Summary
אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את רמת הביטוי של מחזורי microRNA (miRNAs) בדגימות הפלסמה של חולי סרטן. בפרט, השתמשנו ערכת זמינים מסחרית עבור מחזור miRNA החילוץ, שעתוק במהופך. לבסוף, ניתחנו את פאנל של 24 miRNAs שנבחר באמצעות לוחות מותאמים אישית בדיקה מראש הבחין בזמן אמת.
Abstract
שם היא הגדלת ההתעניינות ביופסיה נוזלי על אבחון סרטן, פרוגנוזה טיפולית ניטור, יוצרים את הצורך של סמנים ביולוגיים אמין ושימושי עבור הקלינית. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לחלץ, הפוכה לתמלל ולהעריך את רמות הביטוי של מחזורי miRNAs מ דגימות פלסמה של חולים עם סרטן המעי הגס (CRC). מיקרו Rna (miRNAs) הם סוג של אי קידוד RNAs של נוקלאוטידים 18-25 אורך לווסת את הביטוי של גנים היעד ברמת translational, לשחק תפקיד חשוב, כולל זו של הפונקציה pro - ו anti-אנגיוגנזה, physiopathology של איברים שונים. miRNAs יציבים ב נוזלים ביולוגיים כגון סרום, פלזמה, ההופכת אותם במחזור סמנים ביולוגיים לקבלת החלטות אבחון, פרוגנוזה וטיפול בסרטן וניטור אידיאלי. במחזור miRNA החילוץ בוצע באמצעות שיטה מהירה ויעילה הכרוכה האורגני והן מבוססי עמודה מתודולוגיות. עבור miRNA retrotranscription, השתמשנו תהליך רב שלבי ומתחשב פוליאדנילציה 3' ו את מצדו של מתאם-5' של miRNAs בוגרת, ואחריו miRNA אקראיים קדם הגברה. אנו נבחר לוח מותאם אישית 24-miRNA להיבדק ע י כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית), זיהה את הגששים miRNA על מערך לוחות מותאמים אישית. ביצענו לרביעיית-PCR צלחת פועל על מערכת ה-PCR בזמן אמת. משק miRNAs על נירמול נבחרו באמצעות תוכנת GeNorm (פס' 3.2). הנתונים נותחו באמצעות ביטוי חבילת תוכנה (v 1.1), בוצעו ניתוחים סטטיסטיים. השיטה הוכיחה להיות אמין וחזק מבחינה טכנית, יכול להיות שימושי להעריך את רמות סמן דגימות נוזלים כגון פלזמה ו/או סרום.
Introduction
CRC מייצג השלישי מרבה אובחן גידול ממאיר, הגורם הרביעי של מוות מסרטן ברחבי העולם. עד כה, bevacizumab (B), נוגדן חד שבטי נגד כלי הדם-צמיחה אנדותל (VEGF), ו ארביטוקס (C) או וקטיביקס (P), נוגדנים חד-שבטיים נגד גורם הגדילה באפידרמיס קולטן (EGFR), אושרו על טיפול השורה הראשונה בשילוב עם משטרי כימותרפיה (CT).
מוטציות בגנים K-RAS ו- N-ראס הם סמנים שימושי קלינית היחיד המסוגל לזהות חולים נוטים פחות תועלת. לא אנטי-EGFR מבוססי למרות מספר מחקרים שנערכו כדי לחפש סמנים ביולוגיים שאינם חזוי של תגובה ל CT מבוסס-B, עדיין יש חוסר משמעותי של סמים יעיל ואמין לשימוש קליני1.
miRNAs הם קטנים RNAs (18-25 נוקלאוטידים אורך) להסדיר את התרגום של היעד גנים, לשחק תפקיד מכריע בתהליכי physiopathological רבים, כולל מופרה carcinogenesis. מולקולות אלה הן מאוד יציב נוזלים ביולוגיים כגון פלזמה/סרום, שתן, ברוק, ההופכת אותם סמנים ביולוגיים חזקים לשימוש עבור דגימה לא פולשנית2. באמצעות פאנל של miRNAs מעורב מסלול האנגיוגנזה, כיוונו כדי לזהות חדש במחזור סמנים ביולוגיים מסוגל לחזות תוצאה קליניים בחולים עם גרורות CRC (mCRC) מטופלים עם משטר CT מבוסס-B.
ניתחנו את סדרת 52 mCRC חולים שטופלו CT מבוסס-B בתוך multicenter פוטנציאליים אקראי שלב III למשפט "האיטלקי משפט ב מתקדמים סרטן המעי הגס" (ITACa). בפרוטוקול הנוכחי שאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (Comitato e Etico באזור Vasta Istituto Scientifico Romagnolo לכל הלאו סטודיו e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 674 מס) על 19th בספטמבר 2007. כל המטופלים נתנה הסכמה מדעת לפני איסוף דגימת דם. עבור כל מטופל, דגימות דם ורידי שנאספו לפני הטיפול ועל ההערכה הקלינית הראשונה (אחרי 8 שבועות) כדי להעריך את הביטוי miRNA בסיסית וויסות שלה במהלך הטיפול ביחס לתוצאה המטופל.
דרך חיפוש של הספרות, בחרנו miRNAs 21 בקורלציה עם תהליך האנגיוגנזה, אשר ידועים להיות לזיהוי בפלסמה אנושית: p יש-מיר-107, יש-מיר-126-3, p יש-מיר-145-5, p יש-מיר-194-5, יש-מיר-199a - 5p, יש-מיר - 200 ב' - 3p, יש-מיר - 20 ב' - 5p , יש-מיר-21-5 p, יש-מיר-210-3 p, יש-מיר-221-3 p, יש-מיר-24-3 p, p יש-מיר-27האוויר - 3p, יש-מיר-29b - 3p, יש-מיר-335-5, p יש-מיר-424-5, p יש-מיר-497-5, p יש-מיר - 520d - 3p, יש-מיר-92a - 3p, יש-מיר-17-5 ו p יש-מיר-155-5. בחרנו גם יש-מיר-223-3 p וטיהרו יש-מיר-484 נורמליזציה אנדוגני3,4,5,6, צ'ל-מיר-39 מ- C. elegans ספייק-in עבור נרמול אקסוגני. כל הנתונים normalizations בוצעו באמצעות שיטת ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
הזיהוי של מחזורי miRNAs מציג קשיים טכניים כי המולקולות נמצאים ברמות נמוכות מאוד בפלסמה הגברה שלהם הוא מאתגר מבחינה כימית בהתחשב הרצף קצר שלהם. מסיבות אלה, בחרנו הליך זה מחשיב החילוץ אורגני עם פנול והן מתודולוגיה מבוססי עמודה סיבי זכוכית. במחזור miRNA החילוץ הוא נושא חם בתחום ביופסיה נוזלי, בחרנו ערכת מסחרי זה הראה לאחד ביותר מבחינת כמות ואיכות של התשואות התאושש7,8. בחרנו פרוטוקול להיפוך לתמלל miRNAs על ידי התוספת של מתאם 5' ו זנב poly(A) כדי 3' של miRNA בוגרת כדי לשפר את מידת הבררנות וספציפיות של התגובה.
בהתחשב החוסן של השיטה, אנו תוכנן לוחות מותאמים אישית עם קדם הבחינו זונדי RT-PCR להעריך כל דגימה של כפילויות, ניתח 2 חולים בתוך כל צלחת, כפי שמוצג באיור 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: לבצע את כל הפעולות הבאות תחת ברדס fume סטיריליים על פי התרגול מעבדה טובה (GLP).
1. פלזמה האיסוף והאחסון
- לאסוף 3 מ"ל של דם היקפיים צינור K3E EDTA.
- Centrifuge את הצינור בטמפרטורת החדר ב x 1,880 g למשך 15 דקות.
- לשחזר פלזמה supernatant ב aliquots של 450 µL.
- לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
הערה: תהליך הצינור דם היקפיים בתוך שעתיים של אוסף. בעת התאוששות הפלזמה הצינור, נא לא להפריע השכבה לימפוציטים.
2. מיצוי של מחזורי miRNAs מ דגימות פלסמה (טבלה של חומרים)
-
להכין את כל הפתרונות הנדרשים, להפשיר את הדגימות עבור הצעדים החילוץ.
- להוסיף 375 µL של מרקפטואתנול הפתרון x denaturating 2 ומערבבים היטב.
- להוסיף 21 מ של ACS כיתה 100% אתנול הפתרון לשטוף miRNA אני, לערבב היטב.
- להוסיף 40 מ של ACS כיתה 100% אתנול הפתרון לשטוף 2/3 ומערבבים היטב.
- לאפשר מסך פלזמה aliquot כדי להפשיר בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להתחיל את השלבים החילוץ.
-
חילוץ אורגני
- העברת µL 400 המדגם פלזמה לתוך צינור ללא RNase 2 מ"ל.
- להוסיף 400 µL של פתרון x denaturating 2, לערבב על-ידי vortexing, בקצרה צנטריפוגה.
- להוסיף 4 µL 1 ננומטר ספייק-אין לערבב על ידי vortexing, בקצרה צנטריפוגה.
- הוסף µL 800 של חומצת פנול-כלורופורם.
- מערבולת עבור 60 s ו צנטריפוגה במהירות המרבית (≥ 10, 000 x g) למשך 15 דקות.
- להעביר את שלב מימית העליון צינור טריים. נא לא להפריע את לאטמוספרה. הערה האחסון התאושש ולמחוק את הצינור המכיל את שלב אי-acqueous.
הערה: 2 x denaturing פתרון מאוחסן ב 4 ° C, עשוי לחזק בטמפרטורה זו. לפני השימוש, חמים הפתרון 37 ° C, לזעזע מדי פעם במשך 10-15 דקות להיות זהירים כדי למשוך את שלב תחתון המכילים את חומצת פנול-סם הרדמה, לא המאגר acqueous שנמצאת מעל התערובת. מחממים את פתרון • תנאי או נוקלאז ללא מים עד 95 מעלות צלזיוס. יש להיזהר חום אמצעי אחסון נאותים של פתרון (100 µL לכל דגימה + 10% עודף).
-
העשרה RNA קטנים
- מוסיפים 1/3 כמות אתנול 100% לשלב מימית מהשלב 2.2.6 ומערבבים היטב.
- המקום מחסנית מסנן לתוך צינור אוסף טריים עבור כל דגימה.
- להעביר עד 700 µL של lysate שלב 2.3.1 ואתנול לתוך מסנן מחסנית צנטריפוגה ב 10,000 x g ב-30 s.
- אם יש > µL 700 של תערובת שמאלה, למקם את פילטרט של צינור טריים וחזור על שלב 2.3.3; חזור עד כל התערובת עבר דרך המחסנית מסנן.
- למדוד את הנפח הכולל של הזרימה דרך.
- להוסיף נפח 2/3 של אתנול 100% filtrate ולערבב היטב.
- הכנס מחסנית המסנן השני צינור אוסף טריים.
- להעביר עד 700 µL נפח דגימה לתוך הדיו, centrifuge ב 10,000 x g עבור ביטול ס' 30 של הזרימה דרך.
- חזור על שלב 2.3.8 עד כל התערובת עבר דרך המחסנית מסנן.
- חלות µL 700 miRNA שטיפת פתרון 1 הדיו מסנן, centrifuge הדיו מסנן עם הצינור אוסף ב 10,000 x g עבור ביטול ס' 15 של הזרימה דרך. מקם את מחסנית מסנן בצינור אוסף אותו.
- החל µL 500 של שטיפת פתרון 2/3 מסנן מחסנית, צנטריפוגה הדיו מסנן עם הצינור אוסף ב 10,000 x g עבור ביטול ס' 15 של הזרימה דרך. מקם את מחסנית מסנן בשפופרת איסוף טריים.
- למקם את מחסנית מסנן בשפופרת איסוף טריים וחזור על שלב 2.3.11 עם 500 µL של שטיפת פתרון 2/3. למחוק את הזרימה דרך ולהעביר את מחסנית מסנן צינור אוסף טריים.
- Centrifuge השפופרות עם מכלי מסנן ב x 10,000 g עבור 1 דקות.
- להעביר את מחסנית מסנן לתוך צינור אוסף mL 1.5 טריים ומוסיפים µL 100 של פתרון • תנאי טרופה (95 ° C) או נוקלאז ללא מים.
- צנטריפוגה ב 10,000 x g ב-30 s כדי לשחזר miRNAs ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
הערה: התמיסה לבן עשוי בצורה הפתרון לשטוף 2/3. זה עודף EDTA שוחרר מן הפתרון. הימנע ממלאים גבישים אלו במהלך השלבים pipetting.
3. לבצע שעתוק במהופך miRNA קדם הגברה (טבלה של חומרים)
-
ביצוע התגובה פוליאדנילציה
- הפשרת כל ריאגנטים בקרח, אז בקצרה מערבולת, צנטריפוגה ספין למטה את התוכן. בנוסף, הפשרה 50% פג 8000, ולאפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר.
- מכינים את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה 0.5 mL, קבלת נפח סופי של 3 µL של תגובה קוקטייל עבור כל דגימה. השתמש את הכרכים הבאים, בתוספת 10% עודף אמצעי אחסון עבור כל ריאגנט.
- להוסיף µL 1.7 RNase ללא מים, 0.5 µL של 10 x Poly(A) מאגר, 0.5 µL של 10 מ מ ATP ו- 0.3 סוף סוף µL 5 תיקים עשויים U/µL האנזים.
- בקצרה מערבולת, צנטריפוגה לערבב קוקטייל ספין למטה את התוכן.
- להעביר µL 2 מדגם מכל קידוח של התגובה צלחת או תגובת הצינור ולהוסיף 3 µL של התגובה קוקטייל. בקצרה מערבולת, צנטריפוגה ספין למטה את התוכן.
- מניחים על הצלחת/צינורות הצנטרפוגה תרמי ולבצע את הפעולות הבאות.
- דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות (שלב פוליאדנילציה).
- דגירה-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (stop תגובה), עם אחיזה הבאים ב 4 º C.
-
לבצע את התגובה מצדו.
- להכין את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה עם אמצעי האחסון הבאים עבור כל דגימה ו-10% נפח עודף.
- להוסיף µL 0.4 RNase ללא מים, µL 3 5 x מאגר ה-DNA ליגאז, 0.6 µL של 25 x מתאם מצדו, 4.5 µL של 50% 8000 פג, µL סוף סוף 1.5 של רנ א ליגאז.
- בקצרה מערבולת, צנטריפוגה לערבב קוקטייל ספין למטה את התוכן.
- להוסיף 10 µL של המיקס כל שפופרת טוב-תגובה המכיל את המוצר עוקב poly(A). מערבבים מטרף צלחת-1,900 סל"ד עבור 1 דקות או על ידי בקצרה vortexing ו ספין למטה התוכן.
- למקם את הצינורות צלחת-תגובה הצנטרפוגה תרמי עם ההגדרות הבאות: הדגירה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, עם קהל מעריצים להחזיק ב 4 º C.
הערה: 50% 8000 פג הוא בעלי צמיגות גבוהה. השתמש בטמפרטורת החדר, כ רפה בעברית ו dispensing לאט. לאחר כל שאיפה, בכל שלב, להחזיק את plugger 10 s כדי לאפשר הכימית לזרום למעלה ולמטה.
-
לבצע את התגובה שעתוק במהופך.
- מכינים את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה, עם אמצעי האחסון הבאים עבור כל דגימה ו-10% נפח עודף.
- הוסף µL 3.3 של RNase ללא מים, µL 6 5 x RT מאגר, µL 1.2 של dNTP מיקס (25 מ מ כל אחד), µL 1.5 של 20 x תחל RT אוניברסלי 3 סוף סוף µL של 10 x מיקס האנזים RT.
- בקצרה מערבולת, צנטריפוגה לערבב קוקטייל ספין למטה את התוכן.
- להוסיף µL 15 של המיקס כל שפופרת טוב-תגובה המכיל את המוצר מצדו. מערבבים מטרף צלחת-1,900 סל"ד עבור 1 דקות או על ידי בקצרה vortexing ו ספין למטה התוכן.
- מקום הצינורות צלחת-תגובה הצנטרפוגה תרמי עם ההגדרות הבאות.
- דגירה ב 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות (שעתוק במהופך).
- דגירה ב 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (stop תגובה), עם אחיזה הבאים ב 4 º C.
הערה: המוצר RT עכשיו ניתן לאחסן ב-20 ° C, יישאר יציב עד 2 חודשים.
-
לבצע את התגובה מיר-Amp (טבלה של חומרים).
- להכין את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה עם אמצעי האחסון הבאים עבור כל דגימה ו-10% נפח עודף.
- הוסף µL 17.5 RNase ללא מים, µL 25 של המיקס מאסטר של מיר-Amp 2 x 2.5 µL של 20 x מיקס פריימר מיר-Amp.
- בקצרה מערבולת, צנטריפוגה לערבב קוקטייל ספין למטה את התוכן.
- עבור כל דגימה, להעביר µL 45 של המיקס התגובה כל טוב של צלחת תגובה חדשה או צינור התגובה. להוסיף 5 µL של המוצר RT כל שפופרת טוב או תגובה. מערבבים מטרף צלחת-1,900 סל"ד עבור 1 דקות או על ידי בקצרה vortexing ו ספין למטה התוכן.
- למקם את הצינורות צלחת-תגובה הצנטרפוגה תרמי ולהפעיל כפי שמוצג בטבלה 1.
4. ביצוע PCR בזמן אמת
- לדלל כל cDNA מדגם 1:10 במאגר טה 0.1 x.
- לחשב את מספר בארות/משכפל עבור כל דגימה. להכין את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה עם אמצעי האחסון הבאים עבור כל דגימה, הוספת 10% נפח עודף.
- להוסיף 4 µL של מים נטולי RNase 10 µL של 2 x מהר מתקדם מאסטר מיקס (טבלה של חומרים), µL סוף סוף 5 של cDNA מדולל.
- לערבב על-ידי vortexing, בקצרה צנטריפוגה כדי לסובב את התוכן.
- העברת µL 19 של תערובת התגובה כל טוב, לאטום את הצלחת, בקצרה צנטריפוגה.
- מבצע פרוטוקול תרמי (טבלה 2) מערכת ה-RT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתחנו את פאנל של הקשורות אנגיוגנזה miRNAs במחזור ביחס ההישרדות ללא התקדמות המחלה (PFS), הכולל הישרדות (OS) ותגובות האובייקטיבית לדרג (אור) ב mCRC 52 חולים שטופלו עם טי מבוסס-B הערכת סמנים כזה בדגימות הפלסמה הוא מאתגר בשל קשיים טכניים. השתמשנו בשיטות הוקמה לחילוץ miRNA דגימות פלסמה החולה, שעתוק במהופך, הגברה מראש. עקבתי אחרי ההוראות של היצרן, עם רק כמה שינויים נדרש, במיוחד בשלבים החילוץ, הערכנו בהצלחה כל המטרות שלנו בתוך האוכלוסייה המטופלת (איור 2).
בפרט, ניתחנו את 2 פלזמה דגימות המטופל, התאמת בסיסית וביטוי miRNA טיפול-השתנה עם תוצאות המטופל.
ביצענו דילולים טורי של צ'ל-מיר-39-0.05 ננומטר, 0.5 ננומטר, 5nM ו- 5 pM ב 800 µL של פלסמה לטעום (µL 400 של פלסמה בתוספת 400 µL של פתרון x denaturating 2) כדי לקבוע ריכוז ספייק-אין להשתמש. כפי שמוצג באיור 4, הפקד אקסוגני הראה הסף מחזור ערכים (Ct) שהיו התואם דילולים טורי, המציין את היציבות של פרוטוקול כולו (קרי, חילוץ, שעתוק במהופך והערכה לרביעיית-PCR). יתר על כן, אלה דילולים טורי אפשרה לנו לבחור הריכוז ספייק-אין זה לא להפריע הפוכה-שעתוק של כל miRNAs היעד.
שיטה זו מאפשרת לנו לתאם miRNAs בסיסית עם המאפיינים הקליניים הפתולוגיים. בפרט, מצאנו כי יש-מיר-199a - 5p, יש-מיר-335-5 p יש-מיר - 520d - 3p היו באופן משמעותי upregulated על צד שמאל ביחס ימנית צדדית נגעים (p = 0.03, p = 0.006 ו- p = 0.008, בהתאמה). לעומת זאת, p יש-מיר-21-5 היה משמעותי downregulated בחולים עם מוטציה-ראס (K-RAS, p = 0.01 ו- N-ראס, p = 0.008), ואילו יש-מיר-221-3 p היה upregulated (p = 0.05, p = 0.01, K, N-ראס, בהתאמה).
השוואת רמות הביטוי של miRNA בין הבסיס לבין ההערכה הקלינית הראשונה, הבחנו כי עלייה יש-מיר-155-5 רמות הביטוי p היה מזוהה עם PFS קצר יותר (p = 0.04) ו- OS (p = 0.02). בפרט, בחולים עם עלייה של % ≥30 ב p יש-מיר-155-5, PFS היה 9.5 חודשים (95% CI, 6.8-18.7), OS חודשים 15.9 (95% CI, 8.4-לא הגיעו) בהשוואה ל- 22.3 (95% CI, 10.2-25.5) ואין 42.9 (95% CI, 24.8-לא הגיעו) עבור אלה עם < 30% להגדיל (איור 3). הערך החציוני של וריאציה בסדרה במקרה (30%) נקבע כנקודת החיתוך. במחזור רמות הבסיס של miRNAs היו dichotomized לתוך "גבוה" או "נמוך" על-פי ערכים9.
איור 1: עיצוב של פריסת לוח מותאם אישית. הגששים היו מראש המאותר כל טוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: דוגמאות חלקות הגברה לרביעיית-PCR- מגרש הגברה (A) של צלחת אישית לרביעיית יחיד-PCR. כל הסמנים היו להערכה שתי הדגימות צלחת אחת. (B) לרביעיית-PCR של p יש-מיר-17-5 בסדרה הכוללת במקרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: תוצאות ניסויי קליני יחסית יש-מיר-155-5 עמ' (א) Ct ערכים עבור p יש-מיר-155-5. הגברה חלקת p יש-מיר-155-5 בסדרה הכוללת במקרה. PFS (B) ו- OS של חולים עם % ≥30 או < 30% גידול במחזור p יש-מיר-155-5. PFS מחושב משך הזמן מיום אקראיות לתאריך של העדות המתועדת הראשונה של התקדמות הגידול, הערכת הגידול האחרון או מוות בהעדר התקדמות המחלה. מערכת ההפעלה מחושב משך הזמן מיום אקראיות לתאריך של מוות מכל סיבה או המעקב האחרון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: דילול טורי forcel-מיר-39 תוצאות ניסויית. (א) לרביעיית-PCR עבור דילולים טורי של צ'ל-מיר-39, עם היחסי (B) Cts. דילולים בוצעו ב 5 nM, 0.5 ננומטר, 0.05 nM ו 5 pM בדגימות הפלסמה מן המטופל אותו. כזה ליניאריות assay אפשרה לנו לבחור את הריכוז הכי טוב להשתמש בסדרה הכוללת במקרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| שלב | טמפרטורה | משך | מחזורים |
| הפעלת אנזים | 95 ° C | 5 דקות | 1 |
| Denature | 95 ° C | 3 s | 14 |
| Anneal/הארכת | 60 ° C | 30 s | |
| לעצור את התגובה | 99 ° C | 10 דקות | 1 |
| . תחזיק | 4 ° C | . תחזיק | ∞ |
טבלה 1: פרוטוקול תרמי של מיר-AMP תגובה.
| שלב | טמפרטורה | משך | מחזורים |
| הפעלת אנזים | 95 ° C | 20 s | 1 |
| Denature | 95 ° C | 3 s | 40 |
| Anneal/הארכת | 60 ° C | 30 s | |
| . תחזיק | 4 ° C | . תחזיק | ∞ |
טבלה 2: פרוטוקול תרמי של לרביעיית-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
miRNAs קטנות ללא קידוד RNAs (18-25 נוקלאוטידים אורך) מסוגל מחייב 3' UTR האזור של המטרה שלהם RNA שליח, עיכוב או זה משפיל. הם ובכך ניתן לראות הרגולטורים ביטוי גנים ברמת translational. בעשור האחרון, מספר miRNAs בקורלציה עם סרטן ייזום ופיתוח, גורם אותם סמנים קליניים שימושי לאבחון, פרוגנוזה וטיפול. מוגן על ידי RNases, miRNAs נמצאים בטופס יציב בנוזלים ביולוגיים כגון דם, פלסמה, סרום, שתן ורוק, אשר הוביל עניין הולך וגובר ב התועלת שלהם פוטנציאל הקליני10.
למרות זאת, ההערכה של מחזורי miRNAs משימה מאתגרת, קשיים לגבי איסוף הדגימה, היעד חילוץ, הבחירה בפלטפורמת ונורמליזציה הכללית הם נושאים התווכחו בלהט בתוך הקהילה המדעית.
עבור מדגם האיסוף והאחסון, משתנים מראש אנליטי מקושרים היטב פלזמה טיפול ועיבוד. התמקדנו על דגימות פלסמה ולא סרום בהתחשב בכך מהאמונה של ריכוז גבוה miRNA בחודש האחרון, כנראה עקב שחרורו של מולקולות אלה במהלך קרישה תהליך10,11,12 . להתייחס לנושא שחרורו של חומצות גרעין הסלולר הנובעות פירוק תאי הדם, אנחנו centrifuged את הדגימות בתוך שעתיים של איסוף דם. השתמשנו גם צינורות K3E EDTA כי אחרים ואנטי הקרשת הדם ידועים ביכולתם בצעדים הגברה (קרי, הפארין) עשוי לעורר המוליזה (קרי, ציטראט). כפי שהוא קריטי כדי למנוע זיהום טסיות ו לימפוציטים בשלב טרום אנליטית, אנו מוסרים הפלזמה מהצינור לאט מאוד, לא מחוק לגמרי את µL אחרונה 50 ~ המדגם מהצינור.
מחקרים שונים הראו העליונות של שיטות מבוססי עמודה החילוץ על פרוטוקולים guanidine פנול/כלורופורם11,13, אבל ח'ורי ואח מבודד יעיל באיכות טובה RNAs קטן מסרום שימוש כזה ריאגנטים ללא זיהום14. ערכת מסחרי שהשתמשנו ברצף מבצע הן שיטות החילוץ, המתיר התשואות miRNA מתאימים מבחינת ספייק-אין ריכוזים. רק ביצענו שינוי אחד ביחס להוראות היצרן, קרי, אוסף טריים צינורות שימשו תמיד אחרי כל שלב כביסה מחסנית מסנן כדי למנוע/לצמצם את הסיכון לזיהום ריאגנט. כדי לזהות את הטוב ביותר בספייק הריכוז בדגימות שלנו ובכך למנוע הפרעה תגובות עוקבות, בוצע לנו לראשונה בפרוטוקול כולו מבלי להוסיף את צ'ל-מיר-39 במהלך השלב החילוץ כדי להעריך את רמות ביטוי החציוני של המטרות שלנו. אנחנו ואז לבצע את החילוץ miRNA דה נובו מדגימות פלזמה של המטופל אותו באמצעות לדילול טורי צ'ל-מיר-39 כדי לזהות את הריכוז הכי טוב להוסיף הדגימות פלזמה של סדרת במקרה שלנו (איור 4). זה, עם זאת, בטח תחתון כי ריכוז אופטימלי צ'ל-מיר-39, מזוהה עבור מדגם אחד בלבד, לא יהיה בהכרח הריכוז הכי טוב עבור הסידרה תיק הכולל בשל סדרה של משתנים פנימיים כגון הרגלי לגיל, מין או החיים, אשר יכול להשפיע על הביטוי miRNA מוחלטת בתוך הדם.
miRNA שעתוק במהופך, הגברה מייצגים 2 צעדים קריטיים. שימוש שני לצורך זיהוי miRNA (כלומר., לרביעיית-PCR ו- microarray), בחרנו לרביעיית-PCR בהתחשב שלה רגישות גבוהה ועל הצורך להעריך רק פאנל הנבחר של miRNAs (מגבלה עיקרית של מתודולוגיה זו הוא שלה תפוקה נמוכה)15. השתמשנו כימיה שעתוק במהופך מבוסס על 3' תיקים עשויים עוקב ו- 5' מצדו מתאם רצפים כדי להרחיב את miRNA בוגרת ורשיון חישול של תחל RT אוניברסלי. על סמך זיהוי בסיס-זוג יחיד, מתאם מצדו 5' יכול לעזור כדי למנוע הטיות נפוצות כגון אלה קשורה 5' אי-התאמה. ערכה זו כוללת גם שלב קדם הגברה הנדרשת עבור דגימות התשואה נמוכה, כמו פלזמה. למרות הצורך, שלב זה יכול להציג כמה הטיות הגברה לפני שלב הזיהוי.
ב פרוטוקול זה, ניתחנו את פאנל של 24 miRNAs שנבחר בקורלציה עם אנגיוגנזה. בפרט, אנו בחרה לוחות מותאמים אישית בדיקה מראש מנומר, ההוראות של היצרן עבור שלשול לרביעיית-PCR. הנושאים המרכזיים הקשורים miRNA לרביעיית-PCR הם הבחירה של גנים התייחסות ונורמליזציה ניתוח הנתונים הבאים שלהם.
למרות מחקרים רבים נערכו כדי לזהות את miRNA הטוב ביותר לשימוש עבור נורמליזציה, אין הסכמה אחיד הושגה. כדי לטפל מגבלה זו, אנחנו ביצעו חיפוש ספרות כדי לזהות את miRNAs במחזור זה יכול לשמש גנים התייחסות בסדרה במקרה שלנו.
אנחנו גם נבחר את miRNAs 4 עם ראיות חזקות לביטוי יציב בדגימות הפלסמה מחולים mCRC ונבדק אותם בחלק קטן יותר של סדרת במקרה שלנו. 2 miRNAs היציב ביותר זוהו על ידי ניתוח GeNorm כפי הפניה גנים משק בית.
לסיכום, ההערכה של מחזורי miRNAs בדגימות דם היקפיים יש מספר קשיים ידוע. עם זאת, אנו מאמינים כי למתודולוגיות השתמשנו הם אמין וחזק, ומאפשר למחקר מעמיק ומדויק של סמנים ביולוגיים אלה אשר יש בהם כדי לשנות את התרחיש טיפול עבור סרטן המעי הגס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן באופן חלקי על ידי רוש S.p.A., סוכנות התרופות האיטלקית (דמרי).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1,000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
- Luo, H. -Y., Xu, R. -H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
