Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Published: June 4, 2019 doi: 10.3791/58545
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1Biological Sciences Department Hunter College, City University of New York, 2Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Graduate Center, City University of New York

Summary

Burada, moleküler işaretleri kullanarak canlı Drosophila melanogaster yumurta odasında endojen mRNA kaçakçılığı görselleştirme, algılama, analiz ve izleme için bir protokol sunuyoruz, iplik disk konfokka mikroskopi, ve açık kaynak Analizi Yazılım.

Abstract

Floresan bazlı görüntüleme teknikleri, ışık Mikroskopisinde gelişmelerle birlikte, hücre biyologlarının canlı hücre görüntüleme çalışmaları konusunda devrim yarattı. RNAs algılama yöntemleri, seminal çalışmalarda siteye özel mRNA lokalizasyonu ile gen ifadesi yönetmeliğine bağlı olarak büyük ölçüde genişledi. Dinamik mRNA süreçleri artık mRNAs 'ı algılayan yaklaşımlar aracılığıyla, dinamik moleküler davranış aralığını yakalamak için yeterince hızlı olan mikroskopi ayarlarıyla birlikte görselleştirilebilir. Moleküler işaret teknolojisi, yaşayan hücrelerde endojen transkriptleri doğrudan tespit edebilen bir hybridizasyon tabanlı bir yaklaşımdır. Moleküler işaretler, yalnızca benzersiz bir hedef dizisine hibridizasyon üzerine floresan olan, saç iğne şeklinde, dahili olarak bastırılmış, tek nüklotid ayrımcılık nüklenik asit probları vardır. Gelişmiş Floresan mikroskopisi ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile birleştiğinde, mRNAs 'ın hücre içi hareketinin uzamsal ve temporal takibini gerçekleştirmesini sağlar. Bu teknoloji, endojen transkriptleri tespit edebilen tek yöntem olmasına rağmen, hücre biyologlar canlı hücre görüntüleme için böyle problar tasarlama zorlukları nedeniyle henüz tam olarak bu teknolojiyi kucakladı değil. Yeni bir yazılım uygulaması olan pinmol, canlı hücre içindeki mRNA hedef bölgelerine verimli bir şekilde melezleşme etmek için en uygun problar gelişmiş ve hızlı tasarım sağlar. Buna ek olarak, yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı görüntü edinme ve akım, açık kaynak görüntü analiz yazılımı, mRNA 'nın yaşam döngüsünde yer alan dinamik süreçlerin temelinin karmaşıklığının daha ince bir değerlendirilmesine yol açan, rafine edilmiş bir veri çıktısı için izin verir.

Burada tasarım ve Drosophila melanogaster yumurta odalarına moleküler işaretler teslim için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Endojen maternal mRNAs 'ın doğrudan ve son derece spesifik tespiti ve görselleştirilmesi, iplik diski konforkop mikroskobu ile gerçekleştirilir. Görüntüleme verileri, oocayt içinde özel bölgelere taşınan ve lokalize olan mRNAs 'ın dinamik hareketi hakkında ayrıntılı bilgi almak için ICG yazılımında nesne algılama ve izleme kullanılarak işlenir ve analiz edilir.

Introduction

Uzamsal ve temporal çözünürlüğe sahip dinamik olayları görselleştiren hücre biyolojisi çalışmaları, floresan bazlı canlı hücre görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi ile mümkün hale gelmiştir. Şu anda, In vivo mRNA görselleştirme RNA aptamer-protein etkileşimleri dayalı teknolojiler aracılığıyla elde edilir, organık boyalar RNA aptamer kaynaklı floresans ve nüklik asit prob tavlama1,2, 3. hepsi teklif yüksek özgüllük, hassasiyet ve sinyal-to-background oranı. Ancak RNA aptamer merkezli yaklaşımlar, bir transgeni protein veya organik boya bağlama için gerekli olan yapay yapısal motiflerle RNA 'ya ifade etmek üzere tasarlanan kapsamlı genetik manipülasyon gerektirir. Örneğin, MS2/MCP sistemi, bakteriyofaj MS2 kat proteini (MCP) için bağlayıcı dizinin birden fazla tandem tekrarı içeren bir RNA yapısını ifade eden bir transgeni ve bir floresan proteini kodlayan başka bir transgeni ifade etmesini gerektirir. MCP4,5' e kullanılmış. Bu tür ikincil yapısal motiflerin RNA 'ya ilavesi, hantal floresan etiketli bir proteinle birlikte, yerli RNA süreçlerinin6' nın etkilenmesi konusunda endişeler ortaya çıkmış olabilir. Bu endişeyi ele alan ve ek benzersiz avantajlar sunan bir teknoloji, nüklik asit bazlı yaklaşımdır, moleküler işaretler (MBs). MBS, endojen mrb 'lerin Multiplex tespitine, tek nüklemotid varyasyonlarının ayrımcılığını ve hedef mRNA7,8ile hibridizasyon hızlı kinetiği için izin verir. MBS onlar hedeflerine melezleşme bir kez bir flororojenik Konformasyonel değişikliği geçiren önce bir sönük saç iğne kat kalır oligonükleotit problar (Şekil 1C)9. Birkaç grup, hem kodlama olmayan Rnas 'ları (MicroRNAs ve lncrnas)10,11,12,13, RNA retrovirüsler14 ve dinamik DNA-proteini algılamak için MBS kullanmanın başarısı vardı etkileşimleri15. Onlar başarıyla çeşitli organizmalar ve dokularda, zebra balığı embriyo16, nöronlar13, tümör dokusu17, ayrım kardiyomiyosit18ve Salmonella gibi görüntüleme için istihdam edilmiştir 19 yaşında.

Burada yaşam D. melanogaster yumurta odalarında endojen mrnas için tasarım, teslimat ve algılama yaklaşımı, aktif moleküler taşıma dinamik aralığını yakalamak için yeterince hızlı bir mikroskopi set-up ile birleştiğinde açıklanmaktadır. D. melanogaster yumurta odası, erken germline kök hücre bölünmesi ve maternal gen ifadesinden bölümsel vücut planı20' ye kadar çok çeşitli gelişim çalışmaları için ideal bir çok hücreli model sistemi olarak hizmet vermiştir. 21 yaşında. Yumurta odaları kolayca izole edilir, büyük ve saydam, ve ex vivo analiz saatlerce dayanabilir, onları görüntüleme denemeleri için son derece kolay hale. Çok iş aktif tercüme edilmeden önce ayrık alt hücre bölgelere maternal transkriptleri asimetrik lokalizasyonu üzerinde duruldu. Özellikle, Oskar mRNA lokalizasyonu ve oocayt posterior Pole sonraki çeviri ölümcül bir bicaudal embriyo fenotipi22önlemek için sıkıca düzenlenmiş bir şekilde gerçekleşmesi gerekir. Oskar mRNA, Hemşire hücreleri denilen 15 germline hücrelerinde yazılmış ve aktif olarak sitoplazmik köprüler aracılığıyla taşınan, halka kanalları denilen, oocyte içine, Olgun yumurta olur ve sonuçta döllenen germline hücre (Şekil 1a ). Uzun menzilli hücre içi seyahat ile birlikte, Oskar mrnp ve gelen protein faktörleri dinamik işe alma ve değişimi ile ilgili zaten mevcut bilgi önemli miktarda, Oskar bir tercih aday yapmak çalışma mRNA yaşam döngüsünün birçok süreçleri. MBs mRNA lokalizasyonu süreci ile ilgili detayları açığa ve Drosophila oogenesis sırasında mRNA taşıma kontrol protein faktörlerinin düzenleme ve fonksiyon deşifre etmede enstrümantal olmuştur. Özellikle, MBS 'yi hemşire hücrelerine mikro injeksiyon ve canlı hücre görüntüleme deneyleri yaparak, endojen mrb 'ların takibi mümkündür8,23.

