Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

Published: June 4, 2019 doi: 10.3791/58545
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1Biological Sciences Department Hunter College, City University of New York, 2Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Graduate Center, City University of New York

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור ויזואליזציה, זיהוי, ניתוח ומעקב של סחר האנטי-מסוגגני mRNA בחיים Drosophila ילה מלאנוסטר תא ביצה באמצעות משואות מולקולריות, מיקרוסקופיה דיסק מסתובב, וניתוח קוד פתוח תוכנה.

Abstract

שיטות הדמיה מבוססות-פלואורסצנטית, בשילוב עם התפתחויות במיקרוסקופיה קלה, יש מהפכה כיצד ביולוגים תא לנהל לימודי הדמיה של תאים חיים. שיטות זיהוי RNAs התרחבו מאוד מאז לימודי הזרע מקושרים לוקליזציה mRNA ספציפי לאתר לתקנות ביטוי גנים. תהליכי mRNA דינאמי יכול כעת להיות מדמיין באמצעות גישות המאתרות Mrna, בשילוב עם set-ups מיקרוסקופ כי הם מהירים מספיק כדי ללכוד את טווח דינמי של התנהגות מולקולרית. מסוגל לגילוי ישיר של תעתיקים. של התאים החיים משואות מולקולריות הן בצורת ראש, מנותת פנימי, יחיד-נוקלאוטיד להפלות בדיקה חומצות גרעין, אשר זרוח, רק על הכלאה לרצף יעד ייחודי. כאשר מצמידים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית מתקדם הדמיה ברזולוציה גבוהה, הם מאפשרים אחד לבצע מעקב מרחבי וזמני של תנועה תאיים של mRNAs. למרות טכנולוגיה זו היא השיטה היחידה המסוגלת לזהות תעתיקים אנדוגניים, ביולוגים תא עדיין לא חיבק באופן מלא בטכנולוגיה זו בשל קשיים בעיצוב בדיקות כאלה עבור הדמיה תא חי. יישום תוכנה חדש, Pinmol, מאפשר עיצוב משופר ומהיר של הגששים המתאימים ביותר לhybridize ביעילות אזורים היעד mrna בתוך תא חי. בנוסף, ברזולוציה גבוהה, רכישת תמונה בזמן אמת, הנוכחי, ניתוח תמונה קוד פתוח תוכנה לאפשר פלט נתונים מעודן, המוביל הערכה עדינה יותר של המורכבות הבסיסית של תהליכים דינמיים המעורבים במחזור החיים של mRNA.

כאן אנו מציגים פרוטוקול מקיף לעיצוב ושליחת משואות מולקולריות לתוך מלאנוזופרסטר תאי ביצה. הזיהוי וההדמיה הישירה והייחודית ביותר של מיקרו-האמדוגני מבוצעת באמצעות מיקרוסקופ מסתובב הדיסק. נתוני הדמיה מעובדים ומנותח באמצעות זיהוי אובייקטים ומעקב בתוכנה קרח כדי לקבל פרטים על התנועה הדינמית של mRNAs, אשר מועברים ומקומי לאזורים מיוחדים בתוך oocyte.

Introduction

ביולוגיה של התא מחקרים להמחיש אירועים דינמיים עם רזולוציה מרחבית וזמני התאפשרה על ידי פיתוח של טכניקות הדמיה של תאים בעלי מבוססי-זריחה חי. כיום, ב vivo mrna הדמיה מושגת באמצעות טכנולוגיות המבוססות על rna aptamer-חלבון אינטראקציות, רנ א aptamer אלף המושרה של צבעים אורגניים וחומצה גרעין בדיקה ריפוי1,2, 3. כולם מציעים שיעור גבוה, רגישות ויחס אות לרקע. עם זאת, הגישות במרכז RNA aptamer-ממורכז דורשות מניפולציה גנטית נרחבת, שם מתוכנן לבטא רנ א עם מוטיבים מבניים מלאכותיים הדרושים עבור חלבון או מחייב צבע אורגני. לדוגמה, מערכת MS2/MCP מחייבת את הביטוי המשותף של הרשת המביעה מבנה RNA המכיל מספר חזרות דו-מושביים של רצף הכריכה עבור החלבון בקטביאג MS2 מעיל (MCP), והצפנה נוספת של חלבון פלורסנט . התמזגו ל-MCP4,5 התוספת של מוטיבים מבניים כגון ל-RNA, יחד עם חלבון מתויג מגושם, העלה חששות כי תהליכי RNA הילידים עשויים להיות מושפעים6. טכנולוגיה המטפלת בדאגה זו ומציעה יתרונות ייחודיים נוספים היא הגישה המבוססת על חומצות גרעין, משואות מולקולריות (MBs). MBs לאפשר זיהוי מולטידוגני של החומרים האנדוגניים, אפליה של נוקלאוטיד יחיד וריאציות, ו קינטיקה מהירה של הכלאה עם mrnas המטרה7,8. ב-MBs משתנים בדיקה שנותרו בקיפול מכופף לפני שעברו שינוי של fluorogenic ברגע שהם hybridize ליעדים שלהם (איור 1C)9. מספר קבוצות הצליחו להשתמש ב-MBs כדי לזהות שניהם rnas שאינם קידוד (מיקרורונאס ו-lncrnas)10,11,12,13, RNA רטרווירוסים14 ו-DNA דינאמי-חלבון אינטראקציות15. הם כבר מועסק בהצלחה עבור הדמיה באורגניזמים שונים ורקמות, כגון עוברי דג העוברים16, נוירונים13, רקמות הגידול17, ההבחנה הקרדיוציטים18, סלמונלה . בן 19

כאן אנו מתארים את העיצוב, המסירה ואת הגישה לגילוי עבור mRNAs האנדוגניים בחיים D. מלאנוגסטר חדרי ביצה בשילוב עם הגדרת מיקרוסקופ מספיק מהר כדי ללכוד את טווח דינמי של הובלה מולקולרית פעיל. תא ביצת D. melanogaster שימש מערכת המודל האידיאלי מרובת תאים עבור מגוון רחב של מחקרים התפתחותיים, מ-germline מוקדם גזע התא וביטוי גנים אימהית לדור של הגוף מגזרי20, . עשריםואחד תאי ביצה מבודדים בקלות, גדול שקוף, ומסוגל לעמוד שעות של ניתוח vivo ex , מה שהופך אותם קל מאוד ניסויים הדמיה. עבודה רבה התמקדה לוקליזציה אסימטרית של תעתיקים אימהי לאזורים בדידים משנה דיסקרטית לפני שהוא מתורגם באופן פעיל. במיוחד, לוקליזציה של אוסקר mrna ואת התרגום העוקב שלה בקוטב האחורי של oocyte חייב להתרחש בצורה מוסדר היטב כדי למנוע העובר הקטלני בלאודל היום22. אוסקר mrna משועתק בתאים 15 germline, שנקרא תאים האחות, ומועברים באופן פעיל דרך גשרים cytoplasmic, קרא תעלות הטבעת, לתוך oocyte, התא germline הופך ביצה בוגרת מופרית בסופו של דבר (איור 1a ). כמות ניכרת של מידע זמין כבר לגבי גיוס דינמי וחילופי חלבונים של גורמי חלבון מ- אוסקר mrnp, יחד עם נסיעות הארוך שלה תאיים שלה, להפוך את אוסקר למועמד המועדף ללמוד תהליכים רבים של מחזור החיים mRNA. MBs כבר אינסטרומנטלי לחשוף פרטים על תהליך הלוקליזציה של mRNA ופענוח הרגולציה והתפקוד של גורמי חלבון השולטים בתחבורה mRNA במהלך Drosophila ילה oogenesis. במיוחד, על ידי מיקרו הזרקת MBs לתוך התאים האחות וביצוע ניסויים הדמיה תא חי, המעקב אחר mrnas מעקב אפשרי8,23.

