Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تصور وتتبع mRNAs الذاتية في غرف البيض الحية Drosophila الميلانوجاستر البيض

Published: June 4, 2019 doi: 10.3791/58545
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1Biological Sciences Department Hunter College, City University of New York, 2Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Graduate Center, City University of New York

Summary

هنا، نقدم بروتوكول للتصور، والكشف، وتحليل وتتبع الاتجار بالحمض النووي الريبي في غرفة البيض الحية Drosophila melanogaster باستخدام منارات الجزيئية، وقرص الغزل المجهرية البؤرية، وتحليل مفتوح المصدر البرمجيات.

Abstract

وقد أحدثت تقنيات التصوير القائمة على الفلورة، بالاقتران مع التطورات في الفحص المجهري الضوئي، ثورة في كيفية قيام علماء الأحياء الخلوية بإجراء دراسات تصوير الخلايا الحية. وقد اتسع نطاق أساليب الكشف عن الـ RNAs بشكل كبير منذ أن ربطت الدراسات الجوهرية بين توطين الحمض النووي الريبي الخاص بالموقع وتنظيم التعبير الجيني. يمكن الآن تصور عمليات mRNA الديناميكية من خلال النهج التي تكشف عن mRNAs، إلى جانب إعداد المجهرية التي هي سريعة بما فيه الكفاية لالتقاط النطاق الديناميكي للسلوك الجزيئي. تكنولوجيا المنارة الجزيئية هي نهج قائم على التهجين قادر على الكشف المباشر عن النصوص الذاتية في الخلايا الحية. منارات جزيئيّة [هيربين-شبد], داخليّا يروي, [سنغل-نوكليوتيد] يميّز [نوكليك سد] تحقيقات, أيّ [فلورسّ] فقط على تهجين إلى تسلسل فريدة هدف. عندما يقترن مع المجهرية الفلورية المتقدمة والتصوير عالية الدقة، فإنها تمكن المرء من إجراء تتبع المكانية والزمانية للحركة داخل الخلايا من mRNAs. على الرغم من أن هذه التكنولوجيا هي الطريقة الوحيدة القادرة على الكشف عن النصوص الذاتية، علماء الأحياء الخلية لم تحتضن بعد تماما هذه التكنولوجيا بسبب صعوبات في تصميم مثل هذه التحقيقات لتصوير الخلايا الحية. تطبيق برنامج جديد، PinMol،يسمح لتصميم محسنوسريع من تحقيقات الأنسب لتهجين بكفاءة إلى المناطق المستهدفة mRNA داخل خلية حية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الحصول على الصور عالية الدقة في الوقت الحقيقي والبرمجيات الحالية المفتوحة المصدر لتحليل الصور يسمح بإخراج بيانات محسنة، مما يؤدي إلى تقييم أدق للتعقيد الكامن وراء العمليات الدينامية التي تنطوي عليها دورة حياة mRNA.

هنا نقدم بروتوكول شامل لتصميم وتسليم منارات الجزيئية في غرف البيض Drosophila melanogaster. يتم إجراء الكشف المباشر والمحدد للغاية والتصور من mRNAs الأمومية الذاتية عن طريق قرص الغزل المجهرية البؤرية. تتم معالجة بيانات التصوير وتحليلها باستخدام الكشف عن الأجسام وتتبعها في البرامج الجليدية للحصول على تفاصيل حول الحركة الديناميكية للmRNAs، والتي يتم نقلها وتوطينها إلى مناطق متخصصة داخل البويضة.

Introduction

وقد أصبحت دراسات بيولوجيا الخلايا التي تصور الأحداث الدينامية ذات الاستبانة المكانية والزمنية ممكنة من خلال تطوير تقنيات التصوير بالخلايا الحية القائمة على الفلورة. في الوقت الحاضر، في التصور mRNA الجسم الحي يتحقق من خلال التكنولوجيات التي تقوم على التفاعلات الحمض النووي الريبي aptamer البروتين، RNA aptamer الناجمة عن الفلورة من الأصباغ العضوية والحمض النووي التحقيق الصلب1،2، 3.أنها توفر كل خصوصية عالية، والحساسية ونسبة الإشارة إلى الخلفية. ومع ذلك، تتطلب النُهج التي تركز على الحمض النووي الريبي معالجة جينية واسعة النطاق، حيث يتم تصميم الترانسجين للتعبير عن الحمض النووي الريبي مع الزخارف الهيكلية الاصطناعية المطلوبة لربط البروتين أو الصبغالعضوي. على سبيل المثال، يتطلب نظام MS2/MCP التعبير المشترك عن ترانسجين يعبر عن بنية RNA تحتوي على تكرارات متعددة جنبا إلى جنب من تسلسل ملزم للبروتين معطف MS2 البكتيريا (MCP)، وترميز آخر transgene بروتين الفلورسنت تنصهر إلىMCP 4،5. إضافة مثل هذه الزخارف الهيكلية الثانوية إلى الحمض النووي الريبي، جنبا إلى جنب مع بروتين الفلورسنت ضخمة الموسومة، أثارت مخاوف من أن عمليات الحمض النووي الريبي الأصلي قد تتأثر6. ومن التقنيات التي تعالج هذا الشاغل وتقدم مزايا فريدة إضافية هي النهج القائم على الحمض النووي، ومنارات الجزيئية (MBs). تسمح الـ MBs للكشف المتعدد عن mRNAs الذاتية، والتمييز في الاختلافات النيوكليوتيدات واحدة، وحركية سريعة للتهجين مع الهدف mRNA7،8. MBs هي تحقيقات oligonucleotide التي لا تزال في أضعاف دبوس الشعر المبردة قبل أن تمر بتغيير التشوه الفلورية بمجرد أن تهجين إلى أهدافها (الشكل1C)9. وقد حققت عدة مجموعات نجاحا في استخدام MBs للكشف عن كل من RNAs غير الترميز (microRNAs وlncRNAs)10،11،12،13،RNA الفيروسات الرجعية14 ودينامية الحمض النووي البروتين التفاعلات15. وقد تم استخدامها بنجاح للتصوير في مختلف الكائنات الحية والأنسجة، مثل أجنة حمار وحشي16، الخلايا العصبية13، أنسجة الورم17، التمييز بين خلايا القلب18، والسالمونيلا 19.