Burada sunulan yol haritası, doğal hücresel ortamında endojen mRNA 'yı izlemek için veri analizini gerçekleştirirken, MBs kullanarak canlı bir hücre görüntüleme deneyi yaparak, görüntüleme verilerini elde ederek tam bir sürecin adımlarını sunar. Adımlar değiştirilebilir ve daha fazla kendi laboratuar ayarı içinde diğer dokular/hücre türleri ile çalışan araştırmacılar ihtiyaçlarını karşılamak için optimize edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. canlı hücre görüntüleme için MBs tasarımı

  1. Mfold SUNUCUSUNDAN "RNA formu" kullanarak mRNA hedefin ikincil yapısını tahmin etmek IÇIN hedef RNA sırasını katlayın (http://unafold.RNA.Albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-form).
    1. Yapıştır/FASTA formatında hedef dizisini yükleyin, 5 veya% 10 alt optimalite seçin (sırasıyla MFE değerinin 5 veya% 10 ' unda katlanabilir ücretsiz enerji içeren yapılar) ve en fazla hesaplanan katlanmaların sayısını buna göre ayarlayın (örn.% 10 için daha büyük alt-optimality).
      Not: MBs tasarlarken alt optimum ikincil yapıların eklenmesi, hedef mRNA içindeki bölgelerin tanımlanmasına izin verir, bu da minimum serbest enerji (MFE) yapısı için tahmin edildiği gibi daha esnek veya daha sert olabilir canlı hücre görüntüleme için uygun MBs genel tasarımı.
    2. 801 ve 8.000 NT arasında mRNA uzunlukları için 800 nükleotidler (NT) veya "toplu iş" mRNA hedefleri için bir "acil iş" seçin. "ss-Count" dosyasını basit metin dosyası olarak kaydedin.
  2. MRNA hedefi için birkaç MB tasarımı ( pinmol programının kullanımını açıklayan öğreticiler bakın) istenen parametrelerle pinmol programı (https://bratulab.wordpress.com/Software/) için giriş olarak adım 1,1 ' de elde edilen "ss-Count" dosyasını kullanın 24 at https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-Mac/).
    1. BLAST analizi gerçekleştirerek seçilen MBs 'nin özgüllüğünü belirleyin: uygun veritabanıyla "blastn" kullanın (örneğin, Oskar mRNA 'Ya özgü MBS için "RefSeq-RNA" veritabanını ve Drosophila melanogaster organizmayı kullanın).
    2. MRNA hedefinin herhangi bir dokuya özgü ifadeyi tanımlayın (örn. Oskar mRNA flybase ≫ yüksek verimlilik ifade verisi ≫ FlyAtlas anatomi microarray veya modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/Reports/FBgn0003015) ve ile karşılaştırın herhangi bir pozitif BLAST hits. Aynı zamanda ilgi doku/hücre içinde ifade edilen diğer MRI ile >% 50 çapraz Homoloji gösteren probları ortadan kaldırın.
  3. Canlı hücre görüntüleme (örn. Cy5/BHQ2)25' i gerçekleştirmek için kullanılabilen mikroskopinin ayarlanması için uygun fluorophore ve giderici çiftini seçin.

2. MB sentezi, arıtma ve karakterizasyonu

  1. Daha önce açıklanan7, ya da ticari sağlayıcılardan Hizmetleri, sentezlemek ve bir beş MBS arındırmak için (Yukarıdaki nota bakın), aşağıdaki etiketleme şeması kullanarak-ev sentezi ve arıtma kullanın: [5 ' (fluorophore)-(C3 veya C6 bağlayıcı)-(2 '-O -metil MB serisi)-(Quencher) 3 ']. Ters fazlı HPLC kullanarak, evde veya ticari sağlayıcının hizmetlerini kullanarak MBs 'yi arındırın.
    Not: Otomatik prob sentezi için kullanılan fosforamidler 2 '-O-metil ribonükleotit modifikasyon olmalıdır. Bir de daha kısa bir MB ve hedef mRNA26arasında bir melez istikrarı artırmak için kilitli nüklik asit (nNa) ve 2 '-O-metil modifikasyonları Chimeras kullanabilirsiniz.
  2. Hedeflenen RNA bölgesinin dizisiyle eşleşen DNA oligonükleotidler synthesizer ve böylece MBs prob bölgesine tamamlayıcı, in vitro karakterizasyon kullanmak için (bkz: 2,3 adım 2,5; Yukarıdaki Not). DNA-oligonükleotid hedef Mimic ile MB hibridizasyon maksimize, DNA hedef dört ek nükleotid her ucunda dahil ederek, hedef mRNA sırası bulunan gibi.
    Not: hedeflenen sırayı algılamak için MB 'nin verimliliğinin daha titiz bir karakterizasyonu, tamamlayıcı DNA oligonükleotidler8yerine in vitro sentezlenmiş RNA hedefleri kullanılarak gerçekleştirilebilir.
  3. Tek başına MB termal denatürasyon gerçekleştirmek, onun erime sıcaklığı ölçmek (TM), ve MB fizyolojik sıcaklıkta istenen saç iğne şeklini varsayar onaylayın. 60 ile 90 °C arasındaki TM değerlerini gözlemledik.
  4. DNA oligonükleotit hedef varlığında MB termal denatürasyon gerçekleştirmek ve MB ölçmek: DNA hedef melez 's TM, daha önce açıklanan7. MB: DNA hibrid için 55 ile 60 °C arasında bir TM istenidir.
  5. Karşılık gelen DNA oligonükleotit hedef ile in vitro hibridizasyon reaksiyonlar gerçekleştirin ve MB verimliliğini belirlemek: fizyolojik sıcaklıkta DNA hibrid oluşumu, daha önce açıklanan7. DNA hedef mimik ile hızlı hibridizasyon kinetik istenen, ancak DNA hedefleri ile yüksek hibridizasyon verimliliği göstermez MBS In vitro ve/veya in vivo hedef mRNA ile daha iyi bir performans olabilir.