מפת הדרכים המוצגת כאן מציעה את השלבים של תהליך שלם, החל בביצוע ניסוי הדמיה של תא חי באמצעות MBs, רכישת נתוני הדמיה, כדי לבצע ניתוח נתונים כדי לעקוב אחר mRNA אנדוגניים בסביבה הסלולרית הטבעית שלה. השלבים יכולים להיות שונה וממוטב נוסף כדי לענות על הצרכים של חוקרים לעבוד עם רקמות אחרות/סוגי תאים בתוך הגדרת המעבדה שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. עיצוב של MBs לדימות תאים חיים

  1. מקפלים את היעד ברצף RNA כדי לחזות את המבנה המשני של היעד mRNA באמצעות "הטופס RNA" מהשרת mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
    1. הדבק/העלה את רצף היעד בפורמט FASTA, בחר 5 או 10% משנה את הצורה (מבנים עם אנרגיה חופשית של קיפול בתוך 5 או 10% של ערך MFE, בהתאמה), ולהתאים את המספר המירבי של foldings מחושבים בהתאם (למשל גדול עבור 10% תת-אופטיאליות).
      הערה: הכללה של מבנים משניים אופטימליים משנה בעת עיצוב MBs מאפשר זיהוי של אזורים בתוך mRNA היעד שעשוי להיות גמיש יותר או נוקשה יותר מכפי שחזוי עבור מבנה אנרגיה חופשית מינימלית (MFE) בלבד, אשר משפרת את עיצוב כולל של MBs מתאים לדימות תאים חיים.
    2. בחר "עבודה מיידית" עבור מטרות mRNA של 800 נוקלאוטידים (nt), או "משימת אצווה" עבור אורכי mRNA בין 801 ו 8,000 nt. שמור את הקובץ "הרוזן ss" כקובץ טקסט פשוט.
  2. השתמש בקובץ "ss-count" שהתקבל בשלב 1.1 כקלט לתוכנית הפינמול (https://bratulab.wordpress.com/software/) עם הפרמטרים הרצויים, כדי לעצב מספר MBs עבור יעד mrna (ראה מדריכים המתארים שימוש בתוכנית הפינמול 24 ב https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
    1. לקבוע את הספציפיות של MBs שנבחרו על ידי ביצוע ניתוח הפיצוץ: השתמש "blastn" עם מסד הנתונים המתאים (למשל עבור אוסקר Mrna-MBs ספציפי להשתמש במסד הנתונים "מרפזה-rna" ואת Drosophila ילה melanogaster האורגניזם).
    2. זיהוי כל ביטוי ספציפי לרקמה של היעד mRNA (למשל עבור אוסקר Mrna flybase ≫ ביטוי תפוקה גבוהה נתונים ≫ flybase אנטומיה מיקרו מערך או מודדנקוד אנטומיה RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) ולהשוות עם כל כניסות חיוביות הפיצוץ. סלק בדיקה שתציג > 50% בעלי הומולוגיה עם mRNAs אחרים אשר מבוטאים גם ברקמה/תא הריבית.
  3. בחר את ה-פלואורואופפור וזוג הקוכר המתאימים לקבוצת המיקרוסקופיה הזמינה לביצוע הדמיה של תאים חיים (לדוגמה Cy5/BHQ2)25.

2. סינתזה של MB, טיהור ואפיון

  1. השתמש בסינתזה בתוך הבית ובטיהור כמתואר בעבר7, או שירותים מספקים מסחריים, כדי לסנתז ולטהר אחד עד חמש MBs (ראה לעיל הערה), באמצעות סכימת התיוג הבאה: [5] (פלואורואופפור)-(2 '-O) -מתיל מגה-בתים)-(קונצ'ר) 3 ']. לטהר את השימוש בשיטת הייעוץ בשלב ההפוך, בבית או בשימוש בשירותי הספק המסחרי.
    הערה: הזרחנות המשמשות לסינתזה בדיקה אוטומטית חייבת להיות השינוי של 2 '-O-מתיל. ניתן גם להשתמש בצ של מתחלפים של חומצה בגרעין נעול לסירוגין (LNA) ו 2 '-O-מתיל שינויים כדי להגדיל את היציבות של היברידית בין MB קצר יותר mrna היעד שלה26.
  2. לסנתז דנ א של מחלת ה-DNA התואמים את הרצף של אזור ה-RNA המיועד ולכן משלימים את אזור הבדיקה של MBs, לשימוש באפיון חוץ גופית (ראה שלבים 2.3 עד 2.5; מעל הערה). למקסם את הכלאה של המגה-בתים עם ה-DNA-olig, מטרה היעד לחקות, על ידי כלילת בכל קצה של מטרה ה-DNA ארבעה נוקלאוטידים נוספים, כפי שנמצא ברצף mRNA היעד.
    הערה: אפיון קפדני יותר של יעילות המגה-בתים לזהות את הרצף המיועד ניתן לבצע באמצעות מטרות RNA מסונתז על-ידי מבחנה במקום של DNA משלימה olig, משלימים8.
  3. בצע הדציה תרמית של ה-MB בלבד, למדוד את טמפרטורת ההיתוך שלה (Tm), ולאשר כי ה-MB מניח את הצורה הרצויה מאוד בטמפרטורה פיזיולוגית. הבחנו בערכי Tm בין 60 ל-90 ° c.
  4. בצע דנטורציה תרמית של ה-MB בנוכחות ה-DNA olig, היעד ולמדוד את MB: DNA היעד של היברידית Tm, כפי שתוארה בעבר7. Tm בין 55 ו 60 ° c רצוי עבור MB: DNA היברידית.
  5. לבצע תגובות היברידיות מחוץ לבית עם היעד המתאים DNA olig, ולקבוע את היעילות של MB: היווצרות DNA היברידית בטמפרטורה פיזיולוגית, כפי שתוארה בעבר7. הכלאה מהירה קינטיקה עם היעד DNA לחקות רצוי, אולם MBs כי לא להראות יעילות הכלאה גבוהה עם מטרות DNA יכול להיות ביצועים טובים יותר עם mRNA היעד ב מבחנה ו/או vivo.