هنا نقوم بوصف نهج التصميم والتسليم والكشف عن mRNAs الذاتية في غرف البيض الحية D. melanogaster إلى جانب إعداد المجهرية التي هي سريعة بما فيه الكفاية لالتقاط مجموعة ديناميكية من النقل الجزيئي النشط. وقد عملت غرفة البيض D. melanogaster كنظام نموذج متعدد الخلايا مثالية لمجموعة واسعة من الدراسات التنموية، من تقسيم الخلايا الجذعية الجرثومية في وقت مبكر والتعبير الجيني الأمومي لتوليد خطة الجسم القطاعية20، 21. غرف البيض معزولة بسهولة، كبيرة وشفافة، وقادرة على تحمل ساعات من تحليل الجسم الحي السابق، مما يجعلها قابلة للغاية لتجارب التصوير. وقد ركز الكثير من العمل على توطين النصوص النفاسية غير المتماثلة في المناطق الفرعية المنفصلة قبل ترجمتها بنشاط. على وجه الخصوص، يجب أن يحدث توطين >أوسكار ميرنا« وترجمته اللاحقة في القطب الخلفي للبويطانة بطريقة منظمة بإحكام لتجنب النمط الظاهري الجنيني الثلاثي القاتل22. يتم نسخ oskar mRNA في 15 خلية جرثومية، وتسمى خلايا الممرضة، ويتم نقلها بنشاط من خلال الجسور السيتوبلازمية، وتسمى القنوات الدائرية، إلى البويضة، والخلية الجرثومية التي تصبح البويضة الناضجة ويتم إخصابها في نهاية المطاف (الشكل1A ). إن الكم الكبير من المعلومات المتاحة بالفعل فيما يتعلق بالتوظيف الدينامي وتبادل عوامل البروتين من وإلى أوسكار mRNP، إلى جانب سفره بعيد المدى داخل الخلايا، يجعل أوسكار مرشحاً مفضلاً للدراسة العديد من العمليات من دورة حياة mRNA. وقد لعبت MBs دوراً أساسياً في الكشف عن تفاصيل حول عملية توطين الحمض النووي الريبي وفك رموز تنظيم ووظيفة عوامل البروتين التي تتحكم في نقل الحمض النووي الريبي خلال Drosophila oogenesis. على وجه الخصوص ، عن طريق حقن الـ MBs الدقيقة في خلايا الممرضة وإجراء تجارب تصوير الخلايا الحية ، من الممكن تتبع mRNAs الذاتية8،23.

تقدم خارطة الطريق المعروضة هنا خطوات عملية كاملة، من إجراء تجربة تصوير الخلايا الحية باستخدام MBs، والحصول على بيانات التصوير، إلى إجراء تحليل البيانات لتتبع الحمض النووي الريبي المحلي في بيئته الخلوية الأصلية. ويمكن تعديل الخطوات وتحسينها لتلبية احتياجات الباحثين الذين يعملون مع الأنسجة/أنواع الخلايا الأخرى داخل إعداد المختبر الخاص بهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصميم MBs لتصوير الخلايا الحية

  1. طي تسلسل RNA الهدف للتنبؤ بالبنية الثانوية لهدف mRNA باستخدام "نموذج RNA" من خادم mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
    1. لصق /تحميل التسلسل المستهدف في شكل FASTA، حدد 5 أو 10٪ دون الأمثل (هياكل مع طاقة مجانية للطي في غضون 5 أو 10٪ من قيمة MFE، على التوالي)، وضبط الحد الأقصى لعدد الطي محسوب وفقا لذلك (على سبيل المثال أكبر ل 10٪ دون الأمثل).
      ملاحظة: إدراج الهياكل الثانوية دون الأمثل عند تصميم MBs يسمح لتحديد المناطق ضمن mRNA الهدف التي قد تكون أكثر مرونة أو أكثر صلابة مما هو متوقع لهيكل الحد الأدنى للطاقة الحرة (MFE) وحدها، مما يحسن التصميم العام لـ MBs مناسبة لتصوير الخلايا الحية.
    2. حدد "وظيفة فورية" لأهداف mRNA من 800 نيوكليوتيدات (nt)، أو "مهمة دفعية" لأطوال mRNA بين 801 و 8000 nt. حفظ ملف "ss-count" كملف نصي بسيط.
  2. استخدم ملف "ss-count" الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.1 كإدخال لبرنامج PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) مع المعلمات المطلوبة، لتصميم العديد من MBs للهدف mRNA (انظر الدروس التي تصف استخدام برنامج PinMol 24 في https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
    1. تحديد خصوصية MBs مختارة عن طريق إجراء تحليل BLAST: استخدام "blastn" مع قاعدة البيانات المناسبة (على سبيل المثال لOskar mRNA محددة MBs استخدام قاعدة البيانات "refseq-rna" والكائن الحي Melanogaster Drosophila).
    2. تحديد أي تعبير خاص بالأنسجة عن هدف mRNA (على سبيل المثال بالنسبة لقاعدة flybase mRNA oskar> بيانات التعبير عالي الإنتاجية> مجموعة FlyAtlas التشريحية الدقيقة أو التضمين التضمين التشريح الحمض النووي الريبي-Seq؛ http://flybase.org/reports/FBgn0003015) ومقارنتها مع أي ضربات الانفجار إيجابية. القضاء على التحقيقات التي تظهر > 50٪ عبر homology مع mRNAs الأخرى التي يتم التعبير عنها أيضا في الأنسجة / الخلية من الفائدة.
  3. حدد زوج الفلوروفور وquencher المناسب لإعداد الفحص المجهري المتاح لأداء التصوير بالخلايا الحية (على سبيل المثال Cy5/BHQ2)25.

2. توليف MB، تنقية، والتوصيف

  1. استخدام التوليف والتنقية الداخليين على النحو الموصوف سابقاً7،أو الخدمات المقدمة من مقدمي الخدمات التجارية، لتوليف وتنقية واحد إلى خمسة MBs (انظر الملاحظة أعلاه)، باستخدام مخطط وضع العلامات التالي: [5'(Fluorophore)-(C3 أو C6 linker) - (2'-O -ميثيل MB تسلسل)-(Quencher)3']. تنقية MBs باستخدام المرحلة العكسية HPLC، في المنزل أو باستخدام خدمات الموفر التجاري.
    ملاحظة: يجب أن يكون phosphoramidites المستخدمة في التوليف التحقيق الآلي تعديل 2'- O-ميثيل ريبونوكليوتيد. يمكن للمرء أيضا استخدام chimeras من حمض نووي مؤمن بالتناوب (LNA) و 2 '-O-methyl التعديلات لزيادة استقرار الهجين بين ميغابايت أقصر وهدفها mRNA26.
  2. توليف الحمض النووي oligonucleotides التي تتطابق مع تسلسل منطقة RNA المستهدفة، وبالتالي هي مكملة لمنطقة التحقيق من MBs، لاستخدامها في توصيف المختبر (انظر الخطوات 2.3 إلى 2.5؛ علما أعلاه). تعظيم التهجين من بروميد الميثيل مع هدف الحمض النووي-oligonucleotide تقليد، من خلال تضمين على كل نهاية من هدف الحمض النووي أربعة نيوكليوتيدات إضافية، كما هو موجود في تسلسل mRNA الهدف.
    ملاحظة: يمكن إجراء توصيف أكثر صرامة لكفاءة MB للكشف عن التسلسل المستهدف باستخدام أهداف الحمض النووي الريبي في المختبر توليفها بدلاً من الحمض النووي القلة التكميلية8.
  3. قم بإجراء إزالة النُصّم الحراري لمادة الMB وحدها، وقياس درجة حرارة ذوبانها (Tm)، والتأكد من أن الـ MB يفترض شكل دبوس الشعر المطلوب في درجة الحرارة الفسيولوجية. لقد لاحظنا قيم Tm بين 60 و 90 درجة مئوية.
  4. إجراء إزالة النُصّم الحراري لبروميد الميثيل في وجود هدف الحمض النووي oligonucleotide وقياس MB:DNA الهدف الهجين Tm، كما سبق وصفه7. مطلوب Tm بين 55 و 60 درجة مئوية لMB: DNA الهجين.
  5. أداء ردود الفعل التهجين في المختبر مع الهدف oligonucleotide الحمض النووي المقابلة، وتحديد كفاءة MB: تكوين الحمض النووي الهجين في درجة الحرارة الفسيولوجية، كما سبق وصفه7. ومن المرغوب فيه حركية التهجين السريع مع تقليد الهدف من الحمض النووي، ولكن MBs التي لا تظهر كفاءة التهجين عالية مع أهداف الحمض النووي قد يكون لها أداء أفضل مع mRNA الهدف في المختبر و / أو في الجسم الحي.