3. mikroenjeksiyon için bireysel yumurta odaları diseksiyon ve hazırlanması

  1. Taze Maya hamur ile 2-3 gün boyunca yeni yumurtadan, evlenmiş kadın yem.
  2. Anesteziye bir CO2 pad üzerinde uçar ve ince cımbız (Dumont #5) kullanarak, bir cam kapak slip üzerinde 700 Halocarbon yağı bir damla içine transfer 1-2 kadın.
  3. Bir çift Cımbız kullanarak, bir stereomicroscope altında dorsal tarafı ile sinek yönlendirmek. Arka ucunda küçük bir kesi yaparak kadın karın incelemek ve yavaşça yağ içine yumurtalıkların çifti sıkmak.
  4. Yumurtalıkları yeni bir coverslip üzerinde bir yağ damlası üzerine ekidir. Diğer cımbız ile ovariole en genç aşamaları kapalı pinching ederken yavaşça bir cımbız ile bir yumurtlama tutun. Oskar mRNA aktif olarak lokalize ve Mid-oogenesis sonra (aşamaları > 7), ve Genç yumurta odaları (aşamaları < 7) enjekte etmek daha zordur ve uzun süre hayatta değilsiniz. Bireysel ovarioles veya yumurta odaları izole edilmiş ve dikey olarak hizalanıncaya kadar yavaşça kapak kayma (aşağı hareket ile) sürükleyin. Ovariole yumurta zincirinden istenmeyen aşamaları keserek daha ayrı tek yumurta odaları.
    Not: Bireysel alay yumurta odaları yağ yüzen değil emin olun, ve onlar kapak kayma uygun. Bu hem başarılı mikroenjeksiyon ve görüntü edinme için önemlidir.

4. yumurta Chambers hemşire hücreleri içine MBs mikroenjeksiyon

  1. Bir moleküler işaret (örn. osk2216Cy5) kullanarak MB çözümünü hazırlayın veya farklı mrb 'ler hedefleyen ve ışıksal farklı fluorophores (örn. osk2216Cy5 ve drongo1111Cy3) ile etiketli iki MBS karışımı. HybBuffer 'da her MB 200-300 ng/μL konsantrasyonu kullanın (50 mM Tris-HCl-pH 7,5, 1,5 mM MgCl2 ve 100 mm NaCl). Her HybBuffer (örn. osk82, osk1236, osk2216) 200 ng/μL aynı mRNA hedefleyen aynı fluorophore ile etiketlenmiş dört MBs bir kokteyl için. Mikroenjeksiyon için iğne yüklemeden hemen önce MB çözüm aşağı spin.
  2. Hedefi seçin. Uygun bir yumurta odası bulmak ve mikroenjeksiyon yapmak için 40X yağ amacı önerilir.
  3. Ayrık yumurta odası ile lamel magazini mikroskop sahne üzerine monte edin. Odak konumda hedefi getirmek ve bir orta-geç gelişimsel aşamada bir yumurta odası tanımlamak, bu düzgün mikroenjeksiyon için yönlendirilmiş (yani, bir hemşire içinde kolay enjeksiyon için izin iğne ucu Için dik AàP ekseni ile oksit için proksimal hücre).
  4. ~ 1 μL MB çözeltisi (bkz . Adım 4,1) ile bir iğne (ticari veya ev27hazırlanmış) yükleyin ve microinjector bağlayın. D. melanogaster yumurta odalarında mikroenjeksiyonları için, bir açı < 45 ° mikroskop aşamaya (örneğin 30 °) birkaç hemşire hücrelerini delme önlemek için Iğne ( malzeme tablosunabakın) yönlendirmek.
  5. 500-1000 hPa enjeksiyon basıncı ve 100-250 hPa Dengeleme basıncı ile enjektörü ayarlayın (bkz. malzeme tablosu).
  6. Yavaşça yumurta odaları yağ damla geçersiz bir alan görünümü alanında getirmek için sahne hareket ettirin.
  7. Mikro manipülatör joystick kullanarak, hafifçe yağ damlası içine iğne düşük ve bakış alanı çevre doğru odağı içine ucu getirmek.
  8. İğne ucunu hava kaldırmak ve iğne akışı olduğundan emin olmak için bir ' temiz ' işlevi gerçekleştirin.
  9. İğne ev konumuna getirin ve mikroenjekte olmak için yumurta odasına odaklanmak, sonra odak içine iğne geri getirmek ve yumurta odasının kenarına yakın konumlandırmak.
  10. Folikül hücrelerini hemşire hücrelerinden ayıran membranın odak noktası olduğu gibi, hedefin Z pozisyonunun ince bir ayarını gerçekleştirin.
  11. Bir hemşire hücresine iğne takın ve 2-5 s için enjeksiyon gerçekleştirin.
  12. İğneyi yavaşça çıkarın ve ev konumuna geri çekin.
  13. Görüntü edinme (60-63x veya 100x) için istenen büyütme hedefini değiştirmek, yumurta odasına odaklanmak, ve edinme başlar.

5. bir Spinning disk Confocal mikroskop kurulum kullanarak veri edinme

Not: Özel Kurulumumuz için malzeme tablosunu görün.

  1. 8-16-bit görüntülerin XYZCt yığınını kaydetmek için edinme protokolünü ayarlayın (XYZ = hacim, C = kanal, t = zaman).
  2. İstenilen kanallar için lazer hatları seçin (örn. Cy5 için 641 nm lazer ve GFP için 491 Nm) ve kanalları sırayla elde etmek: ilk olarak her kanaldaki floresan sinyali ve ardından Z konumunu değiştirmek için uygun kolokalizasyon analizine izin verir.
  3. Z adımını (örn. 0,3 μm), üst ve alt Z sınırlarını (örn. -2 μm-2 μm) seçin.
  4. Edinme süresini ve örnekleme hızını girin (örn. 1 h 'ye kadar her 15-30 s).
  5. Satın alma işlemini başlatın.