3. חיתוך והכנת תאי ביצה בודדים עבור מיקרוהזרקה

  1. להאכיל החדש בקעו, נשים מזדווג עבור 2-3 ימים עם להדביק שמרים טריים.
  2. באמצעות מלקחיים משובחים (דומונט5), העבירו 1-2 נקבות לתוך טיפת שמן הלוקרבון 700 על כיסוי זכוכית.
  3. באמצעות זוג מלקחיים, כוון את הזבוב עם הצד האחד למעלה מתחת לstereomicroscope. לנתח את הבטן הנשית על ידי יצירת חתך קטן בקצה האחורי ולסחוט בעדינות את זוג השחלות לתוך השמן.
  4. לחקור את השחלות על טיפת שמן על שמיכות חדש. בעדינות להחזיק שחלה אחת עם פינצטה אחד תוך צובט את השלבים הצעירים של ovariole עם הטוויצר השני. אוסקר mrna מקומי באופן פעיל לאחר באמצע oogenesis (שלבים > 7), ותאי ביצה צעירים (שלבים < 7) קשה יותר להזריק ולא לשרוד זמן רב. גררו באיטיות על שובר הכיסוי (עם תנועה כלפי מטה) עד שיחידות האויונות או תאי הביצה מבודדים ומיושרים אנכית. לתאי ביצה נפרדים נוספים על ידי הפרדת שלבים בלתי רצויים משרשרת הביצים של הovariole.
    הערה: הקפידו שתאי ביצה שיציקו באופן אינדיבידואלי אינם צפים בשמן, ושהם נצמדים לכריכה המכסה. הדבר חשוב הן עבור מיקרו-הזרקה מוצלחת ורכישת תמונה.

4. הזרקה של MBs לתאי האחות של צ'יימברס ביצים

  1. להכין את הפתרון MB, באמצעות משואת מולקולרי אחד (g. osk2216Cy5), או שילוב של שתי MBs היעד mRNAs שונים ואשר מסומנים באמצעות fluorophores נפרדות (למשל osk2216Cy5 ו drongo1111Cy3). השתמש בריכוז של 200-300 ng/μL כל MB ב HybBuffer (50 mM טריס-HCl-pH 7.5, 1.5 mM MgCl2 ו-100 מ"מ הנאל). עבור קוקטייל של ארבע MBs עם תווית של אותו fluorophore כי הם מיקוד אותו mRNA ב 200 ng/μL כל אחד ב HybBuffer (למשל, osk82, osk1236, osk2216). ספין למטה את הפתרון MB מיד לפני טעינת המחט למיקרו הזרקה.
  2. בחר את המטרה. מטרת שמן 40x מומלצת למציאת חדר ביצים מתאים ולביצוע מיקרוהזרקה.
  3. הר את הסרבל עם חדר ביצה גזור על המיקרוסקופ הבמה. העלה את המטרה במיקום המיקוד ולזהות תא ביצה בשלב התפתחותי אמצע עד מאוחר, כי הוא מכוון כראוי למיקרו הזרקה (כלומר, עם ציר AàP בניצב לקצה המחט כדי לאפשר זריקה קלה בתוך אחות התא האבוציט של התאים.
  4. טען מחט (מסחרי או מוכן בבית27) עם פתרון ~ 1 ΜL MB (ראה שלב 4.1) ולחבר אותו למיקרו מזרק. לזריקות מיקרו בתאי ביצה D. melanogaster , האוריינט המחט (ראה לוח חומרים) בזווית < 45 ° לשלב המיקרוסקופ (למשל 30 °) כדי למנוע מספר תאים אחות.
  5. הגדרת מזרק עם לחץ ההזרקה של 500-1000 hPa והלחץ פיצוי של 100-250 hPa (ראה טבלת חומרים).
  6. הזיזו לאט את הבמה כדי להביא את שדה הראייה לאזור של השמן הריק של תאי הביצה.
  7. באמצעות ג'ויסטיק המיקרומניפולציה, הנמך בעדינות את המחט לתוך טיפת השמן והבא את קצהו לפוקוס לעבר הפריפריה של שדה הראייה.
  8. לבצע ' נקי ' פונקציה כדי להסיר את האוויר מקצה המחט כדי להבטיח כי יש זרימה מן המחט.
  9. הביאו את המחט לתנוחת הבית והתרכזו בחדר הביצה כדי להיות מוזרקים, ואז להביא את המחט בחזרה לפוקוס ולמקם אותו ליד הקצה של תא ביצה.
  10. לבצע התאמה קנס של המטרה של Z-מיקום כזה הממברנה המפרידים את התאים זקיק מתאי האחות הוא בפוקוס.
  11. הכנס את המחט לתא אחות ולבצע הזרקה עבור 2-5 s.
  12. להסיר בעדינות את המחט ולמשוך אותו לתנוחת הבית.
  13. שנה את המטרה להגדלה הרצויה של רכישת התמונה (60-63 x או 100x), התמקד בחדר הביצה והתחל ברכישה.

5. רכישת נתונים באמצעות דיסק מסתובב ההתקנה מיקרוסקופ מיקוד

הערה: ראה טבלת חומרים עבור הכיוונון הספציפי שלנו.

  1. הגדר פרוטוקול רכישה כדי להקליט מחסנית XYZCt של 8-16-bit תמונות (XYZ = נפח, C = ערוץ, t = time).
  2. בחר קווי לייזר עבור הערוצים הרצויים (למשל 641 ננומטר לייזר עבור Cy5 ו 491 nm עבור GFP) ולרכוש את הערוצים ברצף: תחילה את האות הפלואורסצנטית בכל ערוץ ולאחר מכן לשנות את המיקום Z, כדי לאפשר ניתוח לוקליזציה הנכון.
  3. בחר בשלב z (למשל 0.3 יקרומטר) ובמגבלות Z העליונות והתחתונות (לדוגמה-2 יקרומטר עד 2 יקרומטר).
  4. להזין את זמן הרכישה ואת קצב הדגימה (למשל כל 15-30 s עד 1 h).
  5. . התחל ברכישה