3. تشريح وإعداد غرف البيض الفردية للحقن الدقيق

  1. تغذية فقسحديثا، والإناث التزاوج لمدة 2-3 أيام مع معجون الخميرة الطازجة.
  2. تخدير الذباب على وسادة CO 2، وذلك باستخدام ملاقط غرامة (dumont #5)، نقل 1-2 الإناث في قطرة من زيت هالوكاربون 700 على زلة غطاء زجاجي.
  3. باستخدام زوج من ملاقط، توجيه ذبابة مع الجانب الظهري حتى تحت مجهر مجسم. تشريح البطن الإناث عن طريق إجراء شق صغير في النهاية الخلفية وضغط بلطف زوج من المبيضين في الزيت.
  4. قم بزراعة المبيضين على قطرة زيت على غطاء جديد. عقد بلطف مبيض واحد مع ملاقط واحد في حين قرصة قبالة أصغر مراحل البويضة مع ملاقط أخرى. يتم توطين oskar mRNA بنشاط في وبعد منتصف الأوجينيسيس (مراحل > 7)، وغرف البيض الأصغر سنا (مراحل < 7) هي أكثر صعوبة لحقن ولا البقاء على قيد الحياة طالما. اسحب ببطء على زلة الغطاء (مع حركة الهبوط) حتى يتم عزل الأوفاريولس الفردية أو غرف البيض ومحاذاة عموديا. مزيد من غرف البيض واحدة منفصلة عن طريق إزاحة المراحل غير المرغوب فيها من سلسلة البيض البويضة.
    ملاحظة: تأكد من أن غرف البيض مثار بشكل فردي لا تطفو في النفط، وأنها تلتزم زلة الغطاء. وهذا أمر مهم لكل من الحقن المجهري الناجح والحصول على الصور.

4. الحقن المجهري من MBs في خلايا ممرضة من غرف البيض

  1. إعداد محلول بروميد الميثيل، باستخدام منارة جزيئية واحدة (على سبيل المثال osk2216Cy5)، أو مزيج من اثنين من MBs التي تستهدف mRNAs مختلفة والتي وصفت مع الفلوروروس متميزة طيفيا (على سبيل المثال osk2216Cy5 وdrongo1111Cy3). استخدام تركيز 200-300 نانوغرام / ميكرولتر كل ميغابايت في HybBuffer (50 mM Tris-HCl - درجة الحموضة 7.5، 1.5 مليون متر MgCl2 و 100 مل NaCl). لكوكتيل من أربعة MBs المسمى مع نفس الفلوروفور التي تستهدف نفس mRNA في 200 نانوغرام / ميكرولتر لكل في HybBuffer (على سبيل المثال osk82، osk1236، osk2216). تدور أسفل الحل MB مباشرة قبل تحميل الإبرة للحقن الدقيق.
  2. حدد الهدف. يوصى بوضع هدف زيت يُستحسن بـ 40 مرة لإيجاد غرفة بيض مناسبة ولإجراء الحقن المجهري.
  3. جبل غطاء مع غرفة البيض تشريح على مرحلة المجهر. طرح الهدف في موقف التركيز وتحديد غرفة البيض في مرحلة النمو من منتصف إلى وقت متأخر، التي يتم توجيهها بشكل صحيح للحقن الدقيق (أي، مع محور AàP عمودي على طرف إبرة للسماح للحقن السهل داخل ممرضة الخلية القريبة من البويضة).
  4. تحميل إبرة (التجارية أو أعدت في منزل27)مع ~ 1 كيلوبايت MB الحل (انظر الخطوة 4.1) وتوصيله إلى الحاقن الدقيق. للحقن الدقيقة في غرف البيض الميلانوغاستر D. ، توجيه الإبرة (انظر جدولالمواد) في زاوية <45° إلى مرحلة المجهر (على سبيل المثال 30 درجة) لتجنب ثقب عدة خلايا ممرضة.
  5. إعداد حاقن مع ضغط حقن من 500-1000 هبأ والضغط التعويض من 100-250 هبأ (انظر جدولالمواد).
  6. تتحرك ببطء المرحلة لجلب في مجال عرض منطقة من النفط قطرة فارغة من غرف البيض.
  7. باستخدام عصا التحكم micromanipulator، خفض الإبرة بلطف في قطرة النفط وجلب طرفها في التركيز نحو محيط مجال الرؤية.
  8. أداء وظيفة "نظيفة" لإزالة الهواء من طرف الإبرة وضمان أن هناك تدفق من الإبرة.
  9. جلب الإبرة إلى موقف المنزل والتركيز على غرفة البيض ليتم حقنها microinjected، ثم جلب الإبرة مرة أخرى إلى التركيز ووضعها بالقرب من حافة غرفة البيض.
  10. إجراء تعديل جيد لموقف الهدف Z بحيث الغشاء الذي يفصل خلايا الجريب عن خلايا الممرضة هو في التركيز.
  11. إدراج الإبرة في خلية ممرضة وإجراء حقن لمدة 2-5 s.
  12. قم بإزالة الإبرة برفق وسحبه إلى موضع المنزل.
  13. تغيير الهدف إلى التكبير المطلوب للحصول على صورة (60-63x أو 100x)، والتركيز على غرفة البيض، والبدء في اكتساب.

5. الحصول على البيانات باستخدام قرص الغزل الإعداد المجهر البؤري

ملاحظة: راجع جدول المواد لإعدادنا المحدد.

  1. إعداد بروتوكول الاكتساب لتسجيل مكدس XYZCt من الصور 8-16 بت (XYZ = وحدة التخزين، C = قناة، t = الوقت).
  2. حدد خطوط الليزر للقنوات المطلوبة (على سبيل المثال 641 نانومتر ليزر لCy5 و 491 نانومتر لGFP) والحصول على القنوات بالتتابع: أولا إشارة الفلورة في كل قناة ومن ثم تغيير موقف Z، للسماح لتحليل التعريب السليم.
  3. حدد الخطوة Z (على سبيل المثال 0.3 ميكرومتر)، وحدود Z العلوي ة والسفلية (علىسبيل المثال -2 ميكرومتر إلى 2 ميكرومتر).
  4. إدخال وقت الاقتناء ومعدل أخذ العينات (على سبيل المثال كل 15-30 ق لمدة تصل إلى 1 ساعة).
  5. بدء الاستحواذ.