6. işleme, Izleme ve Koyerelleştirme bilgileri almak için veri analizi ve video dosyalarının hazırlanması

  1. Görüntü Işleme
    1. Download, açmak ve açık Icy, bioımage Bilişim için açık bir topluluk platformu (http://icy.bioimageanalysis.org/)
    2. 5. adımda elde edilen XYZCt yığınını açın: resim/sıra > dosyası > aç.
    3. Stack 'i ımagej 'ye Dönüştür: ımagej > Araçları > ıJ 'ye Dönüştür, ayrılmış mod açık.
    4. Bir substack (Z adımlarının bir dizi ve daha da analiz edilecek zaman noktaları bir seçim) olun: ımagej > Image > yığınları > Araçları > yapmak Substack...; istediğiniz kanalları, Z-adımlarını ve zaman noktalarını seçin.
    5. Substack TIFF dosyası olarak kaydedin: ımagej > Dosya > > tiff olarak kaydedin...; Sonraki adımlar için bu dosyayı kullanın.
    6. Bölünmüş kanallar: ımagej > Image > Color > bölünmüş kanallar.
    7. Arka plan yığını kullanarak veya arka plan çıkarma: ımagej > Process > Image Calculator... veya Rolling Ball seçeneğini kullanarak: ımagej > Process > çıkarma Arkaplan..., Rolling Ball yarıçapı seçin. "Kabul et" seçeneğini seçmeden önce seçilen yarıçapın görüntüsünü önizleyin.
      Not: arka plan sinyali ağırlıklı olarak flurorophore yanlış Quenching ortaya çıkacaktır. Sinyal: arka plan oranı (s:b) genellikle bir MB 's "parlaklık" için bir gösterge olarak kullanılır ve MB ve DNA hedef oligonükleotide in vitro hibridizasyon deneyleri ölçülür. Örneğin, MBs osk1236 ve osk2216 bir S:B var ~ 81 ve ~ 120, sırasıyla.
    8. Her kanal için parlaklık ve kontrastı ayarlayın: ımagej > Image > > Parlaklık/kontrast ayarlayın, Uygula 'yı seçin.
    9. Her kanalı ayrı bir TIFF dosyası olarak kaydedin: ımagej > Dosya > > tiff olarak kaydedin....
    10. İki kanal birleştir: ımagej > Image > Color > birleştirme kanalları...; kanalları seçin. Yeni yığını yeni bir TIFF dosyası olarak kaydedin (bkz . Adım 6.1.8).
  2. Spot algılama ve Izleme
    1. Geri Icy Dönüştür: ımagej > Araçları > Icy dönüştürmek.
    2. Ölçek çubuğu eklentisi yüklüyse, bir ölçek çubuğu otomatik olarak Icy 'ye dönüşüm üzerine yığına kaplanmış [plugins > Setup > Online eklentisi kullanarak ara]. Gerekirse, Ölçek çubuğunu Denetçi penceresi (ekranın sağ tarafı) > Katman sekmesi > adı > ölçek çubuğunun üzerinden düzenleyin.
    3. Ölçek çubuğunu özgün yığınından kaldırmak için katman sekmesi > adı 'ndan ölçek çubuğu için ' göz ' simgesinin işaretini kaldırın/geçersiz hale getirin. Son yığınında yeniden etkinleştirilebilir.
    4. Yeni işlenmiş yığını görüntü penceresinin menü çubuğundan "Camera" simgesini kullanarak bir ekran görüntüsü alarak kaydedin, "geçerli görünümün bir ekran görüntüsü alın" ve Dosya > > tiff olarak kaydedin....
    5. Spot hassasiyet parametreleri zaten belirlendiği takdirde adım 6.2.7 üzerine hareket ederseniz nokta hassasiyetini belirleyin.
    6. Spotları Algıla: analiz edilecek görüntü veya yığını içeren pencereyi seçin, algılama & Izleme > algılama > Spot dedektörü ve ayarlar parametrelerini doldurun:
      1. Giriş için "Currentsequenceınputdetection" (varsayılan) öğesini seçin.
      2. Ön Işleme için, "kanal 0" (varsayılan) veya istenen kanalı Denetçi penceresi > sırası sekmesindeki numarayı çapraz başvurarak seçin.
      3. Dedektör için, "siyah arka planda parlak noktayı Algıla;", yalnızca analizini yapmak için yığınlarda yeterli Z-dilim yoksa "3B için 2B Dalgıcıklar kullanımını zorla" seçeneğini belirleyin. Her ölçek için "Scale (s)" ve "sensitivite" seçeneğini belirleyin (daha büyük noktalar için daha fazla ölçek ekleyin). Ölçek ve hassasiyet (büyük sayı daha hassas algılama, en fazla 140 Icy tarafından önerilen) deneme ve hata değişkenleri, bu görsel olarak daha sonra kontrol edilmelidir ve üzerine karar verilir.
      4. Ilgi bölgesi için "ROIfromSequence" (varsayılan) kullanın.
      5. Filtreleme için "NoFiltering" (varsayılan) kullanın veya "kabul edilen nesnelerin aralığı (piksel cinsinden)" tanımlamak için "SizeFiltering" seçin.
      6. Çıkış: seçin XLS veya XML çıkış ayarı (2007 MS Excel veya daha önce kullanırken XML biçimini seçin ve > 65000 noktalar vardır). Spot Dedektör sonuçları izleme analizi için kullanılırsa, "SwimmingPool 'a dışa aktar" seçeneğini de seçin.
      7. Spotlar tüm veya çoğu algılandığında kadar çeşitli Ölçek/duyarlılık değerleri kullanarak Spotlar tekrar saptama. Tüm son parametreleri kaydedin.
      8. Kolokalizasyon analizi için, diğer kanal için spot algılaması yineleyin.
    7. Spotları izlemek için algılama & Izleme > Izleme > Spot Izleme > nokta dedektörü 'ni adım 6.2.6 gelen parametrelerle çalıştırın veya mevcut bir veri kümesini seçmek için "algılama sonuçlarını burada Seç" açılır menüsünü kullanın (bunun için spot Dedektör penceresini tutun Adım 6.2.5) açın. "Tahmin parametreleri" düğmesine basın ve parametreler tahmini açılır penceresinde istediğiniz hedef hareketi seçin (örn. "hem difüzif hem de yönlendirilmiş"). "Çalıştır izleme" düğmesine basın.
    8. Adım 6.2.7 oluşturulan yığınla başlayan 6.2.6 ve 6.2.7 adımlarını izleyerek, çok kanallı yığınların noktalarını izlerken diğer kanallar için spot algılamayı ve izlemeyi yineleyin.
    9. Parçaları görselleştirmek için algılama & Izleme > Izleme > Track Manager 'ı seçin – Bu pencere izleme çalışmasını tamamladıktan sonra otomatik olarak açılır. "Renkli parça Işlemcisi" için "etkinleştir" i seçin ve parçalar için istenilen renk gösterimini seçin. İlgili parça işlemcileri "parça Işlemcisi Ekle..." ile erişilebilir. (örn. "Işlemci zaman klibini Izle" seçeneğini belirleyin, "parça kesme parçayı" penceresini etkinleştirin ve geçerli zaman noktasından önce ve sonra görüntülenecek istenen algılama sayısını seçin.)
    10. Parça bilgilerini bir XML Track dosyası olarak Kaydet: algılama & Izleme > Izleme > Track Manager > Dosya > Farklı Kaydet....
    11. Görüntü penceresinin menü çubuğundan "kamera" simgesini kullanarak bir ekran görüntüsü alarak sonuçları kaydedin, "geçerli görünümün bir ekran görüntüsünü alın". Ekran görüntüleri algılanan Spotlar ve/veya sadece Denetçi penceresi > Katman sekmesi > adı > Overlay sarıcı bulunan ilgili göz simgesini (ler) devre dışı bırakma/aktive ederek parçaları ile alınabilir.
    12. Zaman damgası yerleşimi eklentisi yükleyin: Eklentiler > Kurulum > Online Plugin > TimeStamp Overlay > yükleyin.
    13. Zaman damgası ekle: plugins > TimeStamp Overlay (yeni). Zaman damgası yerleştirme ve biçimlendirme yönergeleri için açılır pencerede (ekranın sağ alt köşesinde) yönergeleri izleyin. Zaman aralığı eklenebilir/değiştirilmiş Denetçi penceresi > sırası sekmesinde > Sequence Özellikleri > Düzenle.
    14. Başka bir ekran görüntüsü alarak sonuçları kaydedin. Görüntü kaydet 1) Tiff formatı ve 2) AVI biçimi olarak; AVI formatı için ilk RGB işleme (görüntü/sıra > Rendering > RGB görüntü) dönüştürün.
    15. Görüntüyü istediğiniz oryantasyona döndürün: Müfettiş penceresi > sıra sekmesi > Tuval > döndürme.
    16. Döndürülmüş görüntüyü "geçerli görünümün ekran görüntüsünü alın" olarak kaydedin. Aynı zamanda görüntü ile döndürülecek gibi ölçek çubuğunun "göz" simgesinin seçilmemiş olduğundan emin olun.
    17. YG 'yi seçin ve kırpın: Ilgi alanı > 2B YG 'yi seçin > YG şeklini seçin ve ardından görüntüde YG oluşturun/çizin; Görüntü/sıra > düzlem (XY) > hızlı kırpma.
  3. Kolokalizasyon Analizi
    1. Bir kolokalizasyon Protokolü hazırlayın; çeşitli örnekler Icy Web sitesinde (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List) (bkz. ek malzemeler) sağlanır.
    2. Yükleme kolokalizasyon protokolü: Araçlar > Scripting > Protocols > yükleme ve etkileşim bloklarında parametreleri ayarlamak (örneğin, "Wavelet spot algılama" blok kullanım parametrelerinde adım 6.2.6.) belirlenir.
    3. Bir parçacık boyutunu piksel cinsinden ölçün, kolokalizasyon mesafeyi belirleyin ve "Colocalizer" bloğuna "maksimum mesafe" olarak girin.
      Not: Parçacık piksel cinsinden boyutu algılama sistemine bağlıdır. Boyutu ölçmek için, tek bir parçacığın içine yakınlaştırın ve sinyalin genişliğini kapsayan pikselleri el ile Sayın. En az üç parçacıklardan ortalama ölçümler. Kolokalizasyon için ayarlanacak en fazla uzaklık, parçacığın piksel cinsinden boyutudur (Bu, iki parçacık dokunmadan yarıçapının maksimum toplamını temsil eder).
    4. İstenirse, kolokalizasyon analizi için bir veya daha fazla ROI seçin: Ilgi alanı > 2B YG > YG şeklini seçin > resimde YG 'Yi çizin.
    5. Kırpma YG (s): resim/sıra > düzlem (XY) > hızlı kırpma.
    6. Koyerelleştirme gerçekleştirin: protokoller Düzenleyici penceresi > seçilen protokol sekmesi > Çalıştır. Protokoller düzenleyici penceresindeki son blok, spot algılamaya göre genel koyerelleştirme yüzdesini içerir, ancak her zaman noktasında bulunan bilgiler Inspector penceresinde > çıktı sekmesinde bulunabilir.
    7. Adım 6.2.7 takip ederek kolokalize ve tek parçacıkları takip edin (parça lekeler).
    8. 6.2.16 adımda açıklandığı şekilde kaydedin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pinmolkullanarak, birkaç MBS bir mRNA hedefi için tasarlanabilir (Şekil 1B-C). Sentez ve arıtma sonrasında, seçilen MBs karakterizedir ve in vitro analizini kullanarak karşılaştırılır.

Figure 1
Şekil 1: endojen MRI 'ların canlı hücre görüntülemesinde teknik ve doku tanımı. (A) mikroenjeksiyon için kullanılan orta evre Drosophila yumurta odasının tasvir. Mikroenjeksiyon iğnesi (yeşil), Oskar mRNA 'ya özgü moleküler işaretler kokteyli sunar. Bir hemşire hücresine hızlı bir enjeksiyon, oocayt transit mRNAs tespiti, hem de posterior korteks zaten lokalize mRNA görselleştirme sağlar. (B) bir moleküler işaret tarafından hedeflenen Oskar mRNA içinde Oskar mRNA (C) ikincil yapı bölgesini hedefleme için moleküler işaret sıralamasında pinmol yazılım çıkışı. (C ') Oskarspesifik moleküler Beacon serisi ve katlama, osk2216. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

MBs 'nin optimum performansı in vitro karakterizasyonu ile teyit edildikten sonra problar endojen hedef mRNA (s) canlı görselleştirme için kullanılır. Farklı oogenesis aşamalarında ve özellikle de orta oogenesis (7-10) (Şekil 2a-B) içinde ve sonra Oskar mRNA taşıma ve lokalizasyonu desenleri görselleştirilmesi mümkündür. Küçük boyutları nedeniyle, çok erken aşamalarında yumurta odaları enjekte etmek zordur (1-4). Aynı aşama yumurta odalarına ayrı olarak enjekte edildiğinde, Oskar'A özgü MBS aynı lokalizasyon desenlerini sunar (Şekil 2, osk1236 vs osk2216).