6. עיבוד, ניתוח נתונים לקבלת מידע מעקב ולוקליזציה, והכנת קבצי וידאו

  1. עיבוד תמונה
    1. הורדה, אריזה ופתיחה של אייסי, פלטפורמה קהילתית פתוחה לאינפורמטיקה ביודמית (http://icy.bioimageanalysis.org/)
    2. פתח את מחסנית XYZCt שנרכשה בשלב 5: תמונה/רצף > קובץ > פתוח.
    3. המר מחסנית ל-ImageJ: ImageJ > כלים > המרה ל-IJ, יש מצב מנותק ON.
    4. ליצור מחסנית משנה (מבחר של מגוון של שלבים Z ונקודות זמן להיות מנותח עוד): ImageJ > תמונה > ערימות > כלים > להפוך מחסנית משנה...; בחר את הערוצים הרצויים, Z-שלבים ונקודות זמן.
    5. שמור מחסנית משנה כקובץ TIFF: ImageJ > קובץ > שמור כ> Tiff...; השתמש בקובץ זה עבור השלבים הבאים.
    6. ערוצי פיצול: ImageJ > תמונה > צבע > ערוצים מפוצלים.
    7. הפחת רקע באמצעות מחסנית רקע: ImageJ > תהליך > מחשבון תמונה..., או באמצעות האפשרות ' כדור מתגלגל ': ה> הליך > הפחת רקע..., בחר ברדיוס הכדור המתגלגל. הצג בתצוגה מקדימה את התמונה עבור הרדיוס שנבחר לפני בחירת "קבל".
      הערה: אות הרקע עולה בעיקר מקוצ'ינג מגונה של הפלוראוריפור. האות: יחס הרקע (S:B) משמש לעתים קרובות כאינדיקטור עבור "בהירות" של מגה-בתים, והוא נמדד מתוך ניסויים היברידיזציה של מטרה במגה-בתים ושגיאות DNA. לדוגמה, MBs osk1236 ו-osk2216 יש S:B של ~ 81 ו-~ 120, בהתאמה.
    8. כוונן את הבהירות והניגודיות עבור כל ערוץ: ImageJ > תמונה > כוונן את > בהירות/ניגודיות, בחר באפשרות החל.
    9. שמור כל ערוץ כקובץ TIFF נפרד: ImageJ > קובץ > שמור כ> Tiff....
    10. מיזוג שני הערוצים: ImageJ > תמונה > צבע > ערוצי מיזוג...; בחור את הערוצים. שמור את המחסנית החדשה כקובץ TIFF חדש (ראה step 6.1.8).
  2. איתור ומעקב ספוט
    1. להמיר בחזרה אייסי: ImageJ > כלים > להמיר קרח.
    2. סרגל בקנה מידה מצופה באופן אוטומטי על המחסנית בעת המרה לקרח, אם התוסף בר קנה המידה מותקן [חיפוש באמצעות תוספים > תוכנית ההתקנה > מקוונת). במקרה הצורך, ערכו את סרגל הסרגל באמצעות חלון המפקח (הצד הימני של המסך) > הכרטיסיה ' שכבה ' > שם > סרגל סרגל.
    3. בטלו את הסימון בסמל ' עין ' בסרגל הכרטיסיות ' שכבה > שם ' כדי להסיר את סרגל קנה המידה מהמחסנית המקורית. ניתן להפעיל אותו מופעל בערימה הסופית.
    4. שמור את המחסנית החדשה שעובדו על-ידי צילום מסך באמצעות הסמל "מצלמה" מתוך שורת התפריטים של חלון התמונה, צלם צילום מסך של התצוגה הנוכחית והקובץ > שמור בתור > Tiff....
    5. קביעת רגישות לספוט, אם פרמטרי הרגישות של הספוט כבר נקבעו למעבר אל שלב 6.2.7.
    6. זיהוי מקומות: בחר את החלון עם התמונה או המחסנית שיש לנתח, זיהוי & מעקב > זיהוי > גלאי ספוט ומלא את פרמטרי ההגדרות:
      1. כדי להזין קלט, בחר באפשרות "האיתור הנוכחי של גילוי קלט" (ברירת המחדל).
      2. עבור עיבוד מקדים, בחר באפשרות "ערוץ 0" (ברירת מחדל) או בערוץ הרצוי על-ידי הפניה מקושרת למספר בכרטיסיה ' חלון מפקח > רצף '.
      3. עבור גלאי, בחר "לזהות נקודה בהירה על רקע כהה;" להשתמש "כוח השימוש של 2D אדוות עבור 3D" רק אם אין מספיק Z-פרוסות בערימות כדי לבצע את הניתוח. בחר באפשרות "קנה מידה" ו-"רגישות" לכל קנה מידה (הוסף סולמות נוספים לנקודות גדולות יותר). קנה המידה והרגישות (ככל שהמספר יותר רגיש הוא הזיהוי, מקסימום של 140 מוצע על ידי אייסי) הם המשפט משתני שגיאה, כי יש לבדוק ויזואלית לאחר מכן החליטו על.
      4. עבור ' אזור העניינים ', השתמש באפשרות ' שימוש ברצף ' (ברירת המחדל).
      5. לסינון, השתמש באפשרות "NoFiltering" (ברירת מחדל), או בחר באפשרות "סינון שינוי גודל" כדי להגדיר את "טווח האובייקטים המקובלים (בפיקסלים)".
      6. פלט: בחירת XLS או הגדרת פלט XML (בחר פורמט XML בעת שימוש 2007 MS Excel או מוקדם יותר ויש > נקודות 65000). אם התוצאות של גלאי הספוט משמשות לניתוח המעקב, בחרו גם ' ייצוא לבריכת שחייה '.
      7. חזור על זיהוי של נקודות באמצעות ערכי קנה מידה/רגישות שונים עד לזיהוי כל הנקודות או רוב הכתמים. הקלט את כל הפרמטרים הסופיים.
      8. לקבלת ניתוח לוקליזציה לשפות אחרות, זיהוי נקודה חוזרת עבור הערוץ האחר.
    7. כדי לעקוב אחר כתמים, בחר באפשרות זיהוי & מעקב > מעקב > ספוט > הפעל את גלאי הספוט באמצעות הפרמטרים משלב 6.2.6., או השתמש בתפריט הנפתח "בחר תוצאות זיהוי כאן" כדי לבחור ערכת נתונים קיימת (לשם כך, השאר את חלון גלאי הספוט פתוח משלב 6.2.5). לחץ על כפתור "הערכת פרמטרים" ובחר את תנועת היעד הרצויה בחלון שערוך פרמטרים (למשל "הוא גם מפזרים ומכוון"). לחץ על כפתור "הפעל מעקב".
    8. חזור על איתור ומעקב אחר נקודות עבור ערוצים אחרים בעת מעקב אחר מקומות של ערימות רב-ערוצי, לאחר השלבים 6.2.6 ו-6.2.7, החל במחסנית שנוצרת משלב 6.2.7.
    9. כדי להמחיש מסלולים, בחר באפשרות זיהוי & מעקב > מעקב אחר > מנהל מעקב-חלון זה נפתח באופן אוטומטי עם סיום הפעלת המעקב. עבור "מעבד מעקב אחר צבעים", בחר "אפשר" ובחר את הייצוג הרצוי של צבע עבור הרצועות. ניתן לגשת אל מעבדי הרצועה הרלוונטיים באמצעות "הוספת מעבד מעקב..." תפריט משיכה (לדוגמה, בחר באפשרות "עקוב אחר קליפ זמן מעבד", הפעל את החלון "מעקב אחר מעבדים", ובחר את מספר הזיהוי הרצוי שיוצג לפני ואחרי נקודת הזמן הנוכחית.)
    10. שמור שירים מידע כקובץ מעקב XML: זיהוי & מעקב אחר > מעקב אחר > מנהל מעקב אחר > קובץ > שמירה בשם...
    11. להציל את התוצאות על ידי לקיחת צילום מסך באמצעות סמל "מצלמה" מתוך שורת התפריטים של חלון תמונה, "לקחת צילום מסך של השקפה הנוכחי". צילומי מסך ניתן לקחת עם מקומות שזוהו ו/או את הרצועות פשוט על ידי הפעלת/הפעלה של סמל העין המקבילה (עם) שנמצאו המפקח חלון > שכבה הכרטיסיה > שם > עטיפה כיסוי.
    12. התקן את התוסף לכיסוי חותמת הזמן: תוספים > תוכנית ההתקנה > מקוונת plugin > כיסוי חותמת זמן > התקן.
    13. הוספת חותמת זמן: תוספים > כיסוי חותמת זמן (חדש). בצע את ההוראות על החלון המוקפץ (בפינה הימנית התחתונה של המסך) לקבלת הנחיות לגבי הצבת ועיצוב חותמת הזמן. ניתן להוסיף/לשנות את מרווח הזמן בכרטיסיה רצף > > מאפייני רצף > עריכה.
    14. שמור תוצאות על ידי לקיחת מסך נוסף. שמור תמונה כ 1) תבנית Tiff ו-2) כתבנית AVI; לתבנית AVI המרה ראשונה לעיבוד RGB (תמונה/רצף > רינדור > תמונת RGB).
    15. סובב תמונה לכיוון הרצוי: חלון מפקח > כרטיסיה רצף > > סיבוב.
    16. שמור תמונה שסובבה על-ידי "צלם צילום מסך של התצוגה הנוכחית". הקפידו לבטל את הבחירה בסמל ' עין ' בסרגל הקנה מידה, כפי שהוא יסתובב גם עם התמונה.
    17. לבחור ולחתוך ROI: בחר אזור של עניין > 2D ROI > בחר הצורה ROI ולאחר מכן ליצור/לצייר ROI על התמונה; תמונה/רצף > מישור (XY) > יבול מהיר.
  3. ניתוח לוקליזציה
    1. הכן פרוטוקול לוקליזציה; מספר דוגמאות מסופקות באתר הקרח (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List) (ראה חומרים משלימים).
    2. טען פרוטוקול התאמה לשפות אחרות: כלים > Scripting > פרוטוקולים > לטעון ולהתאים פרמטרים בבלוקי האינטראקציה (לדוגמה, ב-"זיהוי אדוה Spot" בלוק השתמש בפרמטרים שנקבעו בשלב 6.2.6.).
    3. למדוד את הגודל של חלקיק בפיקסלים, לקבוע את המרחק לוקליזציה ולהכניס אותו לתוך "לוקליזציה" לחסום כמו "מרחק מקסימום".
      הערה: גודל החלקיק בפיקסלים תלוי במערכת האיתור. למדידת גודל, התקרבות לחלקיק בודד וספירה ידנית של הפיקסלים המתפרסים על רוחב האות. ממוצע המידות של שלושה חלקיקים לפחות. המרחק המירבי שיש להגדיר עבור התאמה לשפות אחרות הוא גודל החלקיק בפיקסלים (הדבר מייצג את הסכום המירבי של רדיוס של שני חלקיקים הנוגעים).
    4. אם רצונך בכך, בחר ROIs אחת או יותר עבור ניתוח לוקליזציה: אזור של עניין > 2D ROI > לבחור את הצורה ROI > צייר ROI על התמונה.
    5. המשך חיתוך (ים): תמונה/רצף > מישור (XY) > יבול מהיר.
    6. ביצוע התאמה לשפות אחרות: > הכרטיסיה פרוטוקול נבחר > הפעלה. הבלוק הסופי בחלון של עורך פרוטוקולים יכיל את אחוז הלוקליזציה הכולל בהתאם לזיהוי ספוט, בעוד שמידע בכל נקודת זמן נמצא בחלון המפקח > הכרטיסיה פלט.
    7. מעקב אחר חלקיקים מקומיים ובודדים באמצעות שלב 6.2.7 (מעקב אחר נקודות).
    8. שמור כמתואר בשלב 6.2.16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות Pinmol, ניתן לתכנן מספר MBs עבור יעד mrna אחד (איור 1b-C). לאחר הסינתזה והטיהור, השימוש ב-MBs הנבחר מאופיין בניתוח חוץ-גופית.

Figure 1
איור 1: טכניקה ותיאור הרקמה עבור הדמיית תאים חיים של mRNAs האנדוגניים. (א) תיאור של חדר ביצה באמצע השלב של דרוזופילה ששימש להזרקת מיקרו. המחט מיקרוהזרקה (ירוק) מספק קוקטייל של משואות מולקולארית ספציפיים עבור אוסקר mrna. זריקה מהירה לתוך תא אחות מאפשרת זיהוי של mRNAs במעבר אל oocyte, כמו גם ויזואליזציה של Mrnas כבר מקומי בקליפת המוח האחורי. (ב) פימול פלט תוכנה של משואה מולקולרית הדירוג עבור המיקוד של אוסקר mrna (ג) אזור המבנה המשני בתוך אוסקר mrna ממוקד על ידי משואה מולקולרית. (ג) רצף וקיפול של איתות מולקולרי. ספציפי לאוסקר, osk2216 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר שהביצועים האופטימליים של MBs מאושרים באמצעות אפיון מבחנה, הבדיקות משמשות להדמיה חיה של mrna היעד האנדודוגני. ניתן לדמיין את דפוסי התחבורה של אוסקר mrna ולוקליזציה בשלבים שונים של oogenesis, ובמיוחד ב ואחרי באמצע-oogenesis (7-10) (איור 2a-B). בשל גודלם הקטן, קשה להזריק תאי ביצה בשלבים מוקדמים מאוד (1-4). כאשר הוזרק בנפרד בתאי ביצה באותו שלב, לאוסקר ספציפי MBs להציג את דפוסי לוקליזציה (איור 2, osk1236 vs osk2216).