6. المعالجة وتحليل البيانات للحصول على معلومات التتبع والتعريب، وإعداد ملفات الفيديو

  1. معالجة الصور
    1. تحميل، فك، وفتح Icy، منصة المجتمع مفتوحة للمعلوماتية الصور الحيوية (http://icy.bioimageanalysis.org/)
    2. افتح مكدس XYZCt الذي تم الحصول عليه في الخطوة 5: صورة/تسلسل >ملف>فتح.
    3. تحويل المكدس إلى ImageJ: ImageJ> أدوات> تحويل إلى IJ، لديك وضع منفصل ON.
    4. إنشاء كومة فرعية (مجموعة من الخطوات Z والنقاط الزمنية التي سيتم تحليلها بشكل أكبر): ImageJ>Image>مكدسات>أدوات>جعل المكدس الفرعي...; حدد القنوات المطلوبة وخطوات Z والنقاط الزمنية.
    5. حفظ المكدس الفرعي كملف TIFF: ImageJ>ملف>حفظ باسم>Tiff...; استخدام هذا الملف للخطوات اللاحقة.
    6. تقسيم القنوات: ImageJ>صورة>اللون>قنوات سبليت.
    7. طرح الخلفية إما باستخدام كومة الخلفية: ImageJ>Process>آلة حاسبة الصورة...، أو باستخدام خيار الكرة المتداول: ImageJ>Process>طرح الخلفية...، حدد دائرة نصف قطرها الكرة المتداول. معاينة الصورة لنصف القطر المحدد قبل تحديد "قبول".
      ملاحظة: سوف تنشأ إشارة الخلفية أساسا من التبريد غير السليم للفلوروروفور. غالبًا ما تُستخدم نسبة الإشارة:الخلفية (S:B) كمؤشر لـ "سطوع" MB، ويتم قياسها من تجارب التهجين في المختبر لـ MB وDNA target oligonucleotide. على سبيل المثال، Osk1236 و osk2216 S:B من ~ 81 و ~ 120، على التوالي.
    8. اضبط السطوع والتباين لكل قناة: ImageJ>Image>Adjust>السطوع/التباين، وحدد تطبيق.
    9. حفظ كل قناة كملف TIFF منفصل: ImageJ>ملف>حفظ باسم>Tiff....
    10. دمج القناتين: ImageJ>صورة>اللون>دمج القنوات...; حدد القنوات. حفظ المكدس الجديد كملف TIFF جديد (راجع الخطوة 6.1.8).
  2. الكشف عن البقعة وتتبعها
    1. تحول مرة أخرى إلى الجليدية: ImageJ>أدوات>تحويل إلى الجليدية.
    2. شريط مقياس هو تلقائيا متراكبة على المكدس عند التحويل إلى الجليدية، إذا تم تثبيت البرنامج المساعد شريط مقياس [البحث باستخدام الإضافات>الإعداد>البرنامج المساعد على الانترنت]. إذا لزم الأمر، قم بتحرير شريط المقياس عبر نافذة المفتش (الجانب الأيمن من الشاشة)>علامة تبويب الطبقة>الاسم>شريط المقياس.
    3. قم بإلغاء تحديد/إلغاء تنشيط رمز "العين" لشريط المقياس من علامة التبويب طبقة>اسم لإزالة شريط المقياس من المكدس الأصلي. يمكن إعادة تنشيطه على المكدس النهائي.
    4. حفظ المكدس التي تمت معالجتها حديثا عن طريق أخذ لقطة شاشة باستخدام رمز "الكاميرا" من شريط القوائم في نافذة الصورة، "خذ لقطة من العرض الحالي" وملف>حفظ باسم>Tiff....
    5. تحديد حساسية موضعية، إذا تم بالفعل تحديد معلمات حساسية موضعية الانتقال إلى الخطوة 6.2.7.
    6. الكشف عن البقع: حدد النافذة مع الصورة أو المكدس لتحليلها، الكشف والتتبع>الكشف> الكشف عن بقعة، وملء المعلمات إعدادات:
      1. للإدخال، حدد "currentSequenceInputDetection" (افتراضي).
      2. بالنسبة للمعالجة المسبقة، حدد "القناة 0" (افتراضي)، أو القناة المطلوبة عن طريق الإسناد الترافقي للرقم في نافذة المفتش>علامة التبويب تسلسل.
      3. للكشف عن، حدد "الكشف عن بقعة مشرقة على خلفية مظلمة؛" استخدام "استخدام القوة من Wavelets 2D ل3D" فقط إذا لم يكن هناك ما يكفي من Z-شرائح في المداخن لإجراء التحليل. حدد "مقياس (مقاييس)" و"حساسية" لكل مقياس (أضف المزيد من المقاييس للبقع الأكبر). المقياس والحساسية (أكبر عدد أكثر حساسية هو الكشف، واقترح الحد الأقصى من 140 من قبل الجليدية) هي متغيرات التجربة والخطأ، التي يجب فحصها بصريا بعد ذلك والبت فيها.
      4. بالنسبة لمنطقة الاهتمام، استخدم "ROIfromSequence" (افتراضي).
      5. للتصفية، استخدم "NoFiltering" (افتراضي)، أو حدد "SizeFiltering" لتعريف "نطاق الكائنات المقبولة (بالبكسل)".
      6. الإخراج: حدد إعداد إخراج XLS أو XML (حدد تنسيق XML عند استخدام 2007 MS Excel أو إصدار سابق وهناك >65,000 نقطة). إذا تم استخدام نتائج الكشف عن بقعة لتحليل تتبع، حدد أيضا "تصدير إلى حمام السباحة".
      7. تكرار الكشف عن البقع باستخدام قيم مختلفة للمقياس/الحساسية حتى يتم الكشف عن جميع أو معظم البقع. تسجيل كافة المعلمات النهائية.
      8. لتحليل التعريب المشترك، كرر الكشف الموضعي للقناة الأخرى.
    7. لتعقب المواقع، حدد الكشف والتتبع>التتبع>تتبع البقعة>تشغيل كاشف البقعة مع المعلمات من الخطوة 6.2.6.، أو استخدم "تحديد نتائج الكشف هنا" القائمة المنسدلة لتحديد مجموعة بيانات موجودة (لهذا، حافظ على نافذة الكشف الموضعي فتح من الخطوة 6.2.5). اضغط على زر "تقدير المعلمات" وحدد الحركة المستهدفة المطلوبة في النافذة المنبثقة لتقدير المعلمات (على سبيل المثال "هو على حد سواء غير مُجمَّع وموجه"). اضغط على زر "تشغيل التتبع".
    8. كرر الكشف عن البقعة والتعقب للقنوات الأخرى عند تعقب بقع مكدسات متعددة القنوات، باتباع الخطوتين 6.2.6 و 6.2.7، بدءاً من المكدس الذي تم إنشاؤه من الخطوة 6.2.7.
    9. لتصور المسارات، حدد الكشف والتتبع>التتبع>مدير التتبع - يتم فتح هذه النافذة تلقائيًا عند الانتهاء من تشغيل التتبع. بالنسبة لـ "معالج مسار الألوان"، حدد "تمكين" واختر التمثيل المطلوب للون للمسارات. يمكن الوصول إلى معالجات المسار ذات الصلة عبر "إضافة معالج المسار..." قائمة منسحبة لأسفل (على سبيل المثال، حدد "تعقب مقطع وقت المعالج"، وتمكين نافذة "تعقب المقص"، واختيار العدد المطلوب من عمليات الكشف ليتم عرضها قبل وبعد نقطة الوقت الحالية.)
    10. حفظ معلومات المسارات كملف تتبع XML: الكشف والتعقب>التتبع>إدارة التتبع>ملف>حفظ باسم ....
    11. حفظ النتائج عن طريق التقاط لقطة شاشة باستخدام رمز "الكاميرا" من شريط القوائم في نافذة الصورة، "خذ لقطة شاشة من العرض الحالي". يمكن أخذ لقطات الشاشة مع البقع المكتشفة و / أو المسارات ببساطة عن طريق تفعيل / تعطيل رمز (رموز) العين المقابلة الموجودة في نافذة المفتش>علامة تبويب طبقة>الاسم>تراكب المجمع.
    12. تثبيت البرنامج المساعد تراكب الطابع الزمني: الإضافات>الإعداد>البرنامج المساعد على الانترنت>تراكب الطابع الزمني>تثبيت.
    13. إضافة الطابع الزمني: الإضافات>تراكب الطابع الزمني (جديد). اتبع الإرشادات الموجودة على النافذة المنبثقة (الركن الأيمن السفلي من الشاشة) للحصول على إرشادات حول وضع الطابع الزمني وتنسيقه. يمكن إضافة/تغيير الفاصل الزمني في إطار المفتش>علامة التبويب تسلسل>خصائص التسلسل>تحرير.
    14. حفظ النتائج عن طريق أخذ لقطة شاشة أخرى. حفظ الصورة كما 1) تنسيق Tiff، و 2) كتنسيق AVI؛ لتنسيق AVI أولا تحويل إلى تقديم RGB (صورة / تسلسل>تقديم>صورة RGB).
    15. تدوير الصورة إلى الاتجاه المطلوب: نافذة المفتش>علامة تبويب التسلسل>Canvas>استدارة.
    16. حفظ الصورة التي تمت استدارة عن طريق "خذ لقطة من طريقة العرض الحالية". تأكد من إلغاء تحديد رمز "العين" لشريط المقياس، حيث سيتم تدويره أيضًا مع الصورة.
    17. اختر عائد الاستثمار وحصّله: حدد منطقة الاهتمام>عائد استثمار 2D>اختر شكل عائد الاستثمار ثم قم بإنشاء/سحب عائد الاستثمار على الصورة؛ صورة / تسلسل> مستوى (XY)> محصول سريع.
  3. تحليل التعريب المشترك
    1. إعداد بروتوكول للتوطين المشترك؛ وترد عدة أمثلة على الموقع الجليدي (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List) (انظر الموادالتكميلية ).
    2. تحميل بروتوكول التعريب: أدوات>برمجة نصية>بروتوكولات>تحميل، وضبط المعلمات في كتل التفاعل (على سبيل المثال في معلمات استخدام كتلة "الكشف عن الموجات" المحددة في الخطوة 6.2.6.).
    3. قياس حجم الجسيمات بالبكسل، وتحديد مسافة التعريب المشترك وإدخالها في كتلة "Colocalizer" كمسافة "الحد الأقصى".
      ملاحظة: يعتمد حجم الجسيمات بالبكسل على نظام الكشف. لقياس الحجم، قم بالتكبير إلى جسيم واحد وعد البيكسلات التي تمتد عرض الإشارة عبرها يدويًا. متوسط القياسات من ثلاثة جزيئات على الأقل. المسافة القصوى التي سيتم تعيينها للتوطين المشترك هي حجم الجسيمات بالبكسل (وهذا يمثل الحد الأقصى لمجموع نصف قطر اثنين من الجسيمات التي تلامس).
    4. إذا رغبت في ذلك، حدد عائد استثمار واحد أو أكثر لتحليل التعريب المشترك: منطقة الاهتمام>عائد الاستثمار 2D>اختر شكل عائد الاستثمار>رسم عائد الاستثمار على الصورة.
    5. عائد الاستثمار(المحاصيل): صورة/تسلسل>المستوى (XY)>المحاصيل السريعة.
    6. إجراء الترجمة المشتركة: إطار محرر البروتوكولات>علامة تبويب البروتوكول المختارة>تشغيل. ستحتوي الكتلة النهائية في إطار محرر البروتوكولات على النسبة المئوية الإجمالية للتوطين المشترك استناداً إلى الكشف الموضعي، بينما يمكن العثور على المعلومات في كل نقطة زمنية في إطار المفتش> علامة التبويب إخراج.
    7. تتبع الجسيمات المشتركة والمفردة باتباع الخطوة 6.2.7 (بقع المسار).
    8. حفظ كما هو موضح في الخطوة 6.2.16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام PinMol،يمكن تصميم العديد من MBs لهدف واحد mRNA (الشكل 1B-C). بعد التوليف والتنقية، تتميز MBs المختارة وتقارن باستخدام التحليل في المختبر.