Figure 2
Şekil 2: satın alma işleminden sonra t = 0, 10 ve 30 dk zaman noktalarında vahşi tip yumurta odasında Oskar mRNA zaman dizisi. İki Oskarspesifik moleküler Beacon (osk1236 ve osk2216), (A) Aşama 6-7 yumurta Chambers ve (B) aşama 9 yumurta Chambers hemşire hücre enjeksiyonları. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Farklı mRNA hedefleri ışıksal farklı floresan etiketli MBS kullanarak ortak görselleştirilebilir (Şekil 3). MB solüsyonu bir hemşire hücresine (Şekil 3A) veya oocayt 'A (Şekil 3B) mikroenjekte edilebilir. Bir hemşire hücresinin sitoplazması içine enjekte MBs serbestçe diğer hemşire hücrelerine yanı sıra oocyte içine differe, ve böylece hedef bulmak ve mikroenjeksiyon site daha diğer sitelerde floresan sinyali üretmek edebiliyoruz. Örneğin, geç bir oogenesis aşaması (9-10) yumurta odası bir hemşire hücresinde mikroenjeksiyonları yaparken, oosit içinde görselleştirilen fluoresans sinyalinin çoğu zaten lokalize Oskar mRNA tarafından oluşturulur, ve daha az aktif olarak taşınan daha önceki aşamalarında daha yaygın olan transkriptler (7-8). Klasik MB 'Ler, çekirdekler içinde spesifik olmayan sinyale yol açacaktır, bu nedenle Analizi yumurta odasının sitoplazmik bölgelerine kısıtlar. Nötravidin veya altın nanopartiküller gibi ek değişiklikler, bu spesifik olmayan sinyali28,29azaltmak veya ortadan kaldırmak için kullanıldı. Bu nükleer olmayan spesifik sinyale rağmen, Oskar mRNA 'nın In vivo tespiti için MBS 'nin ÖZGÜLLÜĞÜ bir fret yaklaşımı8kullanılarak kuruldu ve MB Co-enjeksiyon ile in vitro transkripsiyonu Oskar mRNA bir fluorophore ışıksal MB 's etiket23farklı ile etiketlenmiş.

Figure 3
Şekil 3: canlı yumurta odalarında Iki mRNA türünün ortak görselleştirme. (A) hemşire hücresi ve (B) oosit Stage 8-9 Egg Chambers 'da Oskar-ve Drongospesifik moleküler işaretler ile birlikte enjeksiyonlar. Oskar (kırmızı) ve Drongo (yeşil) mrnas oosit (Asterix) posterior ucunda colocalize ve Drongo da Dorso-anterior birikimi (Arrowhead) gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Düşük ifade düzeylerini gösteren mRNA hedefleri için, mRNA molekülü başına floresan sinyali, her biri farklı hedef bölgelere (rakamlar 4 ve 5) bağlayan en az Iki MB içeren bir kokteyl çözümünü enjekte ederek artar.

Figure 4
Şekil 4: hem MBs hem de MS2-GFP sistemi ile Oskar mRNA 'nın görselleştirilmesi. Bir yumurta odasında bir MB kokteyl çözeltisi (MB) microinjeksiyonları OSK-MS2:: MCP-Gfp30 (Gfp) ifade. Bir hemşire hücresinin Mikroenjeksiyonu sonrasında, görüntüleri her 30 s için 20 dakika elde edildi. İlgi iki bölge seçildi, bir hemşire hücresi ve bir rosit bir YG. Noktalar tespit etmek için her YG için farklı duyarlılık kullanılmıştır. YG hemşire hücre: ölçek 2, hassasiyet 100 GFP ve MB için. YG oocyte: ölçek 2, hassasiyet 50 GFP ve 110 MB için. Kolokalizasyon mesafesi her iki ROI için 4 pikseldir. Tüm yumurta odası ve hemşire hücresindeki zoom 12 dk zaman noktasında gösterilir ve oosit yakınlaştırma 14 dk zaman noktasında gösterilir. MB lekeler (kırmızı daireler) ve GFP lekeler (yeşil daireler) her bir yaklaşım tarafından algılanan Oskar mRNA parçacıkları tanımlamak ve coyerelleştirme parçacıklar (sarı) MB ve Gfp noktalar en fazla 4 piksel dışında nerede olduğunu gösterir. 0,3 μm adımda 14 Z optik dilimlerin XY-projeksiyonları. 63 x objektif (yağ, NA = 1,4), XY = 0,24 μm, pozlama süresi 500 MS, 5,23 ve 5,39 nm ve 641 nm Laser için mW lazer gücü ile 16 bit veri olarak elde edilmiştir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Figure 5
Şekil 5: Oskar mRNA özel MBS ile hemşire hücresi Mikroenjeksiyonu sonrasında, Oocayt izleme analizi. MB parçacıkları, hassasiyet 110 ile ölçek 2 ' de algılandı ve geçerli zaman diliminden önce/sonra 8 zaman noktası gösterilir. MB lekeler (kırmızı daireler) oocayt hacminde izlenir; izler, gösterilen 12 dk zaman noktasından önce/sonra 8 zaman noktasından algılama bilgilerini temsil eder. Her renk tek bir parçayı temsil eder. 0,3 μm adımda 14 Z optik dilimlerin XY-projeksiyonları. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Oskar mRNA kaçakçılığının MBs vs MS2/MCP ile saptanması ile karşılaştırılması sırasında, Oskarspesifik MBS tarafından oluşturulan floresan sinyali, 10 Gfp ile etiketlenmiş transgenik Oskar mRNA 'nın taşınması ve lokalizasyonu üzerine sadakatle belgeler MS2/MCP sistemi (Şekil 4) aracılığıyla moleküller. Orta oogenesis de Oskar-MS2/MCP-Gfp transgenik yumurta odalarında, edinme veri analizi MBS ve Gfp-etiketleme kullanılarak algılanan genetiği değiştirilmiş Oskar-MS2 mRNA floresan sinyalleri arasında kapsamlı kolokalizasyon gösterdi . 12 ve 14 dk Post-enjeksiyon, 57% (7 MB-nesneler ve 13 GFP-nesneleri, 4 kolokalize nesneler ile) ve 93% (30 MB-nesneler ve 51 GFP-nesneleri, 28 kolokalize nesneler ile) algılanan MB parçacıkları, Hemşire hücrelerinde ve oosit GFP parçacıkları ile kolokalize Sıra -sıyla. Analizimiz, Oskar -MS2 mRNA ' nın% 31 ve% 55 colocalization yüzdeleri, sırasıyla bir hemşire hücresi ve ooksit sitoplazması Içinde MBS ile algılanan Oskar mRNA ile ortaya çıkarır. Dahası, 5D-yığınları, hem hemşire hücresinde hem de oosit sitoplazmasında uzun mesafeli taşıma için Oskar mRNA yörüngeleri belirlemek üzere daha da analiz edilebilir (Şekil 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Drosophila yumurta odalarında endojen mRNA ticaretinin canlı görselleştirme artık pinmol yazılımı ile kolayca tasarlanabilen, spesifik, verimli ve çekirdeksiz dirençli MBS kullanımına dayanır. MBs bir hedef mRNA (tercihen bölgeler ikincil yapısı ücretsiz) içinde benzersiz dizileri algılamak için tasarlanmış spesifik problar, bir transkript olası son derece çözülmüş algılama yapma. Diğer dokular/hücre türleri için bu tekniği/Protokolü benimseyen tek sınırlama, faiz numunesi için MB tesliminin verimliliğidir. Diğer yaklaşımlar, bir aptamer ve bir RNA-bağlayıcı proteini bir hedef mRNA (örneğin MS2/MCP sistemi) görselleştirmek için bir floresan protein ile etiketlenmiş ifade etmek için doku genetik manipülasyon gerektirir, çoğullama, en çok, iki transkriptler için mümkündür. MB teknolojisi, yaşayan hücrelerde endojen MRI 'lar tespit etmek için tek başına duruyor ve iki mRNA türünün ortak görselleştirilmesine izin veren tek tekniktir.

MBS geniş bir floresan moisanlar yelpazesi ile etiketlenebilir ve 2 '-O-metilribonucleotides veya kilitli-nüklenik asitler gibi değiştirilmiş nüklotidler sentezlendiğinde hücresel ortam içinde kararlı26,31. Bu omurga modifikasyonları da hedef için MBs ' yakınlık artar. Birkaç MBs, ortalama uzunlukta hedef mRNAs 'lar için kolayca tasarlanmıştır. Ancak, kısa ve/veya son derece yapılandırılmış hedefler için bazı sınırlamalar karşılaşılabilir. Bu bizim küçük moleküler işaretler benimseyerek üstesinden gelebilir, hangi için prob bölgenin yaklaşık yarısı bir klasik MB Prob uzunluğu31. Numune tipine bağlı olarak, MBS hücre nüfuz peptidler, lipofection veya mikroenjeksiyon23,32,33,34bağlantı, elektroporasyon yoluyla hücrelere teslim edilir. Canlı hücre görüntüleme deneylerinde bir MB performans verimliliği, hedef yapısı tarafından belirlenir mRNA hedef içinde karşılık gelen tamamlayıcı sıra için melezleşme prob sırası yeteneğine eğilir. In vitro ölçülen termodinamik parametreler kullanılarak elde edilen öngörülen MFE RNA ikincil yapısı, hedef erişilebilirlik değerlendirmede değerlidir, ancak sonuçta In vivo hedef yapısı ve diğer hücresel ile hedef etkileşimi canlı hücre görüntüleme için MB uyguniyetini belirleyecektir faktörler. RNA ikincil yapısının genom çapında analizi, birçok RNAs 'ın in vitro35' den daha az yapılandırılmış olduğunu göstermektedir. MBs kullanarak In vivo hedef algılama verimliliği özellikle bağlayıcı sitenin erişilebilirliğine bağlı olmasına rağmen, belirli MB özelliklerini optimize mRNA hedef gelişmiş bir görselleştirme sağlayacaktır. Özellikle, aşağıdaki parametrelerin dikkatli bir seçim gerçekleştirilmelidir: 1) Probe uzunluğu 18 ve 26 arasında değişebilir, prob nükle bileşimi arasında olduğu gibi 31 ve 55% GC çiftleri hedef: MB melez, 2) 5 BP kök sırası G/C olmalıdır zengin, mRNA hedef yokluğunda saç iğne şeklini korumak ve uyuşmazlığı ayrımcılık sağlamak için, 3) değiştirilmiş bir omurga hem MB ve hedef nüklenleri karşı koruma için kullanılmalıdır: MB hibrid, 4) fluorophore/Quencher çifti ek sunabilir MB 's kök mütevazı istikrar ve 5) fluorophore uzun görüntüleme zaman aralıkları sırasında kararlı olmalıdır. Buna ek olarak, klasik MBs genellikle bir nükleer non-spesifik sinyal34, bizim durumda sadece orta veri işleme ve analiz etkiler oluşturmak. Ancak, hücresel düzeyde mRNA kaçakçılığı görselleştirme için, bu spesifik olmayan sinyal sorunlu olabilir. Birkaç grup, MBS 'nin çekirdeğe teslim edilmesini engelleyen ve böylece bu olası spesifik olmayan sinyali33,36ortadan kaldıran tRNA, peptidler ve nanopartiküller gibi değişiklikler veya Etiketler önerdi.

Bu yaklaşımın en büyük dezavantajı canlı hücre görüntüleme için MBs manuel tasarım olmuştur. Bunu gidermek için, MFE ek olarak optimum ikincil yapıları dikkate alarak bir mRNA içinde erişilebilir hedef siteleri kolayca tanımlayan bir Python tabanlı program (Pinmol), hem de tasarımlar saç iğnesi probları, en iyi olduğunu yazdım Canlı hücrelerdeki mRNAs 'ın algılanması için uygundur24. Pinmol , hedef RNA 'nın ikincil yapılarından enerji minimizasyon yaklaşımları ile öngörülen yapısal bilgileri kullanır ve alt optimum yapılardan gelen bilgileri ekleyerek, belirli hedeflenen bölgelerin esnekliği veya rijitliği MBs tasarlarken değerlendirilir. Hedeflenen bölgelerin erişilebilirliğinin yanı sıra, seçilen her bir probun inter-ve intramoleküler etkileşimlerini de dikkate alır. Ayrıca, yüksek derecede düzenlenmiş RNA (örneğin microRNAs veya RNA bağlama proteinleri için bağlayıcı siteler), bu bölgeler MBs 'nin verimsiz bağlanmasına neden olabilecek problar seçerken hedef siteler olarak kabul edilmemelidir. Kullanıcı bu siteleri hedefleyen probları değerlendirebilir ve ortadan kaldırabilir veya Pinmol tarafından kullanılan hedef bölgeyi, bu tür siteleri içermez böylece problar tasarlamak için kısıtlayabilir. Pinmol göreli yeteneği elle tasarlanan MBS24deneysel sonuçları Ile pinmol tasarlanmış MBS sıralamasını karşılaştırarak gösterilmiştir. Pinmol benzer hedef bölgeler için seçilen ve tasarlanmış MBS yanı sıra mRNA üzerinde yeni erişilebilir siteler belirlendi. Bu, floresan sinyalinin arka planda artması gereken düşük kopya numarası transkriptlerinin saptanması için gereklidir. Etkin bir hedef mRNA birkaç erişilebilir sitelere melezleşme MB numaralarını ölçeklendirerek, sinyal amplifikasyon elde edilebilir. Bu nedenle, bu program, hedef mRNA başına birden çok MBs tasarlamak ve aynı anda canlı bir hücrede çok sayıda MRI görselleştirmek için hızlı bir yaklaşım kolaylaştırır.

Yumurta odası içinde taşınan mRNAs yüksek kaliteli 5D (XYZCt) edinme verileri elde etmek için, bireysel yumurta odaları ve hemşire hücrelerine etkili mikroenjeksiyon uygun diseksiyon önemlidir. Gelişimin erken aşamalarında yapılan çalışmalar için, mikroenjeksiyon yumurta odasının evrelenmesine karşı zararlı olabilir ve böylece canlı hücre görüntüleme denemenin uzunluğu kısaltılır (< 20 dk). Ticari olarak kullanılabilen Ultra iğne kullanarak mikroenjeksiyon deneylerinin artan başarı oranı sağlanabilir. Ayrıca, satın alma ayarlarının hızlı bir şekilde ayarlanması önemlidir, böylece erken, enjeksiyon sonrası zaman noktaları yakalanabilir. Spot algılama ve izleme verilerinin kalitesi sadece elde edilen görüntülerin kalitesi kadar iyi olacaktır.

Görüntü edinme üzerine, sonraki analiz adımlarının da dikkatle ve hassas bir şekilde tamamlanması esastır. Post-edinme işleme ve analiz zorluklar kendi kümesini teklif rağmen, onlar bir özel deneme veya örnek için uygun yazılım seçerek aerodinamik olabilir. Geçerli mevcut programlar Volocity (PerkinElmer), Imaris (Bitplane), ımagej/Fiji ve Icy37içerir. Üç, ICG çeşitli faydalar sunuyor, hem de sağlar açık bir topluluk platformu olduğu gibi, işleme (ımagej yoluyla) ve görüntüleme verilerinin analizi. Burada, Icy kullanarak RNA görüntüleme verilerinin verimli işlenmesi ve analizi için gerekli adımları tarif ediyoruz. Sonuçlarımız, tüm yumurta odasındaki iki mRNA türünü ortak görselleştirerek ve MB teknolojisi ve MS2/MCP sistemi üzerinden bir mRNA izleyerek elde edilen verilerin temsilidir.

ICG yazılımıyla satın alma sonrası işleme, görüntü işlemede Kullanıcı esnekliği sağlar (örn. parlaklık, kontrast) ve analiz (örneğin, floresan partiküllerin Spotlar olarak algılanması için eşik/kesme ayarları) . ICG ayrıca, protokoller Düzenleyicisi 'nin her bloğunun içinde denetim ilgili parametreleri etkinleştirir (örn. kolokalizasyon mesafesini belirlemek ve "Colocalizer" bloğuna "maksimum mesafe" olarak kullanmak). Buzlu yazılım lansmanında güncellenir ve herhangi bir sorunu gidermek için güvenilir çevrimiçi desteğe sahiptir. Açıklanan protokol, Oskar mRNA 'yı tespit etmek için tasarlanmıştır ve temsili sonuçlar algılanan ve Izlenen mRNA parçacığın türü için optimize edilmiş parametreler kullanılarak elde edildi. Örneğin, Oskar mRNA ağırlıklı olarak ooksit gelişimi boyunca çeşitli protein faktörleri ile Mikrotubul ağ kullanarak ve dinamik bir şekilde ilişkilendirmek, oogenesis orta aşamalarında taşınan bir bol transkript olduğunu. Daha önce Oskar mrnp 'nin hemşire hücrelerinden ooksit23' te taşınması sırasında geniş bir yeniden modelleme yaptığını bildirdik. Ayrıca, MBs kullanarak endojen Oskar mRNA kaçakçılığı temporal ve uzamsal özellikleri karakterize ve Oskar transkript kopyaları yüzlerce büyük Oskar mrnps oluşturmak için dahil edilebilir bulundu.

Colocalization ve Tracking için satın alma sonrası analizler Imaris, ımagej/Fiji ve Volocity gibi diğer yazılımlar kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Icy, eşik yeteneği ve yüksek hassasiyet ve izleme yetenekleri ile floresan parçacıklar ek açıklama için seçildi. Burada, nesne tabanlı kolokalizasyonu tarif, ancak izleme olmadan da olsa, kolokalizasyon, aynı zamanda ınbuz ve ımagej eklentileri (Colocalization Studio, JACoP) kullanarak PCC (Costes) analizi kullanarak çakışan ve kolokalizasyon derecesini belirleyerek niceleyebilir 38 , 39.

Gelecekte, genişletilmiş yumurta odasının hayatta kalmasını sağlamak için optimize edilmiş, uzun süreli görüntüleme Protokolü istenmiştir. Bu, uzun menzilli mRNA kaçakçılığı çalışmalarla ilgili verileri çözümlemek için daha uzun bir edinme sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, ifşa etmek için ilgi çakışması yoktur.

Acknowledgments

Biz, sentez, etiketleme ve moleküler işaretçileri ve arıtma için Salvatore AE Marras (kamu sağlığı Araştırma Enstitüsü Merkezi, Rutgers Üniversitesi) teşekkür ve Daniel St Johnston (Gurdon Enstitüsü, Cambridge Üniversitesi) Oskar-MS2 için/ MCP-GFP transgenik sinek stok. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı karıyer Ödülü 1149738 ve DPB profesyonel personel Kongresi-CUNY Ödülü tarafından destekleniyordu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrofluorometer Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon n/a Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette Fireflysci (former Precision Cells Inc.) 701MFL
Dumont #5 tweezer World Precision Instruments 501985 Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm VWR 48393-048
Dissecting microscope Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad Genesee Scienific 59-114
Tris-HCL pH 7.5 Sigma-Aldrich 1185-53-1
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 7791-18-6
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Spinning disc confocal microscope Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera Hamamatsu n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator Eppendorf Inc. 920000037
FemtoJet Microinjector Eppendorf Inc. 920010504
Injection needle: Femtotips II Eppendorf Inc. 930000043
Loading tip: 20 μL Microloader Eppendorf Inc. 930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm VWR 48393-026; 48393-172
Dry yeast Any grocery store n/a
Computer, > 20 GB RAM Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).
  3. Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. Current techniques for visualizing RNA in cells. F1000Research. 5, (2016).
  4. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
  5. Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  6. Garcia, J. F., Parker, R. MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system. RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).
  7. Bratu, D. P. Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells. Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).
  8. Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).
  9. Tyagi, S., Kramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).
  10. Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
  11. Liu, Y., et al. Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).
  12. Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).
  13. Ko, H. Y., et al. A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis. Scientific Reports. 4, 4626 (2014).
  14. Vet, J. A., et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).
  15. Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).
  16. Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).
  17. Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells. Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).
  18. Ban, K., et al. Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4. Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).
  19. Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples. BMC Microbiology. 9, 97 (2009).
  20. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
  21. Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
  22. Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein. Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).
  23. Mhlanga, M. M., et al. In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte. PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).
  24. Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs. bioRxiv. , (2018).
  25. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).
  26. Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection. Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).
  27. Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).
  28. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  29. Jackson, S. R., et al. Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells. Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).
  30. Zimyanin, V. L., et al. In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization. Cell. 134 (5), 843-853 (2008).
  31. Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells. ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).
  32. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).
  33. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).
  34. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).
  35. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).
  36. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
  37. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  38. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
  39. Trcek, T., et al. Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters. Nature Commununications. 6, 7962 (2015).

Tags

Biyoloji Sayı 148 moleküler işaret canlı hücre görüntüleme endojen mRNA görselleştirme mRNA kaçakçılığı Drosophila melanogaster yumurta odası yumurta odası mikroenjeksiyon kolokalizasyon parçacık izleme.
Canlı <em>Drosophila melanogaster</em> yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar,… More

Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers. J. Vis. Exp. (148), e58545, doi:10.3791/58545 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter