos que controlan el transporte de ARNm durante la oogénesis de Drosophila. En particular, mediante la microinyección de MB en células de enfermería y la realización de experimentos de imágenes de células vivas, el seguimiento de los ARNm endógenos es posible8,23.

La hoja de ruta presentada aquí ofrece los pasos de un proceso completo, desde la realización de un experimento de imágenes de células en vivo utilizando MBs, la adquisición de datos de imágenes, hasta la realización de análisis de datos para realizar un seguimiento del ARNm endógeno en su entorno celular nativo. Los pasos se pueden modificar y optimizar aún más para satisfacer las necesidades de los investigadores que trabajan con otros tejidos/tipos de células dentro de su propio entorno de laboratorio.

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Protocol

1. Diseño de MBs para imágenes de células en vivo

  1. Doble la secuencia de ARN de destino para predecir la estructura secundaria del objetivo mRNA utilizando la "forma de ARN" del servidor mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
    1. Pegue/cargue la secuencia de destino en formato FASTA, seleccione una suboptisidad del 5 o 10% (estructuras con una energía libre de plegado dentro del 5 o 10% del valor MFE, respectivamente) y ajuste el número máximo de plegados calculados en consecuencia (por ejemplo, mayor para el 10% sub-óptimo).
      Nota: La inclusión de estructuras secundarias subóptimas al diseñar MBs permite la identificación de regiones dentro del ARNm objetivo que pueden ser más flexibles o más rígidas de lo previsto para la estructura de energía libre mínima (MFE) por sí sola, lo que mejora la diseño general de los MB adecuados para imágenes de células vivas.
    2. Seleccione un "trabajo inmediato" para los objetivos de ARNm de 800 nucleótidos (nt), o un "trabajo por lotes" para longitudes de ARNm entre 801 y 8.000 nt. Guarde el archivo "ss-count" como archivo de texto simple.
  2. Utilice el archivo "ss-count" obtenido en el paso 1.1 como entrada para el programa PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) con los parámetros deseados, para diseñar varios MB para el destino mRNA (consulte tutoriales que describen el uso del programa PinMol 24 a https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
    1. Determinar la especificidad de los MM seleccionados mediante el análisis BLAST: utilizar "blastn" con la base de datos adecuada (por ejemplo, para mBs oskar mRNA utilizan la base de datos "refseq-rna" y el organismo Drosophila melanogaster).
    2. Identificar cualquier expresión específica del tejido del objetivo del ARNm (por ejemplo, para oskar mRNA Flybase> High-Throughput Expression Data> FlyAtlas Anatomy Microarray o modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) y compártelo con cualquier blast positivo golpea. Elimine las sondas que muestran >50% de homología cruzada con otros ARNm que también se expresan en el tejido/célula de interés.
  3. Seleccione el par de fluoróforo y quencher adecuado para la configuración de microscopía disponible para realizar imágenes de células vivas (por ejemplo, Cy5/BHQ2)25.

2. Síntesis, purificación y caracterización mb

  1. Utilizar la síntesis y purificación interna como se describió anteriormente7, o servicios de proveedores comerciales, para sintetizar y purificar de uno a cinco MB (ver nota anterior), utilizando el siguiente esquema de etiquetado: [5'(Fluorophore)-(C3 o C6 linker)-(2'-O -secuencia de metílico MB)-(Quencher)3']. Purificar los MB utilizando HPLC de fase inversa, en casa o utilizando los servicios del proveedor comercial.
    NOTA: Las fosfosamiditas utilizadas para la síntesis automatizada de la sonda deben tener la modificación de 2'-O-metil ribonucleótido. También se pueden utilizar quimeras de ácido nucleico bloqueado alternado (LNA) y 2'-O-metil modificaciones para aumentar la estabilidad de un híbrido entre un MB más corto y su ARNmobjetivo 26.
  2. Sintetizar oligonucleótidos de ADN que coincidan con la secuencia de la región de ARN objetivo y, por lo tanto, son complementarios a la región de sonda de los MB, para su uso en caracterización in vitro (véanse los pasos 2.3 a 2.5; nota anterior). Maximizar la hibridación del MB con la imitación del objetivo de ADN-oligonucleótido, incluyendo en cada extremo del objetivo de ADN cuatro nucleótidos adicionales, como se encuentra en la secuencia de ARNm objetivo.
    Nota: Una caracterización más rigurosa de la eficiencia del MB para detectar la secuencia dirigida se puede realizar utilizando objetivos de ARN sintetizados in vitro en lugar de oligonucleótidos de ADN complementarios8.
  3. Realizar la desnaturalización térmica del MB solo, medir su temperatura de fusión (Tm), y confirmar que el MB asume la forma de horquilla deseada a temperatura fisiológica. Hemos observado valores Tm entre 60 y 90oC.
  4. Realizar la desnaturalización térmica del MB en presencia del objetivo de oligonucleótido de ADN y medir el TM del híbrido objetivo MB:DNA, como se describió anteriormente7. Se desea un Tm entre 55 y 60 oC para el híbrido MB:DNA.
  5. Realizar reacciones de hibridación in vitro con el objetivo de oligonucleótido de ADN correspondiente, y determinar la eficiencia de la formación híbrida MB:DNA a temperatura fisiológica, como se describió anteriormente7. Se desea una cinética de hibridación rápida con la imitación del objetivo de ADN, sin embargo, los MB que no muestran una alta eficiencia de hibridación con objetivos de ADN pueden tener un mejor rendimiento con el ARNm objetivo in vitro y/o in vivo.

3. Disección y preparación de cámaras individuales de huevo para microinyección

  1. Alimente las hembras recién nacidas y acopladas durante 2-3 días con pasta de levadura fresca.
  2. Anestetizar moscas en una almohadilla de CO2 y, usando pinzas finas (Dumont #5), transferir 1-2 hembras en una gota de aceite de Halocarbon 700 en un resbalón de la cubierta de vidrio.
  3. Usando un par de pinzas, oriente la mosca con el lado dorsal hacia arriba bajo un estereomicroscopio. Diseccionar el abdomen femenino haciendo una pequeña incisión en el extremo posterior y apretar suavemente el par de ovarios en el aceite.
  4. Explantar los ovarios en una gota de aceite en una nueva capa. Sostenga suavemente un ovario con una pinza mientras pellizca las etapas más jóvenes del ovariole con la otra pinza. el ARNm de oskar se localiza activamente a mediados de la oogénesis (etapas > 7), y las cámaras de óvulos más jóvenes (etapas < 7) son más difíciles de inyectar y no sobreviven tanto tiempo. Arrastre lentamente el deslizamiento de la cubierta (con un movimiento hacia abajo) hasta que los óvulos individuales o las cámaras de huevo estén aislados y alineados verticalmente. Separe aún más las cámaras de huevo individuales desplazando las etapas no deseadas de la cadena de óvulos de ovariole.
    NOTA: Asegúrese de que las cámaras de huevo con objeto de burla individual no flotan en el aceite y que se adhieren al resbalón de la cubierta. Esto es importante tanto para la microinyección exitosa como para la adquisición de imágenes.

4. Microinyección de MBs en las Células de Enfermeras de las Cámaras de Huevo

  1. Preparar la solución MB, utilizando una baliza molecular (por ejemplo, osk2216Cy5), o una mezcla de dos MB que se dirigen a diferentes ARNm y que están etiquetados con fluoróforos espectralmente distintos (por ejemplo, osk2216Cy5 y drongo1111Cy3). Utilice una concentración de 200-300 ng/L cada MB en HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7,5, 1,5 mM MgCl2 y 100 mM NaCl). Para un cóctel de cuatro MM etiquetados con el mismo fluoróforo que apuntan al mismo ARNm a 200 ng/L cada uno en HybBuffer (por ejemplo, osk82, osk1236, osk2216). Gire la solución mb inmediatamente antes de cargar la aguja para microinyección.
  2. Seleccione el objetivo. Se recomienda un objetivo de aceite de 40x para encontrar una cámara de huevo adecuada y para realizar microinyección.
  3. Monte el cubreobjetos con la cámara de huevo diseccionada en la etapa del microscopio. Traiga el objetivo en la posición de enfoque e identifique una cámara de óvulos en una etapa de desarrollo de media a última, que esté adecuadamente orientada para la microinyección (es decir, con el eje perpendicular A-P a la punta de la aguja para permitir una fácil inyección dentro de una enfermera proximal al ovocitos).
  4. Cargue una aguja (comercial o preparada en casa27 ) con una solución de 1 ML MB (ver paso 4.1) y conéctela al microinyector. Para microinyecciones en cámaras de huevo D. melanogaster, oriente la aguja (ver Tabla de Materiales)en un ángulo <45o a la etapa del microscopio (por ejemplo, 30o) para evitar la punción de varias células de la enfermera.
  5. Configurar el inyector con presión de inyección de 500-1.000 hPa y presión de compensación de 100-250 hPa (ver Tabla de Materiales).
  6. Mueva lentamente el escenario para traer en el campo de visión un área de la gota de aceite vacío de las cámaras de huevo.
  7. Usando el joystick del micromanipulador, baje suavemente la aguja en la gota de aceite y ponga su punta enfocada hacia la periferia del campo de visión.
  8. Realice una función de "limpieza" para extraer el aire de la punta de la aguja y asegurarse de que hay flujo de la aguja.
  9. Lleve la aguja a la posición de inicio y concéntrese en la cámara de óvulos que se va a microinyectar, luego vuelva a enfocar la aguja y colóquela cerca del borde de la cámara de óvulos.
  10. Realizar un ajuste fino de la posición Z del objetivo de tal manera que la membrana que separa las células folículos de las células de la enfermera está enfocada.
  11. Inserte la aguja en una celda de enfermería y realice la inyección durante 2-5 s.
  12. Retire suavemente la aguja y retráiquela a la posición de inicio.
  13. Cambie el objetivo al aumento deseado para la adquisición de imágenes (60-63x o 100x), concéntrese en la cámara de óvulos y comience la adquisición.

5. Adquisición de datos mediante una configuración de microscopio confocal de disco giratorio

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para ver nuestra configuración específica.

  1. Configure el protocolo de adquisición para grabar una pila XYZCt de imágenes de 8-16 bits (XYZ, volumen, c, canal, t de tiempo).
  2. Seleccione líneas láser para los canales deseados (por ejemplo, láser de 641 nm para Cy5 y 491 nm para GFP) y adquiera los canales secuencialmente: primero la señal de fluorescencia en cada canal y luego cambie la posición Z, para permitir un análisis de colocalización adecuado.
  3. Seleccione el paso Z (p. ej., 0,3 m) y los límites Z superior e inferior(p. ej. -2 a 2 m).
  4. Introduzca el tiempo de adquisición y la frecuencia de muestreo (por ejemplo, cada 15-30 s durante un máximo de 1 h).
  5. Iniciar la adquisición.

6. Procesamiento, Análisis de Datos para Obtener Información de Seguimiento y Colocalización, y Preparación de Archivos de Video

  1. Procesamiento de imágenes
    1. Descarga, desempaquete y abra Icy, una plataforma de comunidad abierta para la informática de bioimágenes (http://icy.bioimageanalysis.org/)
    2. Abra la pila XYZCt adquirida en el paso 5: Imagen/Secuencia >Archivo>Abrir.
    3. Convertir pila a ImageJ: ImageJ> Herramientas> Convertir a IJ, tienen el modo separado activado.
    4. Hacer un substack (una selección de un rango de pasos Z y puntos de tiempo a analizar más a fondo): ImageJ>Imagen>Pilas>Herramientas>Crear Substack...; seleccionar los canales deseados, los pasos Z y los puntos de tiempo.
    5. Guardar substack como archivo TIFF: ImageJ>Archivo>Guardar como>Tiff...; utilice este archivo para los pasos posteriores.
    6. Canales divididos: ImageJ>Imagen>Color>Dividir canales.
    7. Restar fondo mediante una pila de fondo: ImageJ>Process>Image Calculator..., o usando la opción Rolling ball: ImageJ>Process>Subtract Background..., seleccione el radio de bola rodante. Previsualice la imagen para el radio seleccionado antes de seleccionar "Aceptar".
      Nota: La señal de fondo surgirá principalmente de un enfriamiento incorrecto del fluroroforre. La relación señal:fondo (S:B) se utiliza a menudo como indicador del "brillo" de un MB, y se mide a partir de experimentos de hibridación in vitro del MB y oligonucleótido objetivo de ADN. Por ejemplo, los MB osk1236 y osk2216 tienen un S:B de 81 y 120 euros, respectivamente.
    8. Ajuste el brillo y el contraste de cada canal: ImageJ>Imagen>Ajustar>Brillo/Contraste, seleccione Aplicar.
    9. Guarde cada canal como un archivo TIFF independiente: ImageJ>Archivo>Guardar como>Tiff....
    10. Combinar los dos canales: ImageJ>Imagen>Color>Combinar canales...; seleccionar los canales. Guarde la nueva pila como un nuevo archivo TIFF (consulte el paso 6.1.8).
  2. Detección y seguimiento de puntos
    1. Volver a Icy: ImageJ>Herramientas>Convertir a hielo.
    2. Una barra de escala se superpone automáticamente en la pila al convertira a Icy, si el plugin de la barra de escala está instalado [Buscar usando Plugins>Setup>Online plugin]. Si es necesario, edite la barra de escala a través de la ventana Inspector (lado derecho de la pantalla)>ficha Capa>Nombre>Barra de escala.
    3. Anule la selección/inactive el icono 'ojo' de la barra De escala de la pestaña Capa>Nombre para eliminar la barra de escala de la pila original. Se puede reactivar en la pila final.
    4. Guarde la pila recién procesada tomando una captura de pantalla usando el icono "cámara" de la barra de menús de la ventana de imagen, "Tomar una captura de pantalla de la vista actual" y Archivo>Guardar como>Tiff....
    5. Determine la sensibilidad al punto, si los parámetros de sensibilidad al punto ya se han determinado, pase al paso 6.2.7.
    6. Detectar puntos: seleccione la ventana con la imagen o pila que se va a analizar, Detección&Seguimiento>Detección>Detector de puntos y rellene los parámetros de Configuración:
      1. En Input (Entrada), seleccione "currentSequenceInputDetection" (predeterminado).
      2. En Preprocessing, seleccione "Channel 0" (predeterminado) o el canal deseado haciendo referencia cruzada al número en la ventana Inspector>Sequence.
      3. En Detector, seleccione "Detectar punto brillante sobre fondo oscuro", utilice "Forzar el uso de Wavelets 2D para 3D" solo si no hay suficientes cortes Z en las pilas para realizar el análisis. Seleccione "Escala(s)" y "Sensibilidad" para cada escala (agregue más escalas para puntos más grandes). La Escala y Sensibilidad (cuanto mayor sea el número más sensible es la detección, un máximo de 140 es sugerido por Icy) son variables de prueba y error, que deben ser verificadas visualmente después y decididas.
      4. Para Región de interés, utilice "ROIfromSequence" (predeterminado).
      5. Para El filtrado, utilice "NoFiltering" (predeterminado) o seleccione "SizeFiltering" para definir el "Rango de objetos aceptados (en píxeles)".
      6. Salida: seleccione la configuración de salida XLS o XML (seleccione el formato XML cuando utilice 2007 MS Excel o anterior y hay >65.000 puntos). Si los resultados del detector de puntos se utilizan para el análisis de seguimiento, seleccione también "Exportar a Piscina".
      7. Repita la detección de manchas utilizando varios valores de escala/sensibilidad hasta que se detecten todas o la mayoría de las manchas. Registre todos los parámetros finales.
      8. Para el análisis de colocalización, repita la detección de puntos para el otro canal.
    7. Para realizar un seguimiento de los puntos, seleccione el menú desplegable Detección&Seguimiento>Seguimiento>Seguimiento de puntos>Ejecutar el detector de puntos con parámetros del paso 6.2.6., o utilice el menú desplegable "Seleccionar resultados de detección aquí" para seleccionar un conjunto de datos existente (para ello, mantenga la ventana Detector de manchas abierto desde el paso 6.2.5). Pulse el botón "Parámetros de estimación" y seleccione el movimiento de destino deseado en la ventana emergente Estimación de parámetros (por ejemplo, "es difusivo y dirigido"). Pulse el botón "Ejecutar seguimiento".
    8. Repita la detección de puntos y el seguimiento de otros canales al realizar el seguimiento de puntos de pilas multicanal, siguiendo los pasos 6.2.6 y 6.2.7, comenzando con la pila generada a partir del paso 6.2.7.
    9. Para visualizar pistas, seleccione Detección&Seguimiento>Seguimiento>Administrador de pistas: esta ventana se abre automáticamente al finalizar una ejecución de seguimiento. Para "Color Track Processor", seleccione "Habilitar" y elija la representación de color deseada para las pistas. Se puede acceder a los procesadores de pista relevantes a través del "Añadir procesador de pistas..." Menú desplegable (por ejemplo, seleccione "Track Processor Time Clip", active la ventana "Track Clipper" y elija el número deseado de detecciones que se mostrarán antes y después del punto de tiempo actual.)
    10. Guardar información de pistas como un archivo de pista XML: Detección&Seguimiento>Seguimiento>Administrador de pistas>Archivo>Guardar como....
    11. Guarde los resultados tomando una captura de pantalla usando el icono "cámara" de la barra de menús de la ventana de imagen, "Tomar una captura de pantalla de la vista actual". Las capturas de pantalla se pueden tomar con los puntos detectados y / o las pistas simplemente activando / desactivando los iconos de ojo correspondientes que se encuentran en la ventana inspector>pestaña Capa>Nombre> Envoltorio de superposición.
    12. Instale el plugin TimeStamp Overlay: Plugins>Setup>Online plugin>TimeStamp Overlay>Install.
    13. Añadir marca de tiempo: Plugins>TimeStamp Overlay (Nuevo). Siga las instrucciones en la ventana emergente (esquina inferior derecha de la pantalla) para obtener instrucciones sobre cómo colocar y formatear la marca de tiempo. El intervalo de tiempo se puede agregar/cambiar en la ventana Inspector>ficha Secuencia>Propiedades de secuencia>Editar.
    14. Guarde los resultados tomando otra captura de pantalla. Guardar imagen como 1) Formato Tiff y 2) como formato AVI; para el formato AVI primero convertir a renderizado RGB (Imagen/Secuencia>Renderización>imagen RGB).
    15. Girar la imagen a la orientación deseada: Ventana Inspector>Ficha Secuencia>Canvas>Rotación.
    16. Guarde la imagen rotada por "Tomar una captura de pantalla de la vista actual". Asegúrese de que el icono "ojo" de la barra de escala no esté seleccionado, ya que también rotará con la imagen.
    17. Elija y recorte el ROI: seleccione Región de interés>2D ROI>Elija la forma de ROI y, a continuación, cree/dibuje ROI en la imagen; Imagen/Secuencia>Plano (XY)>Recorte rápido.
  3. Análisis de colocación
    1. Preparar un protocolo de colocación; se proporcionan varios ejemplos en el sitio web de Icy (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List) (ver Materiales Suplementarios).
    2. Cargar protocolo de colocación: Herramientas>Scripting>Protocolos>Cargar y ajustar parámetros en los bloques que interactúan (por ejemplo, en el bloque "Wavelet Spot Detecting" utilizan parámetros determinados en el paso 6.2.6.).
    3. Mida el tamaño de una partícula en píxeles, determine la distancia de colocación e infórmela en el bloque "Colocalizador" como "Distancia máxima".
      NOTA: El tamaño de la partícula en píxeles depende del sistema de detección. Para medir el tamaño, haga zoom en una sola partícula y cuente manualmente los píxeles que abarcan el ancho de la señal. Promedio de las mediciones de al menos tres partículas. La distancia máxima que se establecerá para la colocación es el tamaño de la partícula en píxeles (esto representa la suma máxima del radio de dos partículas que se tocan).
    4. Si lo desea, seleccione uno o más ROI para el análisis de colocalización: Región de interés>2D ROI>Elija la forma del ROI>Dibujar ROI en la imagen.
    5. Recortar ROI:Imagen/Secuencia>Plano (XY)>Recorte rápido.
    6. Realizar la colocación: Ventana del editor de protocolos>Ficha Protocolo elegido>Ejecutar. El bloque final en la ventana del editor de protocolos contendrá el porcentaje general de colocación basado en la detección de puntos, mientras que la información en cada punto de tiempo se puede encontrar en la ventana Inspector> ficha Salida.
    7. Realice un seguimiento de las partículas colocalizadas y únicas siguiendo el paso 6.2.7 (Puntos de seguimiento).
    8. Guarde como se describe en el paso 6.2.16.

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Representative Results

Usando PinMol, se pueden diseñar varios MM para un objetivo de ARNm (Figura1B-C). Después de la síntesis y purificación, los MB seleccionados se caracterizan y se comparan utilizando el análisis in vitro.

Figure 1
Figura 1: Técnica y descripción de tejidos para imágenes de células vivas de ARNm endógenos. (A) Representación de una cámara de óvulos Drosophila en etapa media utilizada para la microinyección. La aguja de microinyección (verde) proporciona un cóctel de balizas moleculares específicas para el ARNm de oskar. Una inyección rápida en una célula de enfermería permite la detección de ARNm en tránsito al ovocitos, así como la visualización de ARNm ya localizado en la corteza posterior. (B) Salida de software PinMol de clasificación de balizas moleculares para apuntar a mRNA de oskar (C ) Región de estructura secundaria dentro del ARNm de oskar dirigido por una baliza molecular. (C') Secuencia y plegado de baliza molecular específica de oskar,osk2216. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Después de que el rendimiento óptimo de los MBs se confirme a través de la caracterización in vitro, las sondas se utilizan para la visualización en vivo de ARNm objetivo endógenos. Es posible visualizar los patrones de transporte y localización del ARNm de oskar en varias etapas de la oogénesis, y en particular a mediados de la oogénesis (7-10) (Figura2A-B). Debido a su pequeño tamaño, es difícil inyectar cámaras de huevo en etapas muy tempranas (1-4). Cuando se inyectaindividualmente en las mismas cámaras de huevo de etapa, los MB específicos del oskarpresentan los mismos patrones de localización(Figura2, osk1236 vs osk2216).

Figure 2
Figura 2: Secuencia de tiempo del ARNm de oskar en la cámara de huevo de tipo silvestre en t 0, 10 y 30 minutos de tiempo, después del inicio de la adquisición. Inyecciones de células de enfermera de dos balizas moleculares específicas de oskar(osk1236 y osk2216) en(A) cámaras de huevo de etapa 6-7 y (B ) cámaras de huevo de etapa 9. Barra de escala a 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diferentes objetivos de ARNm se pueden covisualizar mediante el uso de MBs espectralmente distintos etiquetados fluorescentemente (Figura3). La solución MB se puede microinyectar en una célula de enfermería (Figura3A)o en el ovocitos (Figura3B). Los MB inyectados en el citoplasma de una célula de enfermería se difundirán libremente en las otras células de la enfermera, así como en el ovocitos, y por lo tanto son capaces de encontrar su objetivo y generar señal de fluorescencia en otros sitios que no sean el sitio de microinyección. Por ejemplo, cuando se realizan microinyecciones en una célula de enfermería de una etapa de oogénesis tardía (9-10), la mayor parte de la señal de fluorescencia visualizada dentro del ovocitos es generada por el ARNm de oskar ya localizado, y menos por el transporte transcripciones, que son más frecuentes en etapas anteriores (7-8). Tenga en cuenta que los MB clásicos darán lugar a señales no específicas dentro de los núcleos, limitando así el análisis a las regiones citoplasmáticas de la cámara de óvulos. Se han empleado modificaciones adicionales, como NeutrAvidin o nanopartículas de oro, para reducir o eliminar esta señal no específica28,29. A pesar de esta señal nuclear no específica, la especificidad de los MB para la detección in vivo de ARNm de oskar se ha establecido utilizando un enfoque FRET 8, y MB coinyección con ARNm de oskar transcrito in vitro etiquetado con un fluoróforo espectralmente distinto de la etiqueta23del MB.

Figure 3
Figura 3: Co-visualización de dos especies de ARNm en cámaras de óvulos vivos. Coinyecciones de oskar- y drongo-balizas moleculares específicas en la célula de la enfermera (A)y (B) ovocitos de la etapa 8-9 cámaras de huevo. oskar (rojo) y drongo (verde) ARNM colocalizan en el extremo posterior del ovocitos (asterix), y drongo también muestra la acumulación dorso-anterior (punta de flecha). Barra de escala a 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para los objetivos de ARNm que muestran niveles bajos de expresión, la señal de fluorescencia por molécula de ARNm aumenta inyectando una solución de cóctel que contiene al menos dos MB, cada una de las cuales se une a diferentes regiones objetivo (Figuras4 y5).

Figure 4
Figura 4: Visualización del ARNm de oskar con MBs y sistema MS2-GFP. Microinyecciones de una solución de cóctel MB (MB) en una cámara de huevo que expresa osk-MS2::MCP-GFP30 (GFP). Después de la microinyección de una célula de enfermera, las imágenes se adquirieron cada 30 s durante 20 minutos. Se seleccionaron dos regiones de interés, una ROI en una célula de enfermera y otra en el ovocito. Se utilizó una sensibilidad diferente para cada ROI para detectar los puntos. Célula de enfermera ROI: Escala 2, Sensibilidad 100 para GFP y MB. Ovocitos DE ROI: Escala 2, Sensibilidad 50 para GFP y 110 para MB. La distancia de colocación es de 4 píxeles para ambos ROI. Toda la cámara de óvulos y el zoom en la célula de la enfermera se muestran en el punto de tiempo de 12 minutos, y el zoom en el ovocitos se muestra en el punto de tiempo de 14 minutos. Las manchas MB (círculos rojos) y las manchas GFP (círculos verdes) identifican las partículas de ARNm de oskar detectadas por cada enfoque, y las partículas colocalizadas (amarillas) indican dónde las manchas MB y GFP están a lo sumo de 4 píxeles de distancia. Proyecciones XY de rodajas ópticas de 14 Z a pasos de 0,3 m. Adquiridos como datos de 16 bits con un objetivo de 63x (aceite, NA a 1,4), XY a 0,24 m, tiempo de exposición 500 ms, a 5,23 y 5,39 mW de potencia láser para el láser de 641 nm y 491 nm, respectivamente. Barra de escala a 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Análisis de seguimiento en el ovocitos, después de la microinyección de células de enfermería con MB específicos de ARNm de oskar. Las partículas MB se detectaron en la Escala 2 con Sensibilidad 110, y se muestran 8 puntos de tiempo antes/después del período de tiempo actual. Las manchas MB (círculos rojos) se rastrean en el volumen del ovocitos; las pistas representan información de detección de 8 puntos de tiempo antes/después del punto de tiempo de 12 minutos mostrado. Cada color representa una pista individual. Proyecciones XY de rodajas ópticas de 14 Z a pasos de 0,3 m. Barra de escala a 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Al comparar el tráfico de ARNm de oskar detectado con MBs vs MS2/MCP, la señal de fluorescencia generada por mBespecíficos de oskardocumenta fielmente sobre el transporte y localización de ARNm transgénico de oskar etiquetado con 10 GFP etiquetado con 10 GFP moléculas a través del sistema MS2/MCP (Figura4). En las cámaras de óvulos transgénicos oskar-MS2/MCP-GFP a mediados de la oogénesis, el análisis de datos de adquisición mostró una amplia colocalización entre las señales fluorescentes de oskargenéticamente modificado - MRNAMS2 detectado utilizando MBs y etiquetado GFP . A 12 y 14 minutos después de la inyección, 57% (7 MB-objetos y 13 objetos GFP, con 4 objetos colocalizados) y 93% (30 MB-objetos y 51 Objetos GFP, con 28 objetos colocalizados) de partículas MB detectadas colocalizadas con partículas GFP en las células de la madre y ovocitos, Respectivamente. Nuestro análisis produce porcentajes de colocación del 31% y 55% de mRNA oskar-MS2 con ARNm de oskar detectado con MBs dentro del citoplasma de una célula de enfermera y el ovocito, respectivamente. Además, las pilas 5D se pueden analizar más a fondo para determinar las trayectorias del ARNm de oskar para el transporte de larga distancia tanto en la célula de la enfermera como en el citoplasma de ovocitos (Figura5).

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Discussion

La visualización en vivo del tráfico endógeno de ARNm en cámaras de huevo Drosophila se basa en el uso de mBs específicos, eficientes y resistentes a la nucleasa, que ahora se pueden diseñar fácilmente con el software PinMol. Los MB son sondas específicas diseñadas para detectar secuencias únicas dentro de un ARNm de destino (preferiblemente regiones libres de estructura secundaria), lo que hace posible la detección altamente resuelta de una transcripción. La única limitación al adoptar esta técnica/protocolo para otros tejidos/tipos de células es la eficiencia de la entrega de MB para la muestra de interés. Mientras que otros enfoques requieren manipulación genética del tejido para expresar un aptámero y una proteína de unión al ARN etiquetada según una proteína fluorescente para visualizar un ARNm objetivo (por ejemplo, el sistema MS2/MCP), la multiplexación es posible para, como máximo, dos transcripciones. La tecnología MB es la única para detectar ARNm endógenos en células vivas, y es la única técnica que permite la co-visualización de más de dos especies de ARNm.

Los MB pueden etiquetarse con una amplia gama de mitades fluorescentes y son estables en el entorno celular cuando se sintetizan a partir de nucleótidos modificados como 2'-O-methylribonucletides o ácidos nucleicos bloqueados26,31. Estas modificaciones de la columna vertebral también aumentan la afinidad de los MB por su objetivo. Varios MB se pueden diseñar fácilmente para ARNm objetivo de longitud media. Sin embargo, se pueden encontrar algunas limitaciones para objetivos cortos y/o altamente estructurados. Esto se puede superar mediante la adopción de nuestras pequeñas balizas moleculares, para las cuales la región de la sonda es aproximadamente la mitad de la longitud de una sonda MB clásica31. Dependiendo del tipo de espécimen, los MB se entregan en células a través de electroporación, uniéndose a péptidos penetrantes celulares, lipofección, o microinyección23,32,33,34. La eficiencia de rendimiento de un MB en experimentos de imágenes de células en vivo se basa en la capacidad de la secuencia de sonda para hibridar a la secuencia complementaria correspondiente dentro del objetivo de ARNm, que está determinada por la estructura de destino. La estructura secundaria de ARN MFE pronosticada obtenida utilizando parámetros termodinámicos medidos in vitro es valiosa para evaluar la accesibilidad objetivo, pero en última instancia es la estructura objetivo in vivo y la interacción objetivo con otros factores que determinarán la idoneidad del MB para la toma de imágenes de células vivas. El análisis del genoma de la estructura secundaria del ARN sugiere que muchos ARN están menos estructurados in vivo que in vitro35. Aunque la eficiencia de la detección de objetivos in vivo mediante MB depende principalmente de la accesibilidad del sitio de enlace, la optimización de ciertas características de MB garantizará una visualización mejorada del objetivo de ARNm. Específicamente, se debe realizar una cuidadosa selección de los siguientes parámetros: 1) la longitud de la sonda puede variar entre 18 y 26, de modo que la composición de nucleótidos de la sonda esté entre 31 y 55% de DIÁMETRO cGC en el objetivo: híbrido MB, 2) la secuencia de vástago de 5 bp debe ser G/C rica, para mantener la forma de la horquilla en ausencia de objetivo de ARNm y para proporcionar discriminación de discordancia, 3) se debe utilizar una columna vertebral modificada para la protección contra las nucleasas de MB y objetivo:MB híbrido, 4) el par fluoróforo /quencher puede ofrecer un par adicional estabilidad modesta al tallo del MB, y 5) el fluoróforo debe ser estable durante largos intervalos de tiempo de toma de imágenes. Además, los MB clásicos suelen generar una señal nuclear no específica34,que en nuestro caso sólo afecta moderadamente al procesamiento y análisis de datos. Sin embargo, para la visualización del tráfico de ARNm a nivel celular, esta señal no específica puede llegar a ser problemática. Varios grupos han propuesto modificaciones o etiquetas, como tRNA, péptidos y nanopartículas, que impiden la entrega de MBs en el núcleo y así eliminar esta posible señal no específica33,36.

El mayor inconveniente de este enfoque ha sido el diseño manual de mBs para imágenes de células en vivo. Para abordar esto, hemos escrito un programa basado en Python (PinMol) que identifica fácilmente los sitios de destino accesibles dentro de un ARNm considerando las estructuras secundarias subóptimas además del MFE, así como diseña sondas de horquilla, que son las mejores adecuado para la detección de ARNm en células vivas24. PinMol utiliza información estructural de estructuras secundarias del ARN objetivo predichas a través de enfoques de minimización de energía, e incluyendo información de estructuras subóptimas, la flexibilidad o rigidez de regiones específicas objetivo es evaluados al diseñar mBs. Tiene en cuenta la accesibilidad de las regiones objetivo, así como las interacciones intermoleculares e intramoleculares de cada sonda seleccionada. Además, los tramos altamente regulados de ARN (por ejemplo, sitios de unión para microARN o proteínas de unión a ARN) no deben considerarse como sitios de destino al seleccionar sondas, ya que estas regiones pueden dar lugar a una unión ineficiente de los MB. El usuario puede evaluar y eliminar sondeos dirigidos a estos sitios, o restringir la región de destino utilizada por PinMol para diseñar sondeos para que no incluya dichos sitios. La capacidad relativa de PinMol se demostró comparando el ranking de MBs diseñados por PinMol con los resultados experimentales de mBs24diseñados manualmente. Pinmol seleccionó y diseñó MBs para regiones objetivo similares, así como identificó nuevos sitios accesibles en el ARNm. Esto es esencial para la detección de transcripciones de número sin copia donde la señal fluorescente debe aumentarse por encima del fondo. Al escalar verticalmente los números MB que efectivamente se hibridan a varios sitios accesibles en un ARNm de destino, se puede lograr la amplificación de la señal. Por lo tanto, este programa facilita un enfoque rápido para diseñar múltiples MB s por ARNm objetivo, y para visualizar simultáneamente numerosos ARNm en una célula viva.

Con el fin de lograr datos de adquisición 5D (XYZCt) de alta calidad de los ARNM transportados dentro de la cámara de óvulos, la disección adecuada de las cámaras de óvulos individuales y la microinyección efectiva en las células de la madre son fundamentales. Para los estudios durante las primeras etapas de desarrollo, la microinyección puede ser perjudicial para la viabilidad de la cámara de óvulos y, por lo tanto, se acorta la duración de un experimento de imágenes de células vivas (<20 min). Se puede garantizar un aumento de la tasa de éxito de los experimentos de microinyección mediante el uso de agujas ultrafinas disponibles en el mismo estado. Además, una configuración rápida de la configuración de adquisición es importante para que se puedan capturar los primeros puntos de tiempo posteriores a la inyección. La calidad de los datos de detección y seguimiento de puntos sólo será tan buena como la calidad de las imágenes adquiridas.

Tras la adquisición de la imagen, es esencial que los pasos de análisis posteriores también se completen con cuidado y precisión. Aunque el procesamiento y el análisis posteriores a la adquisición ofrecen su propio conjunto de dificultades, se pueden simplificar eligiendo el software adecuado para su experimento o muestra en particular. Los programas actuales existentes incluyen Volocity (PerkinElmer), Imaris (Bitplane), ImageJ/Fiji y Icy37. De los tres, Icy ofrece varios beneficios, ya que es una plataforma comunitaria abierta que permite, tanto el procesamiento (a través de ImageJ) como el análisis de datos de imágenes. Aquí describimos los pasos necesarios para el procesamiento y análisis eficientes de los datos de imágenes de ARN utilizando Icy. Nuestros resultados son representativos de los datos obtenidos mediante la co-visualización de dos especies de ARNm en una cámara de huevos entera y mediante el seguimiento de un ARNm a través de la tecnología MB y el sistema MS2/MCP.

El procesamiento posterior a la adquisición con el software Icy proporciona al usuario flexibilidad en el procesamiento de imágenes (por ejemplo, brillo, contraste) y análisis (por ejemplo, los ajustes de umbrales/cortes para la sensibilidad de la detección de las partículas fluorescentes como manchas) . Icy también habilita los parámetros relevantes de control dentro de cada bloque de la ejecución del Editor de protocolos (por ejemplo, determinar la distancia de colocación y utilizarla como "distancia máxima" en el bloque "Colocalizador"). El software Icy se actualiza en el lanzamiento y cuenta con soporte en línea confiable para solucionar cualquier problema. El protocolo descrito fue diseñado para detectar el ARNm de oskar y los resultados representativos se obtuvieron utilizando parámetros optimizados para el tipo de partícula de ARNm que se detectará y rastrea. Por ejemplo, el ARNm de oskar es una transcripción abundante que se transporta predominantemente durante las etapas medias de la oogénesis, utilizando la red de microtúbulos y asociándose dinámicamente con diversos factores proteicos a lo largo del desarrollo del ovocitos. Anteriormente informamos que oskar mRNP se somete a una extensa remodelación durante el transporte de las células de la enfermera al ovocito23. Además, utilizando MBs caracterizamos las características temporales y espaciales del tráfico endógeno de ARNm de oskar, y encontramos que cientos de copias de transcripción de oskar se pueden incorporar para formar grandes MRNPs de oskar.

El análisis posterior a la adquisición para la colocalización y el seguimiento también se puede realizar mediante el uso de otro software como Imaris, ImageJ/Fiji y Volocity. Icy fue seleccionada por su capacidad para umbral y anotar partículas fluorescentes con alta sensibilidad y capacidades de seguimiento. Aquí, describimos la colocalización basada en objetos, pero la colocalización, aunque sin seguimiento, también se puede cuantificar determinando la superposición y el grado de colocalización utilizando el análisis PCC(Costes) utilizando plugins Icy e ImageJ (Colocalization studio, JACoP) 38 , 39.

En el futuro, se desea un protocolo de imagen optimizado y a largo plazo para garantizar una mayor supervivencia de la cámara de óvulos. Esto proporcionaría una adquisición más larga con el fin de analizar los datos relativos a los estudios de tráfico de ARNm de largo alcance.

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Disclosures

Los autores no tienen conflicto de intereses que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Salvatore A.E. Marras (Centro del Instituto de Investigación de Salud Pública de la Universidad Rutgers) por la síntesis, etiquetado y purificación de balizas moleculares, y Daniel St Johnston (Instituto Gurdon, Universidad de Cambridge) por el oskar-MS2/ Stock de mosca transgénica MCP-GFP. Este trabajo fue apoyado por un Premio CAREER 1149738 de la Fundación Nacional de Ciencias y un Premio Del Congreso del Personal Profesional-CUNY a DPB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrofluorometer Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon n/a Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette Fireflysci (former Precision Cells Inc.) 701MFL
Dumont #5 tweezer World Precision Instruments 501985 Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm VWR 48393-048
Dissecting microscope Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad Genesee Scienific 59-114
Tris-HCL pH 7.5 Sigma-Aldrich 1185-53-1
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 7791-18-6
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Spinning disc confocal microscope Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera Hamamatsu n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator Eppendorf Inc. 920000037
FemtoJet Microinjector Eppendorf Inc. 920010504
Injection needle: Femtotips II Eppendorf Inc. 930000043
Loading tip: 20 μL Microloader Eppendorf Inc. 930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm VWR 48393-026; 48393-172
Dry yeast Any grocery store n/a
Computer, > 20 GB RAM Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing

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Biología Número 148 Baliza molecular imagen de células vivas visualización endógena de ARNm tráfico de ARNm cámara de óvulos Drosophila melanogaster, microinyección de cámara de óvulos colocalización seguimiento de partículas.
Visualización y seguimiento de ARNm endógenos en cámaras de huevo <em>Drosophila melanogaster</em> en vivo
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