Figure 1
الشكل 1: وصف التقنية والأنسجة لتصوير الخلايا الحية من mRNAs الذاتية. (أ) تصوير غرفة بيض دروسوفيلا في منتصف المرحلة المستخدمة للحقن الدقيق. إبرة الحقن المجهري (الأخضر) يسلم كوكتيل من المنارات الجزيئية محددة لأوسكار ميرنا. حقن سريع في خلية ممرضة تمكن من الكشف عن mRNAs في العبور إلى البويضة، فضلا عن التصور من mRNA المترجمة بالفعل في القشرة الخلفية. (ب) إنتاج برنامج PinMol من ترتيب المنارة الجزيئية لاستهداف أوسكار ميرنا (C) منطقة الهيكل الثانوي داخل أوسكار ميرنا المستهدفة من قبل منارة الجزيئية. (C') تسلسل وقابلة للطي من منارة الجزيئية أوسكارمحددة، osk2216. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد تأكيد الأداء الأمثل لـ MBs عن طريق التوصيف في المختبر، يتم استخدام المسبارات للتصور الحي للهدف المحلي mRNA(s). فمن الممكن لتصور أنماط النقل وتوطين أوسكار mRNA في مراحل مختلفة من oogenesis، وعلى وجه الخصوص في وبعد منتصف oogenesis (7-10) (الشكل 2A-B). بسبب صغر حجمها ، من الصعب حقن غرف البيض في المراحل المبكرة جدا (1-4). عندما حقن بشكل فردي في نفس غرف البيض المرحلة، Oskarمحددة MBs تقديم نفس أنماط التعريب (الشكل2،osk1236 مقابل osk2216).

Figure 2
الشكل 2: التسلسل الزمني لـ oskar mRNA في غرفة البيض البرية في t = 0 و 10 و 30 دقيقة من الوقت، بعد بدء الاكتساب. حقن الخلايا الممرضة من اثنين من منارات الجزيئية الخاصة أوسكار(osk1236 و osk2216) في (أ) المرحلة 6-7 غرف البيض و (ب) المرحلة 9 غرف البيض. شريط مقياس = 20 درجة.

يمكن تصور أهداف مختلفة من الميرنا باستخدام MBs (الشكل 3) المميز ة الطيفية الفلورية (الشكل3). يمكن حقن محلول MB في خلية ممرضة (الشكل3A)أو في البويضة (الشكل3B). سوف تنتشر الـ MBs التي يتم حقنها في السيتوبلازم في خلية ممرضة بحرية في خلايا الممرضة الأخرى وكذلك في البويضة، وبالتالي فهي قادرة على العثور على هدفها وتوليد إشارة الفلورة في مواقع أخرى غير موقع الحقن المجهري. على سبيل المثال، عند إجراء الحقن المجهري في خلية ممرضة من مرحلة أوجينيسيس في وقت متأخر (9-10) غرفة البيض، يتم إنشاء معظم إشارة الفلورة تصور داخل البويضة من قبل mRNA أوسكار المترجمة بالفعل، وأقل من خلال نقلها بنشاط النصوص، والتي هي أكثر انتشارا في المراحل المبكرة (7-8). لاحظ أن MBs الكلاسيكية سوف تؤدي إلى إشارة غير محددة داخل النوى، وبالتالي قصر التحليل على المناطق السيتوبلازمية من غرفة البيض. وقد استخدمت تعديلات إضافية، مثل NeutrAvidin أو الجسيمات النانوية الذهب، للحد من أو القضاء على هذه الإشارة غير محددة28،29. على الرغم من هذه الإشارة النووية غير محددة، تم تحديد خصوصية MBs للكشف في الجسم الحي من uskar mRNA باستخدام نهج فريت 8، وMB الحقن المشترك مع في المختبر المنقولة oskar mRNA وصفت مع فلوروفور الطيفية متميزة عن تسمية MB23.

Figure 3
الشكل 3: التصور المشترك لنوعين من أنواع الميرنا في غرف البيض الحية. الحقن المشتركة من أوسكار- وdrongoمحددة مناراتالجزيئية في (أ) خلية ممرضة و (ب) البويضة من المرحلة 8-9 غرف البيض. محمد الدوسري (أحمر) وdrongo (الأخضر) mRNAs colocalize في الطرف الخلفي من البويضة (أستريكس)، وdrongo يظهر أيضا تراكم الظهر ية أمامية (رأس السهم). شريط مقياس = 20 درجة.

بالنسبة لأهداف mRNA التي تظهر مستويات التعبير المنخفضة، يتم زيادة إشارة الفلورة لكل جزيء mRNA عن طريق حقن محلول كوكتيل يحتوي على اثنين على الأقل من MBs، كل ملزمة لمختلف المناطق المستهدفة(الشكلين 4 و5).

Figure 4
الشكل 4: تصور الـ oskar mRNA مع كل من MBs ونظام MS2-GFP. الحقن المجهرية من محلول كوكتيل MB (MB) في غرفة البيض التعبير عن osk-MS2::MCP-GFP30 (GFP). بعد الحقن المجهري لخلية ممرضة، تم الحصول على الصور كل 30 ق لمدة 20 دقيقة. وتم اختيار منطقتين من مناطق الاهتمام، واحدة من رواه الفائدة في خلية ممرضة وواحدة في البويضة. تم استخدام حساسية مختلفة لكل عائد استثمار للكشف عن البقع. خلية ممرضة عائد الاستثمار: مقياس 2، حساسية 100 لGFP وMB. روي البويضة: مقياس 2، حساسية 50 لGFP و 110 لMB. مسافة التعريب المشترك هي 4 بكسل لكل من ROIs. يتم عرض غرفة البيض بأكملها والتكبير في خلية ممرضة في نقطة زمنية 12 دقيقة، ويظهر التكبير في البويضة في نقطة زمنية 14 دقيقة. تحدد بقع MB (الدوائر الحمراء) وبقع GFP (الدوائر الخضراء) جزيئات الأوسكار ميرنا التي تم اكتشافها من قبل كل نهج، وتشير الجسيمات المترجمة (الصفراء) إلى مكان وجود بقع MB وGFP على الأكثر 4 بكسل. XY-التوقعات من 14 Z شرائح البصرية في 0.3 درجة مئوية الخطوات. تم الحصول عليها كبيانات 16 بت مع هدف 63x (النفط، NA = 1.4)، XY = 0.24 ميكرومتر، وقت التعرض 500 مللي ثانية، في 5.23 و 5.39 مللي واط قوة الليزر ل641 نانومتر و 491 نانومتر ليزر، على التوالي. شريط مقياس = 10 درجة.

Figure 5
الشكل 5: تحليل التتبع في البويضة، بعد الحقن المجهري للخلايا الممرضة مع MBs الخاصة بـ oskar mRNA. تم الكشف عن جزيئات الميغابايت في المقياس 2 مع الحساسية 110، وتظهر 8 نقاط زمنية قبل/بعد الإطار الزمني الحالي. يتم تتبع بقع MB (الدوائر الحمراء) في حجم البويضة. المسارات تمثل معلومات الكشف من 8 نقاط زمنية قبل / بعد نقطة زمنية 12 دقيقة. يمثل كل لون مسارًا فرديًا. XY-التوقعات من 14 Z شرائح البصرية في 0.3 درجة مئوية الخطوات. شريط مقياس = 10 درجة.

عند مقارنة الاتجار بـ oskar mRNA كما تم اكتشافه مع MBs مقابل MS2/MCP، فإن إشارة الفلورة التي تولدها أجهزة MBs الخاصة بـ oskarوثائق بأمانة حول نقل وتوطين الـ oskar mRNA المعدلة وراثياً التي تحمل علامة GFP 10 الجزيئات عن طريق نظام MS2/MCP (الشكل 4). في غرف البيض المعدلة وراثيا oskar-MS2/MCP-GFP في منتصف oogenesis، أظهر تحليل بيانات الاقتناء التوطين المكثف بين إشارات الفلورسنت من أوسكارالمهندسة وراثيا -MS2 mRNA الكشف عنها باستخدام MBs ووضع العلامات GFP . في 12 و 14 دقيقة بعد الحقن، 57٪ (7 كائنات MB و 13 كائنات GFP، مع 4 كائنات مترجمة) و 93٪ (30 كائنات MB و 51 كائنات GFP، مع 28 كائنات مشتركة) من جزيئات MB المكتشفة التي تم توطينها مع جزيئات GFP في خلايا الممرضة والبويضة، التوالي. ينتج تحليلنا 31٪ و 55٪ نسب التوطين المشترك من أوسكار-MS2 mRNA مع أوسكار mRNA الكشف عنها مع MBs داخل السيتوبلازم من خلية ممرضة والبويضة، على التوالي. وعلاوة على ذلك، يمكن تحليل أكوام 5D لمزيد من الأبعاد لتحديد مسارات الـ oskar mRNA للنقللمسافات طويلة في كل من خلية الممرضة والخلايا السيوتلازم (الشكل 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعتمد التصور المباشر للاتجار بالحمض النووي الريبي المحلي في غرف البيض Drosophila على استخدام MBs محددة وفعالة ومقاومة للنوكل، والتي يمكن الآن تصميمها بسهولة مع برنامج PinMol. MBs هي تحقيقات محددة مصممة للكشف عن تسلسل فريد ة داخل mRNA الهدف (ويفضل المناطق خالية من الهيكل الثانوي)، مما يجعل من الممكن الكشف عن حل كبير للنسخة. القيد الوحيد عند اعتماد هذه التقنية / بروتوكول لأنواع الأنسجة /الخلايا الأخرى هو كفاءة تسليم MB للعينة ذات الفائدة. في حين أن النهج الأخرى تتطلب التلاعب الوراثي للأنسجة للتعبير عن aptamer وبروتين ملزم الحمض النووي الريبي الموسومة بروتين الفلورسنت لتصور هدف واحد mRNA (على سبيل المثال MS2 / MCP النظام)، تعدد الإرسال ممكن ل، على الأكثر، نسختين. تكنولوجيا بروميد الميثيل تقف وحدها للكشف عن mRNAs الذاتية في الخلايا الحية، وهي التقنية الوحيدة التي تسمح بالتصور المشترك لأكثر من نوعين من أنواع mRNA.

يمكن تسمية MBs مع مجموعة واسعة من moieties الفلورسنت ومستقرة داخل البيئة الخلوية عند توليفها من النيوكليوتيدات المعدلة مثل 2'-O-methylribonucleotides أو الأحماض النووية المقفلة26،31. كما أن هذه التعديلات في العمود الفقري تزيد من تقارب الـ MBs مع هدفها. ويمكن تصميم العديد من الـ MBs بسهولة لـ mRNAs المستهدفة من متوسط الطول. ومع ذلك، قد تواجه بعض القيود لأهداف قصيرة و/أو عالية التنظيم. ويمكن التغلب على ذلك من خلال اعتماد مناراتنا الجزيئية الصغيرة، والتي تبلغ منطقة المسبار من أجلها ما يقرب من نصف طول مسبار MB الكلاسيكي31. اعتمادا على نوع العينة، يتم تسليم MBs في الخلايا عن طريق الكهربائي، وربط الببتيدات اختراق الخلايا، lipofection، أو الحقن المجهري23،32،33،34. تعتمد كفاءة أداء MB في تجارب التصوير بالخلايا الحية على قدرة تسلسل المسبار على التهجين إلى التسلسل التكميلي المقابل داخل هدف mRNA، والذي يتم تحديده بواسطة الهيكل المستهدف. الهيكل الثانوي المتوقع لـ MFE RNA الذي تم الحصول عليه باستخدام معلمات الديناميكا الحرارية المقاسة بالمختبر هي قيمة في تقييم إمكانية الوصول إلى الهدف، ولكن في نهاية المطاف هو هيكل الهدف في الجسم الحي والتفاعل المستهدف مع الخلايا الأخرى العوامل التي ستحدد ملاءمة MB لتصوير الخلايا الحية. تحليل على نطاق الجينوم من الهيكل الثانوي RNA يشير إلى أن العديد من RNAs هي أقل تنظيما في الجسم الحي مما كانت عليه في المختبر35. على الرغم من أن كفاءة الكشف عن الأهداف في الجسم الحي باستخدام MBs تعتمد بشكل رئيسي على إمكانية الوصول إلى موقع الربط، فإن تحسين بعض ميزات MB سيضمن تصورًا محسّنًا لهدف mRNA. على وجه التحديد، ينبغي إجراء اختيار دقيق من المعلمات التالية: 1) يمكن أن يتراوح طول المسبار بين 18 و 26، بحيث يكون تكوين النيوكليوتيد اتّبع المسبار بين 31 و55% أزواج GC في الهدف: MB hybrid، 2) ينبغي أن يكون التسلسل الجذعي 5 bp G/C الغنية، للحفاظ على شكل دبوس الشعر في غياب الهدف mRNA وتوفير التمييز عدم التطابق، 3) يجب استخدام العمود الفقري المعدلة للحماية من nucleases من كل من MB والهدف: MB الهجين، 4) يمكن أن يقدم زوج فلوروفور / quencher إضافية استقرار متواضع إلى الجذعية MB، و 5) يجب أن تكون مستقرة الفلوروفور خلال فترات زمنية التصوير الطويل. وبالإضافة إلى ذلك، عادة ما تولد MBs الكلاسيكية إشارة غير محددة النووية34، والتي في حالتنا تؤثر بشكل معتدل فقط على معالجة البيانات وتحليلها. ومع ذلك، بالنسبة لتصور الاتجار بالحمض النووي الريبي على المستوى الخلوي، قد تصبح هذه الإشارة غير المحددة إشكالية. وقد اقترحت عدة مجموعات تعديلات أو علامات، مثل tRNA، الببتيدات والجسيمات النانوية، والتي تمنع تسليم MBs في النواة وبالتالي القضاء على هذه الإشارة غير محددة ممكن33،36.

وكان أكبر عيب في هذا النهج هو التصميم اليدوي لMBs لتصوير الخلايا الحية. لمعالجة هذا، لقد كتبنا برنامج يستندإلى بيثون (PinMol) التي تحدد بسهولة المواقع المستهدفة التي يمكن الوصول إليها داخل mRNA من خلال النظر في الهياكل الثانوية دون المستوى الأمثل بالإضافة إلى MFE، فضلا عن تصاميم تحقيقات دبوس الشعر، والتي هي أفضل مناسبة للكشف عن mRNAs في الخلايا الحية24. يستخدم PinMol المعلومات الهيكلية من الهياكل الثانوية للRNA الهدف المتوقع من خلال نهج تقليل الطاقة، وعن طريق إدراج المعلومات من الهياكل دون المستوى الأمثل، ومرونة أو صلابة مناطق مستهدفة محددة هو تقييم عند تصميم MBs. وهو يأخذ في الاعتبار إمكانية الوصول إلى المناطق المستهدفة، فضلا عن التفاعلات بين وداخل الجزيئية لكل مسبار مختار. بالإضافة إلى ذلك، لا ينبغي اعتبار الامتدادات المنظمة للغاية من الحمض النووي الريبي (مثل مواقع الربط للميكروRNAs أو البروتينات الملزمة بالحمض النووي الريبي) مواقع مستهدفة عند اختيار المسبارات، لأن هذه المناطق قد تؤدي إلى ربط غير فعال لـ MBs. يمكن للمستخدم تقييم وإزالة التحقيقات التي تستهدف هذه المواقع، أو تقييد المنطقة المستهدفة المستخدمة من قبل PinMol لتصميم تحقيقات بحيث لا تشمل مثل هذه المواقع. وقد أظهرت القدرة النسبية لPinMol من خلال مقارنة ترتيب PinMol تصميم MBs مع النتائج التجريبية من MBs مصممة يدويا24. واختار بينمول وصمم مركبات MBs للمناطق المستهدفة المماثلة، فضلاً عن تحديد مواقع جديدة يمكن الوصول إليها على الحمض النووي الريبي. وهذا أمر ضروري للكشف عن النصوص رقم نسخة منخفضة حيث يجب زيادة إشارة الفلورسنت فوق الخلفية. من خلال زيادة أعداد بروميد الميثيل التي تتهجّى بشكل فعال إلى العديد من المواقع التي يمكن الوصول إليها على mRNA الهدف، يمكن تحقيق تضخيم إشارة. ولذلك، فإن هذا البرنامج يسهل نهجا سريعا لتصميم MBs متعددة لكل mRNA الهدف، وتصور في وقت واحد العديد من mRNAs في خلية حية.

من أجل تحقيق جودة عالية 5D (XYZCt) الحصول على البيانات من mRNAs المنقولة داخل غرفة البيض، تشريح السليم من غرف البيض الفردية والحقن المجهري الفعال في خلايا ممرضة أمر بالغ الأهمية. بالنسبة للدراسات خلال المراحل المبكرة من التطور، يمكن أن يكون الحقن الدقيق ضارًا بصلاحية غرفة البيض، وبالتالي يتم تقصير طول تجربة تصوير الخلايا الحية (<20 دقيقة). ويمكن ضمان زيادة معدل نجاح تجارب الحقن المجهري باستخدام الإبر فائقة الدقة المتاحة تجاريا. بالإضافة إلى ذلك، من المهم الإعداد السريع لإعدادات الاكتساب بحيث يمكن التقاط نقاط وقت ما بعد الحقن المبكرة. نوعية الكشف عن بقعة وتتبع البيانات لن تكون جيدة إلا مثل نوعية الصور التي تم الحصول عليها.

وعند الحصول على الصور، من الضروري أيضا استكمال خطوات التحليل اللاحقة بعناية ودقة. وعلى الرغم من أن المعالجة والتحليل بعد الاقتناء يوفران مجموعة من الصعوبات الخاصة بها، يمكن تبسيطهما باختيار البرمجيات المناسبة لتجربة أو عينة معينة. وتشمل البرامج الحالية القائمة فولوسيتي (بيركينإلمر)، إيماريس (Bitplane)، ImageJ / فيجي والجليدية37. من بين الثلاثة، تقدم Icy العديد من الفوائد، حيث أنها منصة مجتمعية مفتوحة تسمح، سواء، بالمعالجة (عن طريق ImageJ) وتحليل بيانات التصوير. هنا نقوم بوصف الخطوات اللازمة لمعالجة وتحليل بيانات التصوير الحمض النووي الريبي بكفاءة باستخدام Icy. نتائجنا هي ممثلة للبيانات التي تم الحصول عليها من خلال المشاركة في تصور نوعين من الحمض النووي الريبي في غرفة البيض كله وتتبع mRNA عن طريق تكنولوجيا MB ونظام MS2/MCP.

توفر معالجة ما بعد الاكتساب مع البرامج الجليدية مرونة المستخدم في معالجة الصور (مثل السطوع والتباين) والتحليل (مثل إعدادات العتبات/التخفيضات لحساسية الكشف عن جزيئات الفلورسنت كبقع) . كما تمكّن Icy المعلمات ذات الصلة بالتحكم داخل كل كتلة من تشغيل محرر البروتوكولات (على سبيل المثال تحديد مسافة التعريب المشترك واستخدامها كـ "مسافة قصوى" في كتلة "Colocalizer"). يتم تحديث البرامج الجليدية عند الإطلاق، ولها دعم موثوق به عبر الإنترنت لاستكشاف أي مشاكل وإصلاحها. تم تصميم البروتوكول الموصوف للكشف عن الأوسترم ميرنا وتم الحصول على النتائج التمثيلية باستخدام المعلمات الأمثل لنوع الجسيمات mRNA ليتم الكشف عنها وتتبعها. على سبيل المثال، أوسكار ميرنا هو نسخة وفيرة التي يتم نقلها في الغالب خلال المراحل المتوسطة من الأوجينيسيس، وذلك باستخدام شبكة microtubule وترتبط ديناميكيا مع عوامل البروتين المختلفة في جميع أنحاء تطور البويضة. أبلغنا سابقا أن أوسكار mRNP يخضع لإعادة عرض واسعة النطاق أثناء النقل من خلايا الممرضة في البويضة23. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا، باستخدام الـ MBs، نميز الخصائص الزمنية والمكانية للاتجار بالحمض النووي الريبي أوسكار، ووجدنا أنه يمكن دمج مئات النسخ من نسخ الأوسكار لتشكيل برامج كبيرة لـ oskar mRNPs.

ويمكن أيضا إجراء تحليل ما بعد الاقتناء للتوطين المشترك والتتبع باستخدام برامج ياتى أخرى مثل إيماريس وإيمج جيه/فيجي وفولوسيتي. وقد تم اختيار الجليدية لقدرتها على عتبة والتعليق جزيئات الفلورسنت مع حساسية عالية وقدرات تتبع. هنا، ونحن نصف التعريب القائم على الكائن، ولكن التعريب المشترك، وإن كان من دون تتبع، يمكن أيضا أن تكون كمية من خلال تحديد التداخل ودرجة التعريب باستخدام تحليل PCC (كوستس) باستخدام الإضافات الجليدية وImageJ (استوديو التعريب المشترك، JACoP) 38 , 39.

في المستقبل، من المرغوب فيه بروتوكول التصوير الأمثل على المدى الطويل لضمان البقاء على قيد الحياة غرفة البيض الموسعة. ومن شأن ذلك أن يوفر اكتسابا أطول من أجل تحليل البيانات المتعلقة بدراسات الاتجار بعيد المدى التي تُعنى بالاتجار بالحمض النووي الريبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.

Acknowledgments

نشكر سلفاتوري أ. إ. ماتراس (مركز معهد بحوث الصحة العامة، جامعة روتجرز) على تركيب ووسم وتنقية منارات جزيئية، ودانيال سانت جونستون (معهد غوردون، جامعة كامبريدج) على أوسكار-MS2/ MCP-GFP الأسهم ذبابة المعدلة وراثيا. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جائزة المؤسسة الوطنية للعلوم الوظيفي 1149738 وجائزة مؤتمر الموظفين الفنيين - CUNY إلى DPB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrofluorometer Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon n/a Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette Fireflysci (former Precision Cells Inc.) 701MFL
Dumont #5 tweezer World Precision Instruments 501985 Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm VWR 48393-048
Dissecting microscope Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad Genesee Scienific 59-114
Tris-HCL pH 7.5 Sigma-Aldrich 1185-53-1
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 7791-18-6
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Spinning disc confocal microscope Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera Hamamatsu n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator Eppendorf Inc. 920000037
FemtoJet Microinjector Eppendorf Inc. 920010504
Injection needle: Femtotips II Eppendorf Inc. 930000043
Loading tip: 20 μL Microloader Eppendorf Inc. 930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm VWR 48393-026; 48393-172
Dry yeast Any grocery store n/a
Computer, > 20 GB RAM Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).
  3. Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. Current techniques for visualizing RNA in cells. F1000Research. 5, (2016).
  4. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
  5. Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  6. Garcia, J. F., Parker, R. MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system. RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).
  7. Bratu, D. P. Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells. Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).
  8. Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).
  9. Tyagi, S., Kramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).
  10. Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
  11. Liu, Y., et al. Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).
  12. Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).
  13. Ko, H. Y., et al. A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis. Scientific Reports. 4, 4626 (2014).
  14. Vet, J. A., et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).
  15. Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).
  16. Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).
  17. Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells. Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).
  18. Ban, K., et al. Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4. Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).
  19. Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples. BMC Microbiology. 9, 97 (2009).
  20. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
  21. Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
  22. Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein. Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).
  23. Mhlanga, M. M., et al. In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte. PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).
  24. Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs. bioRxiv. , (2018).
  25. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).
  26. Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection. Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).
  27. Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).
  28. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  29. Jackson, S. R., et al. Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells. Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).
  30. Zimyanin, V. L., et al. In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization. Cell. 134 (5), 843-853 (2008).
  31. Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells. ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).
  32. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).
  33. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).
  34. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).
  35. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).
  36. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
  37. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  38. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
  39. Trcek, T., et al. Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters. Nature Commununications. 6, 7962 (2015).

Tags

علم الأحياء العدد 148 منارة الجزيئية التصوير بالخلايا الحية التصور mRNA الذاتية الاتجار mRNA دروسوفيلا melanogaster غرفة البيض غرفة البيض حقن دقيق التوطين المشترك تتبع الجسيمات.
تصور وتتبع mRNAs الذاتية في غرف البيض <em>الحية Drosophila الميلانوجاستر</em> البيض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar,… More

Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers. J. Vis. Exp. (148), e58545, doi:10.3791/58545 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter