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Biology

ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

Published: June 04, 2019
doi:
10.3791/58545
, , ,
1Biological Sciences Department Hunter College,City University of New York, 2Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology,Graduate Center, City University of New York

Summary

ここでは、分子ビーコン、スピニングディスク共焦点顕微鏡、オープンソース分析を用いたライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNA人身売買の可視化、検出、分析、追跡のためのプロトコルを提示する。ソフトウェア。

Abstract

蛍光ベースのイメージング技術は、光顕微鏡の開発と組み合わせることで、細胞生物学者が生細胞イメージング研究を行う方法に革命を起こしました。RNAを検出する方法は、セミナル研究が遺伝子発現調節に部位特異的mRNA局在化を結合して以来、大幅に拡大してきました。動的mRNAプロセスは、mRNAを検出するアプローチを介して可視化することができ、分子挙動の動的範囲を捕捉するのに十分な速さである顕微鏡検査のセットアップと組み合わされます。分子ビーコン技術は、生細胞内の内因性転写物を直接検出できるハイブリダイゼーションベースのアプローチです。分子ビーコンは、ヘアピン状、内部的にクエンチされた、単一ヌクレオチド識別核酸プローブであり、これは、ユニークな標的配列へのハイブリダイゼーション時にのみ蛍光する。高度な蛍光顕微鏡と高解像度イメージングと組み合わせることで、mRNAの細胞内移動の空間的および時間的な追跡を行うことが可能になります。この技術は内因性転写物を検出できる唯一の方法ですが、細胞生物学者は、生細胞イメージングのためのそのようなプローブの設計が困難なため、この技術をまだ完全に受け入れていません。新しいソフトウェアアプリケーションPinMolは、生きている細胞内のmRNA標的領域に効率的にハイブリダイズするのに最適なプローブの強化され、迅速な設計を可能にします。さらに、高解像度のリアルタイム画像取得と現在のオープンソース画像解析ソフトウェアにより、洗練されたデータ出力が可能になり、mRNAのライフサイクルに関与する動的プロセスの基礎となる複雑さの詳細な評価が可能になります。

ここでは、ショウジョウバエメラメラノガスター卵室に分子ビーコンを設計し、提供するための包括的なプロトコルを提示します。内因性mRNAの直接的かつ非常に特異的な検出および可視化は、紡糸ディスク共焦点顕微鏡を介して行われる。イメージングデータは、氷のソフトウェアで物体検出とトラッキングを使用して処理および分析され、卵母細胞内の特殊な領域に輸送およびローカライズされるmRNAの動的な動きに関する詳細を取得します。

Introduction

空間的および時間的分解能で動的事象を可視化する細胞生物学研究は、蛍光ベースのライブ細胞イメージング技術の開発によって可能になった。現在、生体内mRNAビジュアライゼーションは、RNAアプタマータンパク質相互作用、有機色素および核酸プローブのRNAアプタマー誘導蛍光1、2に基づく技術を介して達成される。3.それらはすべて高い特異性、感度および信号対バックグラウンド比を提供する。しかし、RNAアプタマー中心のアプローチは広範な遺伝子操作を必要とし、トランスジーンはタンパク質または有機色素結合に必要な人工構造モチーフを持つRNAを発現するように設計される。例えば、MS2/MCPシステムは、バクテリオファージMS2コートタンパク質(MCP)に対する結合配列の複数のタンデム反復を含むRNA構築物を発現するトランスジーンの同時発現と、蛍光タンパク質をコードする別のトランスジーンを必要とする。MCP 4に融合,5.このような二次構造モチーフをRNAに添加することは、かさばる蛍光タンパク質と共に、天然RNAプロセスが6に影響を与えるかもしれないという懸念を提起している。この懸念に対処し、追加のユニークな利点を提供する技術は、核酸ベースのアプローチ、分子ビーコン(MB)です。MBは、内因性mRNAの多重検出、単一ヌクレオチド変動の判分、および標的mRNA7,8とのハイブリダイゼーションの高速運動学を可能にする。MBは、標的にハイブリダイズした後に蛍動体形成的な立体構造変化を受ける前に、クエンチングヘアピンフォールドに残るオリゴヌクレオチドプローブである(図1C)9。いくつかのグループは、非コードRNA(マイクロRNAおよびlncRNA)10、11、12、13、RNAレトロウイルス14および動的DNAタンパク質の両方を検出するためにMBを使用することに成功しました。インタラクション15.ゼブラフィッシュ胚16、ニューロン13、腫瘍組織17、心筋細胞18、サルモネラ菌など、様々な生物や組織でのイメージングに成功しています。19.

ここでは、生きているD.メラノガスター卵室における内因性mRNAの設計、送達および検出アプローチについて、活性分子輸送の動的範囲を捕捉するのに十分な速さである顕微鏡検査のセットアップと相まって説明する。D.メラノガスター卵室は、初期の生殖細胞分裂や母体遺伝子発現からセグメントボディプラン20の生成まで、幅広い発達研究のための理想的な多細胞モデルシステムとして機能してきました。 21.卵室は、簡単に単離され、大きく半透明であり、外生分析の時間に耐えることができるので、イメージング実験に非常に適しています。多くの研究は、積極的に翻訳される前に離散的な細胞領域への母体転写の非対称的な局在化に焦点を当ててきた。特に、オスカーmRNA局在化およびその後の卵母細胞の後極でのその後の翻訳は、致命的な二頭上胚表現型22を避けるために厳密に規制された方法で起こらなければならない。oskar mRNAは、ナース細胞と呼ばれる15個の生殖細胞に転写され、環管と呼ばれる細胞質の橋を通って積極的に卵母細胞に輸送され、成熟卵となり最終的に受精される生殖細胞(図1A)).オスカーmRNPとの間のタンパク質因子の動的な募集と交換に関して既に入手可能なかなりの量の情報は、その長距離細胞内旅行と共に、オスカーを研究する好ましい候補にするmRNAライフサイクルの多くのプロセス。MBは、mRNA局在化のプロセスに関する詳細を明らかにし、ショウジョウバエの発生時にmRNA輸送を制御するタンパク質因子の調節と機能を解読するのに役立ってきました。特に、看護師細胞にMBをマイクロ注入し、生細胞イメージング実験を行うことにより、内因性mRNAの追跡が可能である8,23。

ここで示すロードマップは、MBを用いてライブ細胞イメージング実験を行うことから、イメージングデータを取得すること、そのネイティブ細胞環境で内因性mRNAを追跡するためのデータ分析を実行することまで、完全なプロセスのステップを提供します。ステップは、独自のラボ設定内で他の組織/細胞タイプを扱う研究者のニーズを満たすために変更し、さらに最適化することができます。

Protocol

1. 生細胞イメージング用MBの設計 ターゲットRNA配列を折りたたみ、mfoldサーバからの「RNA形態」を用いてmRNAターゲットの二次構造を予測する(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form)。 FASTA形式でターゲットシーケンスを貼り付け/アップロードし、5%または10%のサブ最適性(MFE値の5%または10%以内の自由エネルギーを持つ構造)を選択し、それに応じて計算さ?…

Representative Results

PinMolを使用して、複数の MB を 1 つの mRNA ターゲットに対して設計できます (図 1B-C)。合成および精製後、選択されたMBはインビトロ分析を用いて特徴付け、比較される。 図1:内因性mRNAの生細胞イメージングのた?…

Discussion

ショウジョウバエの卵室における内因性mRNAの密有性のライブ可視化は、PinMolソフトウェアを使用して簡単に設計できる特定の、効率的な、ヌクレアーゼ耐性MBの使用に依存しています。MBは、標的mRNA内の一意の配列(好ましくは二次構造のない領域)を検出するように設計された特定のプローブであり、転写物の高度に解決された検出を可能にする。他の組織/細胞タイプにこの技?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

サルヴァトーレA.E.マラス(ラトガース大学公衆衛生研究所センター)が分子ビーコンの合成、標識、精製を行い、ダニエル・セント・ジョンストン(ケンブリッジ大学ガードン研究所)がオスカー-MS2/ MCP-GFPトランスジェニックフライストック。この作品は、国立科学財団キャリア賞1149738とDPBに専門スタッフ会議-CUNY賞によってサポートされました。

Materials

Spectrofluorometer Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon n/a Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette Fireflysci (former Precision Cells Inc.) 701MFL
Dumont #5 tweezer World Precision Instruments 501985 Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898
Cover slip No.1 22 x 40mm VWR 48393-048
Dissecting microscope Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad Genesee Scienific 59-114
Tris-HCL pH7.5 Sigma-Aldrich 1185-53-1
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 7791-18-6
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Spinning disc confocal microscope Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera Hamamatsu n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator Eppendorf Inc. 920000037
FemtoJet Microinjector Eppendorf Inc. 920010504
Injection needle: Femtotips II Eppendorf Inc. 930000043
Loading tip: 20ul Microloader Eppendorf Inc. 930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm VWR 48393-026; 48393-172
Dry yeast Any grocery store n/a
Computer, > 20 GB RAM Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing
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References

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Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers. J. Vis. Exp. (148), e58545, doi:10.3791/58545 (2019).
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