Figure 2
איור 2: רצף הזמן של אוסקר mrna בחדר הביצה סוג פראי ב t = 0, 10, ו 30 דקות נקודות זמן, לאחר החניכה של הרכישה. האחות זריקות האחיות של שני משואות מולקולארית ספציפיים של אוסקר(osk1236 ו osk2216) ב (א) שלב 6-7 ביצים ו (ב) בשלב 9 חדרי ביצה. סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מטרות mRNA שונות יכולות להיות משותפות לדמיין באמצעות שימוש באמצעות ספקטרוברית באופן שונה באופן מתויג MBs (איור 3). פתרון ה-MB ניתן להזריק לתוך תא אחות (איור 3A) או לתוך oocyte (איור 3a). MBs מוזרק לתוך הציטופלסמה תא אחות יהיה חופשי לפזר לתוך התאים האחרים אחות, כמו גם לתוך oocyte, ולכן הם מסוגלים למצוא את היעד שלהם וליצור אות זריחה באתרים אחרים מאשר באתר מיקרוהזרקה. לדוגמה, כאשר ביצוע זריקות מיקרו בתא אחות של השלב oogenesis מאוחר (9-10) ביצה, רוב האות הזריחה דמיינו בתוך oocyte נוצר על ידי אוסקר mrna מקומי כבר, ופחות על ידי מועברים באופן פעיל תעתיקים, הנפוצים יותר בשלבים קודמים (7-8). שימו לב כי ה-MBs הקלאסית תעניק העלאה לאותות לא ספציפיים בתוך הגרעינים, ולכן הגביל את הניתוח לאזורים הקיטופלסמטי של תא הביצה. שינויים נוספים, כגון NeutrAvidin או חלקיקי זהב, המועסקים כדי להקטין או לבטל את האות הספציפי הזה28,29. למרות האות הגרעינית הזאת לא ספציפית, הספציפיות של MBs עבור זיהוי vivo של אוסקר mrna כבר הוקמה באמצעות גישה מסוימת8, ו MB שיתוף הזרקה עם מחוץ לבית מתורבת העתק אוסקר mrna עם תווית פלואורואופפור ברורה מהתווית של ה-MB23.

Figure 3
איור 3: הדמיה משותפת של שני מינים mRNA בתאי ביצה חיים. שיתוף זריקות של אוסקר- ודרוגו-משואות מולקולריות ספציפיות (A) תא אחות ו (ב) oocyte של הבמה 8-9 ביצים צ'יימברס. אוסקר (אדום) ו דרוגו (ירוק) mrnas colocalize וקליזציה בקצה האחורי של oocyte (אסטריקס), ו דרוגו גם מראה dorso-הצטברות קדמית (ראש חץ). סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

עבור מטרות mRNA המנציגות רמות ביטוי נמוכות, האות הפלואורסצנטית לכל מולקולת mRNA מוגברת על-ידי הזרקת פתרון קוקטיילים המכיל לפחות שתי MBs, כל איגוד לאזורי יעד שונים (איורים 4 ו-5).

Figure 4
איור 4: הדמיית מערכת של אוסקר mrna עם שני MBs ו-MS2-gfp. מיקרוזריקות של תמיסת קוקטייל MB (MB) בחדר ביצה המבטא osk-MS2:: MCP-gfp30 (gfp). לאחר המיקרו ההזרקה של תא אחות, התמונות נרכשו כל 30 דקות עבור 20 דק '. שני אזורי עניין נבחרו, אחד ROI בתא אחות ואחד ב oocyte. רגישות שונה שימש עבור כל ROI כדי לזהות את הנקודות. ROI תא אחות: סולם 2, רגישות 100 עבור GFP ו-MB. ROI oocyte: סולם 2, רגישות 50 עבור GFP ו 110 עבור MB. מרחק הלוקליזציה הוא 4 פיקסלים עבור ROIs. תא הביצה כולו ואת הזום על התא האחות מוצגים בנקודה 12 דקות זמן, ואת הזום על oocyte מוצג בנקודה 14 דקות. כתמים MB (עיגולים אדומים) ו GFP כתמים (עיגולים ירוקים) לזהות חלקיקי אוסקר mrna שזוהו על ידי כל גישה, ואת החלקיקים המותאמים לשפות אחרות (צהוב) לציין היכן מקומות MB ו-gfp נמצאים ברוב 4 פיקסלים בנפרד. XY-הקרנות של 14 Z פרוסות אופטיות בשלבים 0.3 יקרומטר. נרכש כמו נתונים 16-bit עם מטרה 63 x (שמן, NA = 1.4), XY = 0.24 μm, חשיפה זמן 500 ms, ב 5.23 ו-5.39 mW כוח לייזר עבור 641 nm ו-491 לייזר nm, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח מעקב ב oocyte, לאחר האחות מיקרו הזרקה של אוסקר Mrna ספציפי-MBs. חלקיקים MB זוהו בקנה מידה 2 עם רגישות 110, ו 8 נקודות זמן מוצגים לפני/אחרי מסגרת הזמן הנוכחית. כתמים MB (עיגולים אדומים) מסומנים בנפח של oocyte; שירים מייצגים מידע זיהוי מ 8 נקודות זמן לפני/אחרי המוצג 12 דקות נקודה. כל צבע מייצג רצועה בודדת. XY-הקרנות של 14 Z פרוסות אופטיות בשלבים 0.3 יקרומטר. סרגל קנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בעת השוואת הסחר של אוסקר mrna כפי שזוהה עם MBS vs MS2/MCP, האות הפלואורסצנטית שנוצר על ידי מסמכים ספציפיים של אוסקר-MBs בנאמנות על התחבורה והלוקליזציה של הטרנסגניים אוסקר MRNA עם התווית 10 gfp מולקולות דרך מערכת MS2/MCP (איור 4). ב -אוסקר-MS2/MCP-GFP בתאי ביצה באמצע oogenesis, ניתוח נתוני הרכישה הראה לוקליזציה מקיפה בין אותות פלורסנט של מהונדסים גנטית אוסקר-MS2 mrna זיהה באמצעות MBs ו-gfp תיוג . ב 12 ו 14 דקות לאחר ההזרקה, 57% (7 מגה-בתים-אובייקטים 13 GFP-אובייקטים, עם 4 אובייקטים מותאמים לשפות אחרות) ו 93% (30 MB-אובייקטים ו 51 GFP-אובייקטים, עם 28 אובייקטים מקומיים) של חלקיקים שזוהו MB מקומי עם חלקיקים GFP בתאי האחות oocyte, בהתאמה. הניתוח שלנו מניב 31% ו 55% התאמה לוקליזציה של אוסקר-MS2 mrna עם התגלתה אוסקר mrna עם MBs בתוך הציטופלסמה של תא אחות ו oocyte, בהתאמה. יתר על כן, 5D-ערימות ניתן לנתח עוד כדי לקבוע מסלולים של אוסקר mrna עבור הובלה למרחקים ארוכים בתאי האחות והציטופלזמה של oocyte (איור 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ויזואליזציה בשידור חי של סחר הנשים האנסוגני ב- Drosophila ילה תאי ביצה מסתמך על שימוש ספציפי, יעיל, ו nuclease עמידים לשימוש, אשר כעת ניתן לתכנן בקלות עם תוכנת pinmol . MBs הם רגשים ספציפיים שנועדו לזהות רצפים ייחודיים בתוך mRNA היעד (רצוי אזורים ללא מבנה משני), מה שמאפשר זיהוי מאוד מוחלט של תעתיק. המגבלה היחידה בעת אימוץ טכניקה זו/פרוטוקול עבור סוגים אחרים של רקמות/תאים הוא היעילות של משלוח MB עבור הדגימה של עניין. בעוד גישות אחרות דורשות מניפולציה גנטית של הרקמה כדי לבטא aptamer אלף ו-RNA מחייב חלבון מתויג עם חלבון פלורסנט כדי להמחיש מטרה אחת mRNA (למשל MS2/MCP system), ריבוב אפשרי, לכל היותר, שני תעתיקים. טכנולוגיית MB עומד לבד לזיהוי mRNAs האנדוגניים בתאי החיים, והוא הטכניקה היחידה המאפשרת הדמיה משותפת של יותר מאשר שני מינים Mrnas.

MBs יכול להיות מתויג עם מגוון רחב של moieties פלורסנט והם יציבים בתוך הסביבה הסלולרית כאשר מסונתז נוקלאוטידים שונה כגון 2 '-O-מתילריאוקלינודים או הגרעין של חומצות,26,31. גם השינויים האלה בעמוד השדרה מגבירים את הזיקה של MBs למטרה שלהם. מספר MBs יכול להיות מתוכנן בקלות עבור mRNAs היעד באורך ממוצע. עם זאת, ניתן להיתקל במגבלות מסוימות עבור מטרות קצרות ו/או מובנות מאוד. זה יכול להיות להתגבר על ידי אימוץ משואות המולקולרי הזעירות שלנו, אשר באזור בדיקה הוא כמחצית האורך של בדיקה קלאסית של MB31. בהתאם לסוג הדגימה, MBs מועברים לתאים באמצעות אלקטרופורציה, קישור לפפטידים החודרים לתא, ליפוב, או מיקרוהזרקה23,32,33,34. יעילות הביצועים של MB בניסויים הדמיה של תאים חיים נשענת על היכולת של רצף הבדיקה לhybridize לרצף המשלים המתאים בתוך היעד mRNA, אשר נקבעת על ידי מבנה היעד. החזה החזוי MFE RNA מבנה משני התקבל באמצעות אניn מבחנה מדוד פרמטרים התרמודינמיקה הוא בעל ערך בהערכת נגישות היעד, אבל בסופו של דבר הוא מבנה היעד vivo ואת האינטראקציה היעד עם הסלולר אחרים גורמים שיקבעו את התאמתו של המגה-בתים לדימות תאים חיים. הגנום כולו ניתוח של מבנה משני RNA מציע כי RNAs רבים הם פחות מובנים vivo מאשר בתוך מבחנה35. למרות שיעילותה של זיהוי היעד vivo באמצעות MBs תלויה בעיקר בנגישות של אתר האיגוד, מיטוב תכונות מסוימות של MB יבטיחו הדמיה משופרת של היעד mRNA. במיוחד, מבחר זהיר של הפרמטרים הבאים צריך להתבצע: 1) אורך הבדיקה יכולה להשתנות בין 18 ו -26, כך הרכב נוקלאוטיד של הבדיקה היא בין 31 ו 55% GC זוגות ביעד: MB היברידית, 2) רצף הגזע bp 5 צריך להיות G/C עשיר, כדי לשמור על הצורה העלית בהעדר היעד mRNA וכדי לספק אפליה בלתי התאמה, 3) עמוד השדרה שונה צריך לשמש להגנה מפני נוקלאוסים של שני מגה ויעד: MB היברידית, 4) הזוג fluorophore הקונבלית יכול להציע תוספת יציבות צנועה של הגזע של MB, ו 5) fluorophore צריך להיות יציב במהלך מרווחי זמן הדמיה ארוכה. בנוסף, הקלאסית MBs בדרך כלל לייצר אותות גרעיניים לא ספציפיים34, אשר במקרה שלנו רק משפיע בינוני על עיבוד נתונים וניתוח. עם זאת, עבור מסחר החזותי mRNA ברמה התאית, האות הלא ספציפי הזה עשוי להיות בעייתי. כמה קבוצות הציעו שינויים או תגים, כגון trna, פפטידים ו חלקיקים, אשר מונעים את המסירה של MBs לתוך הגרעין ובכך לחסל את האות הלא ספציפי הזה האפשרי33,36.

החיסרון הגדול ביותר של גישה זו היה העיצוב הידני של MBs עבור הדמיה של תאים חיים. כדי לענות על כך, כתבו תוכנית פיתון מבוסס (Pinmol) כי בקלות מזהה אתרי יעד נגיש בתוך mrna על ידי בהתחשב מבנים משניים האופטימלי בנוסף mfe, כמו גם עיצובים בדיקה סיכת ראש, אשר הם הטובים ביותר מתאים לזיהוי של mRNAs בתאים חיים24. פינמול משתמש במידע מבני ממבנים משניים של RNA היעד החזוי באמצעות גישות למזעור האנרגיה, ועל-ידי כלילת מידע ממבנים תת-אופטימליים, גמישות או קשיחות של אזורים ממוקדים ספציפיים הוא מוערך בעת עיצוב MBs. לוקח בחשבון את הנגישות של האזורים המיועדים, כמו גם את האינטראקציות הבין-מולקולרית של כל המחקר שנבחר. בנוסף, רצועות מוסדרות במיוחד של RNA (לדוגמה, אתרי איגוד לחלבונים או כריכת RNA) אינם נחשבים לאתרי יעד בעת בחירת הבדיקות, מכיוון שאזורים אלה עלולים לגרום לאיגוד לא יעיל של ה-MBs. המשתמש יכול להעריך ולחסל את הבדיקות המכוונות לאתרים אלה, או להגביל את אזור היעד המשמש פינמול כדי לעצב את הבדיקות כך שהוא לא יכלול אתרים כאלה. היכולת היחסית של פינמול הוכיחה על ידי השוואת הדירוג של הפינמול המעוצב באמצעות התוצאות הנסיוניות של mbs24שתוכננו באופן ידני. פינמול נבחר ותוכנן MBs עבור אזורי יעד דומים, כמו גם מזוהה אתרים נגישים חדשים ב-mrna. זה חיוני לזיהוי של העתקים מספר העתק נמוך שבו אות הניאון חייב להיות מוגבר מעל הרקע. על-ידי שינוי קנה מידה של מספרי MB שhybridize ביעילות למספר אתרים נגישים ב-mRNA היעד, ניתן להשיג הגברה של האות. לכן, תוכנית זו מקלה על גישה מהירה לעיצוב מספר MBs-mRNA למטרה, ובמקביל להמחיש מספר רב של Mrna בתא חי.

על מנת להשיג איכות גבוהה 5D (XYZCt) רכישת נתונים של mRNAs מועברים בתוך חדר הביצה, ניתוח נאות של תאי ביצה בודדים מיקרוהזרקה יעילה לתאי האחות הם קריטיים. למחקרים במהלך השלבים המוקדמים של התפתחות, מיקרוהזרקה יכול להיות מזיק לכדאיות של חדר הביצה ולכן אורכו של ניסוי הדמיה של תא חי מקוצר (< 20 דקות). שיעור הצלחה מוגברת של ניסויים מיקרוהזרקה ניתן להבטיח באמצעות מחטים מסחרית זמין באולטרסאונד. בנוסף, הגדרה מהירה של הגדרות הרכישה חשובה כך שניתן יהיה ללכוד את נקודות הזמן המוקדמות, שלאחר ההזרקה. איכות נתוני איתור הספוט ומעקב תהיה טובה בדיוק כמו איכות התמונות שנרכשו.

לאחר רכישת תמונה, חיוני ששלבי הניתוח הבאים יושלמו גם בזהירות ובדיוק. למרות שעיבוד וניתוח לאחר הרכישה מציעים את ערכת הקשיים שלהם, הם יכולים להיות יעילים על-ידי בחירת התוכנה המתאימה לניסוי או למדגם המסוים של האדם. התוכניות הקיימות הנוכחיות כוללות את Volocity (פרקיאלמר), מאריס (ביטטוס), ImageJ/פיג'י ו-אייסי37. מבין שלושת, אייסי מציע מספר יתרונות, כפי שהיא פלטפורמה קהילתית פתוחה המאפשרת, הן, עיבוד (דרך ImageJ) וניתוח של נתוני הדמיה. כאן אנו מתארים את השלבים הדרושים לעיבוד יעיל וניתוח של נתונים הדמיה RNA באמצעות אייסי. התוצאות שלנו הם נציג של הנתונים המתקבלים על ידי שיתוף חזותי שני מינים mRNA בחדר ביצה שלם על ידי מעקב mRNA באמצעות טכנולוגיית MB ו MS2/MCP מערכת.

עיבוד לאחר הרכישה עם התוכנה קרח מספק גמישות המשתמש בעיבוד התמונה (למשל, בהירות, ניגודיות) וניתוח (למשל הגדרות סף/גזירה המראות לרגישות של זיהוי חלקיקי פלורסנט כנקודות) . קרח מאפשר גם את השליטה הפרמטרים הרלוונטיים בתוך כל בלוק של עורך הפרוטוקולים להפעיל (למשל לקבוע את מרחק לוקליזציה ולהשתמש בו כ "מרחק מקסימום" לחסום "מנרמל"). התוכנה קרח מתעדכן בעת ההשקה, ויש לו תמיכה מקוונת אמינה כדי לפתור בעיות כלשהן. הפרוטוקול המתואר נועד לגילוי אוסקר mrna ואת התוצאות הנציג הושגו באמצעות פרמטרים אופטימיזציה עבור סוג של חלקיק mrna להתגלות ומעקב. לדוגמה, אוסקר mrna הוא תעתיק שופע כי הוא מועבר בעיקר במהלך השלבים הביניים של oogenesis, ניצול רשת microtubule ושיוך דינמי עם גורמי חלבון שונים במהלך הפיתוח של oocyte. בעבר דיווחו כי אוסקר mrnp עובר שיפוץ נרחב במהלך הובלה מתאי האחות אל oocyte23. בנוסף, שימוש ב-MBs שאפיינו את מאפייני הזמן והמרחב של סחר בסמים mrna של אוסקר , ומצאו כי מאות העתקים של אוסקר יכול להיות משולבים בצורה גדולה של אוסקר mrna.

ניתן לבצע ניתוח שלאחר הרכישה עבור לוקליזציה ומעקב באמצעות תוכנות אחרות כגון Imaris אריס, ImageJ/פיג'י ו-Volocity. קרח נבחר עבור יכולתו לסף והוסף ביאורים חלקיקים פלורסנט עם רגישות גבוהה ויכולות מעקב. כאן, אנו מתארים התאמה מבוססת אובייקט, אבל לוקליזציה, אם כי ללא מעקב, ניתן גם לכמת על ידי קביעת חפיפה ומידת לוקליזציה באמצעות PCC (Colocalization) ניתוח באמצעות התוספים אייסי ו ImageJ (סטודיו לוקליזציה, JACoP) 38 , 39.

בעתיד, פרוטוקול דימות מיטבי לטווח ארוך, רצוי להבטיח הישרדות מורחבת של תאי ביצה. הדבר יספק רכישה ארוכה יותר כדי לנתח נתונים הנוגעים למחקרים ארוכי-טווח של סחר ב-mRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגוד אינטרסים לגלות.

Acknowledgments

אנו מודים סלווטורה A.E. Marras (מרכז מחקר בריאות הציבור, באוניברסיטת רטגרס) לסינתזה, תיוג וטיהור של משואות מולקולרית, דניאל St ג'ונסטון (מכון גורדון, אוניברסיטת קיימברידג ') עבור אוסקר-MS2/ מניות לטיסה. עבודה זו היתה נתמכת על ידי פרס לאומי של קרן המדע בשנת 1149738 ופרס צוות מקצועי לקונגרס-CUNY ל DPB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrofluorometer Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon n/a Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette Fireflysci (former Precision Cells Inc.) 701MFL
Dumont #5 tweezer World Precision Instruments 501985 Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm VWR 48393-048
Dissecting microscope Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad Genesee Scienific 59-114
Tris-HCL pH 7.5 Sigma-Aldrich 1185-53-1
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 7791-18-6
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Spinning disc confocal microscope Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera Hamamatsu n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator Eppendorf Inc. 920000037
FemtoJet Microinjector Eppendorf Inc. 920010504
Injection needle: Femtotips II Eppendorf Inc. 930000043
Loading tip: 20 μL Microloader Eppendorf Inc. 930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm VWR 48393-026; 48393-172
Dry yeast Any grocery store n/a
Computer, > 20 GB RAM Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).
  3. Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. Current techniques for visualizing RNA in cells. F1000Research. 5, (2016).
  4. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
  5. Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  6. Garcia, J. F., Parker, R. MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system. RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).
  7. Bratu, D. P. Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells. Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).
  8. Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).
  9. Tyagi, S., Kramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).
  10. Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
  11. Liu, Y., et al. Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).
  12. Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).
  13. Ko, H. Y., et al. A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis. Scientific Reports. 4, 4626 (2014).
  14. Vet, J. A., et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).
  15. Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).
  16. Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).
  17. Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells. Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).
  18. Ban, K., et al. Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4. Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).
  19. Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples. BMC Microbiology. 9, 97 (2009).
  20. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
  21. Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
  22. Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein. Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).
  23. Mhlanga, M. M., et al. In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte. PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).
  24. Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs. bioRxiv. , (2018).
  25. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).
  26. Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection. Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).
  27. Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).
  28. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  29. Jackson, S. R., et al. Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells. Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).
  30. Zimyanin, V. L., et al. In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization. Cell. 134 (5), 843-853 (2008).
  31. Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells. ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).
  32. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).
  33. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).
  34. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).
  35. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).
  36. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
  37. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  38. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
  39. Trcek, T., et al. Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters. Nature Commununications. 6, 7962 (2015).

Tags

ביולוגיה סוגיה 148 משואה מולקולרית הדמיה של תא חי הדמיית mRNA האנדוגניים סחר mRNA דרוזופילה מלאנוגסטר תא ביצה מיקרוהזרקה של תא ביצה לוקליזציה מעקב אחר חלקיקים.
חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי <em>דרוזוסופילה מלאנוגסטר</em> צ'יימברס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar,… More

Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers. J. Vis. Exp. (148), e58545, doi:10.3791/58545 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter