Summary
Vi presentiamo un protocollo per valutare i livelli di espressione di microRNA (Mirna) di circolazione nei campioni del plasma dai malati di cancro. In particolare, abbiamo utilizzato un kit disponibile in commercio per estrazione di miRNA e trascrizione d'inversione di circolazione. Infine, abbiamo analizzato un panel di miRNA selezionati 24 utilizzando targhe personalizzate in tempo reale sonda pre-maculato.
Abstract
Vi è crescente interesse nella biopsia liquida per cancro diagnosi, prognosi e monitoraggio terapeutico, creando la necessità di biomarcatori affidabili e utili per la pratica clinica. Qui, presentiamo un protocollo per estrarre, reverse trascrivere e valutare i livelli di espressione di Mirna da campioni di plasma di pazienti con cancro colorettale (CRC) di circolazione. i microRNA (Mirna) sono una classe di RNA non codificanti di 18-25 nucleotidi di lunghezza che regolano l'espressione dei geni bersaglio a livello traduzionale e svolgono un ruolo importante, compreso quello della funzione di pro - e anti-angiogenici, nella fisiopatologia delle vari organi. i miRNA sono stabili nei fluidi biologici come siero e plasma, che li rende ideale circolanti biomarcatori per il processo decisionale di diagnosi, prognosi e trattamento di cancro e monitoraggio. Estrazione di miRNA in circolazione è stato effettuato usando un metodo rapido ed efficace che coinvolge metodologie biologiche e basata su colonne. Per retrotrascrizione di miRNA, abbiamo utilizzato una procedura multi-step che considera poliadenilazione al 3' e la legatura di un adattatore a 5' dei miRNA maturi, seguiti pre-dall'amplificazione miRNA casuale. Abbiamo selezionato un pannello personalizzato 24-miRNA per essere testato da reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa (qRT-PCR) e macchiato le sonde miRNA su targhe personalizzate matrice. Abbiamo effettuato qRT-PCR piastra viene eseguito su un sistema di PCR in tempo reale. Le pulizie miRNA per normalizzazione sono stati selezionati utilizzando il software GeNorm (v. 3.2). I dati sono stati analizzati utilizzando Expression suite software (v 1.1) e le analisi statistiche sono state eseguite. Il metodo ha dimostrato di essere affidabile e tecnicamente robusto e potrebbe essere utile per valutare i livelli di biomarcatore in campioni liquidi come plasma e/o del siero.
Introduction
CRC rappresenta il terzo più frequentemente diagnosticata la malignità e la quarta causa di morte per cancro in tutto il mondo. Ad oggi, (B) il bevacizumab, un anticorpo monoclonale diretto contro il fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) e (C) di cetuximab o panitumumab (P), anticorpi monoclonali diretti contro il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), sono stati approvati per trattamento di prima linea in combinazione con regimi di chemioterapia (CT).
Mutazioni dei geni K-RAS e N-RAS sono i biomarcatori clinicamente utili soli in grado di identificare i pazienti che sono meno probabili trarre giovamento da basati su anti-EGFR CT. Anche se parecchi studi sono stati condotti per la ricerca di biomarcatori che sono predittivi di risposta al CT basato su B, c'è ancora una sostanziale mancanza di farmaci affidabile ed efficace per l'uso nella pratica clinica1.
i miRNA sono piccole molecole di RNA (18-25 nucleotidi di lunghezza) che regolano la traduzione dei geni bersaglio e svolgono un ruolo cruciale in numerosi processi fisiopatologici, tra cui l'embriogenesi e carcinogenesi. Queste molecole sono altamente stabili nei liquidi biologici come plasma/siero, urina e dell'espettorato, che li rende robusti biomarcatori da utilizzare per il campionamento non invasivo2. Utilizzando un pannello di miRNA coinvolti nel pathway angiogenici, abbiamo mirato a identificare circolanti nuovi biomarcatori in grado di predire il risultato clinico in pazienti con CRC metastatico (mCRC) trattati con un regime di CT basato su B.
Abbiamo analizzato una serie di 52 mCRC pazienti trattati con CT B-base entro il prospettico multicentrico randomizzato di fase III prova "Italiano Trial in Advanced cancro colorettale" (ITACa). Il presente protocollo è stato approvato dal comitato etico locale (Comitato Etico Area Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, n. 674) su 19th settembre 2007. Tutti i pazienti hanno dato consenso informato prima di raccolta del campione di sangue. Per ogni paziente, campioni di sangue venosi sono stati raccolti prima del trattamento e alla prima valutazione clinica (dopo 8 settimane) per valutare l'espressione dei miRNA basale e la sua modulazione durante il trattamento in relazione al risultato paziente.
Attraverso una ricerca della letteratura, abbiamo selezionato 21 miRNAs correlato con il processo angiogenetico che sono noti per essere rilevabile nel plasma umano: ha-miR-107, ha-miR-126-3 p, ha-miR-145-5 p, p ha-miR-194-5, ha-miR-199a - 5p, ha-miR-200b - 3P, ha-miR-20b - 5p , ha-miR-21-5 p, ha-miR-210-3 p, p ha-miR-221-3, ha-miR-24-3 p, p ha-miR-27a - 3P, ha-miR-29b - 3P, ha-miR-335-5, ha-miR-424-5 p, ha-miR-497-5 p, p ha-miR - 520d - 3P, ha-miR-92a - 3P, ha-miR-17-5 e ha-miR-155-5 p. Abbiamo inoltre selezionato ha-miR-223-3 p e ha-mir-484 per normalizzazione endogeno3,4,5,6e cel-miR-39 purificato dal c. elegans come spike-in per la normalizzazione esogeno. Le normalizzazioni di tutti i dati sono state eseguite utilizzando il metodo di ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
La rilevazione di Mirna in circolazione presenta alcune difficoltà tecniche, perché le molecole sono presenti a livelli molto bassi nel plasma e la loro amplificazione è chimicamente impegnativo dato loro breve sequenza. Per queste ragioni, abbiamo selezionato una procedura che ritiene sia organico estrazione con fenolo e una metodologia basata su colonna di fibra di vetro. Estrazione di miRNA di circolazione è un tema caldo nel campo della biopsia liquida, e abbiamo scelto un kit commerciale che ha dimostrato di essere uno dei più affidabili in termini di quantità e qualità di rendimenti recuperati7,8. Abbiamo selezionato un protocollo per invertire trascrivere Mirna dall'aggiunta di un adattatore a 5' e una coda di poli (a) a 3' del quieto maturo per migliorare la selettività e specificità della reazione.
Data la robustezza del metodo, abbiamo progettato targhe personalizzate con sonde pre-macchiati per RT-PCR valutare ciascun campione in duplicato e analizzati 2 pazienti all'interno di ogni piatto, come mostrato nella Figura 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: Eseguire tutti i passaggi seguenti sotto una cappa sterilizzati secondo buona pratica di laboratorio (BPL).
1. plasma raccolta e conservazione
- Raccogliere 3 mL di sangue venoso periferico in un tubo di K3E EDTA.
- Centrifugare la provetta a temperatura ambiente a 1.880 x g per 15 min.
- Recuperare il plasma surnatante in aliquote di 450 µ l.
- Conservare i campioni a-80 ° C fino all'utilizzo.
Nota: Processo il tubo di sangue periferico entro 2 h dalla raccolta. Quando si ripristina il plasma dal tubo, non disturbano lo strato del linfocita.
2. estrazione di circolazione Mirna da campioni di Plasma (tabella materiali)
-
Preparare tutte le soluzioni necessarie e scongelare i campioni per le operazioni di estrazione.
- µ L 375 di 2-mercaptoetanolo per la soluzione di x denaturating 2 e mescolare bene.
- Aggiungere 21 mL di etanolo al 100% grado ACS per la soluzione di lavaggio di miRNA io e mescolare bene.
- Aggiungere 40 mL di etanolo al 100% grado ACS per la soluzione di lavaggio 2/3 e mescolare bene.
- Consentire un plasma aliquota per scongelare a temperatura ambiente e poi iniziare la procedura di estrazione.
-
Estrazione organica
- Trasferire 400 µ l di campione di plasma in una provetta da 2 mL RNAsi-libera.
- Aggiungere 400 µ l di soluzione di x denaturating 2, mescolare nel vortex e centrifugare brevemente.
- Aggiungere 4 µ l di 1 nM picco-in, mescolare nel vortex e centrifugare brevemente.
- Aggiungere 800 µ l di acido fenolo-cloroformio.
- Vortexare per 60 s e centrifugare a massima velocità (≥ 10, 000 x g) per 15 min.
- Trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta. Non disturbare l'interfase. Nota il volume recuperato e gettare la provetta contenente la fase di non-acquosa.
Nota: 2x denaturare soluzione è conservato a 4 ° C e può solidificare a questa temperatura. Prima dell'uso, caldo la soluzione a 37 ° C, agitando ogni tanto per 10-15 minuti essere attenti a ritirare la fase inferiore contenente acido fenolo-cloroformio, non il buffer di acquosa che si trova sopra la miscela. Preriscaldare la soluzione per eluizione o nucleasi-free acqua a 95 ° C. Fare attenzione a riscaldare un adeguato volume di soluzione (100 µ l di campione + 10% in eccesso).
-
Arricchimento di piccoli RNA
- Aggiungere 1/3 del volume di etanolo al 100% per la fase acquosa dal punto 2.2.6 e mescolare accuratamente.
- Inserire una cartuccia di filtro in una provetta di raccolta fresca per ogni campione.
- Transfer fino a 700 µ l di lisato da passo 2.3.1 ed etanolo nella cartuccia filtrante e centrifugare a 10.000 x g per 30 s.
- Se c'è > 700 µ l di miscela di sinistra, mettere il filtrato in una nuova provetta e ripetere il punto 2.3.3; Ripetere fino a quando tutto il composto è passato attraverso la cartuccia del filtro.
- Misurare il volume totale di flusso continuo.
- Aggiungere 2/3 del volume di etanolo al 100% del filtrato e mescolare accuratamente.
- Collocare una seconda cartuccia di filtro in una provetta di raccolta fresca.
- Trasferimento fino a 700 µ l di volume di campione nella cartuccia e centrifugare a 10.000 x g per 30 s. scartare il flusso continuo.
- Ripetere il passaggio 2.3.8 fino a quando tutto il composto è passato attraverso la cartuccia del filtro.
- Applicare 700 µ l di soluzione di lavaggio miRNA 1 la cartuccia filtrante e centrifugare la cartuccia del filtro con il tubo di raccolta a 10.000 x g per 15 s. scartare il flusso continuo. Posizionare la cartuccia di filtro nello stesso tubo di raccolta.
- Applicare 500 µ l di soluzione di lavaggio 2/3 per la cartuccia del filtro e la centrifuga la cartuccia del filtro con il tubo di raccolta a 10.000 x g per 15 s. scartare il flusso continuo. Collocare la cartuccia di filtro in una provetta di raccolta fresca.
- Collocare la cartuccia di filtro in una provetta di raccolta fresca e ripetere il passaggio 2.3.11 con 500 µ l di soluzione di lavaggio 2/3. Scartare il flusso continuo e trasferire la cartuccia di filtro in una provetta di raccolta fresca.
- Centrifugare le provette con le cartucce di filtro a 10.000 x g per 1 min.
- Trasferire la cartuccia di filtro in una provetta di raccolta fresca 1,5 mL e aggiungere 100 µ l di soluzione per eluizione preriscaldato (95 ° C) o acqua priva di nucleasi.
- Centrifuga a 10.000 x g per 30 s di Mirna di recuperare e conservare a-80 ° C.
Nota: Nella soluzione di lavaggio 2/3 può formarsi un precipitato bianco. Si tratta di EDTA in eccesso rilasciato dalla soluzione. Evitare l'elaborazione di questi cristalli durante le fasi di pipettaggio.
3. eseguire la trascrizione inversa e miRNA pre-amplificazione (tabella materiali)
-
Eseguire la reazione di poliadenilazione
- Scongelare tutti i reagenti sul ghiaccio, poi brevemente vortex e centrifugare a girare giù il contenuto. Inoltre, disgelo 50% PEG 8000, permettendogli di raggiungere la temperatura ambiente.
- Preparare la miscela di reazione in una provetta da centrifuga da 0,5 mL, ottenendo un volume finale di 3 µ l di reazione cocktail per ogni campione. Utilizzare i seguenti volumi, più 10% di volume in eccesso per ciascun reagente.
- Aggiungere 1,7 µ l di acqua RNAsi-libera, 0,5 µ l di tampone di poli (a) 10x, 0,5 µ l di 10 mM ATP e infine 0,3 µ l 5 U / µ l PolyA enzima.
- Brevemente vortex e centrifugare il mix cocktail a girare giù il contenuto.
- Trasferimento 2 µ l di campione in ciascun pozzetto della piastra di reazione o del tubo di reazione e aggiungere 3 µ l del cocktail. Brevemente vortex e centrifugare a girare giù il contenuto.
- Posizionare il piastra/tubi in un termociclatore e procedere come segue.
- Incubare a 37 ° C per 45 min (poliadenilazione passo).
- Incubare a 65 ° C per 10 minuti (fermata reazione), con una stretta seguente a 4 ° C.
-
Eseguire la reazione di legatura.
- Preparare la miscela di reazione in una provetta da centrifuga con i seguenti volumi per ogni campione e il 10% del volume in eccesso.
- Aggiungere 0,4 µ l di acqua RNAsi-libera, 3 µ l di DNA ligasi buffer, 0,6 µ l di 25 x adattatore di legatura, 4,5 µ l del 50%: 5x PEG 8000 e infine 1,5 µ l della ligasi di RNA.
- Brevemente vortex e centrifugare il mix cocktail a girare giù il contenuto.
- Aggiungere 10 µ l della miscela per ogni tubo pozzo/reazione contenente il prodotto di coda di poli (a). Mescolare un agitatore per piastre a 1.900 giri/min per 1 min o brevemente su vortex e centrifugare il contenuto.
- Posizionare i tubi piastra/reazione in un termociclatore con le seguenti impostazioni: incubazione a 60 ° C per 60 min, con un seguito tenere a 4 ° C.
Nota: 50% PEG 8000 è molto viscoso. Utilizzare a temperatura ambiente, aspirazione e il dosaggio lentamente. Dopo ogni aspirazione e passaggio di erogazione, tenere premuto l'otturatore per 10 s per consentire il reagente a scorrere su e giù.
-
Eseguire la reazione di trascrizione inversa.
- Preparare la miscela di reazione in una provetta da centrifuga, con i seguenti volumi per ogni campione e il 10% del volume in eccesso.
- 3,3 µ l di acqua RNAsi-libera, 6 µ l di 5 x RT buffer, 1,2 µ l di miscela del dNTP (25 mM), 1,5 µ l di primer universali RT: 20x e infine 3 µ l di miscela di enzima RT: 10x.
- Brevemente vortex e centrifugare il mix cocktail a girare giù il contenuto.
- Aggiungere 15 µ l della miscela a ciascuna provetta di pozzo/reazione contenente il prodotto di legatura. Mescolare un agitatore per piastre a 1.900 giri/min per 1 min o brevemente su vortex e centrifugare il contenuto.
- Posizionare i tubi piastra/reazione in un termociclatore con le seguenti impostazioni.
- Incubare a 42 ° C per 15 min (trascrizione inversa).
- Incubare a 85 ° C per 5 minuti (fermata reazione), con una stretta seguente a 4 ° C.
Nota: Il prodotto di RT ora possa essere conservato a-20 ° C e rimarrà stabile fino a 2 mesi.
-
Eseguire la reazione di miR-Amp (tabella materiali).
- Preparare la miscela di reazione in una provetta da centrifuga con i seguenti volumi per ogni campione e il 10% del volume in eccesso.
- Aggiungere 25 µ l di mix master miR-Amp 2 x 17,5 µ l di acqua RNAsi-libera e 2,5 µ l di miscela di primer miR-Amp: 20x.
- Brevemente vortex e centrifugare il mix cocktail a girare giù il contenuto.
- Per ogni campione, trasferire 45 µ l di miscela di reazione in ciascun pozzetto di una piastra di reazione o di un tubo di reazione. Aggiungere 5 µ l del prodotto RT a ciascuna provetta di reazione o bene. Mescolare un agitatore per piastre a 1.900 giri/min per 1 min o brevemente su vortex e centrifugare il contenuto.
- Inserire le provette di reazione/piastra in un termociclatore ed eseguire come indicato nella tabella 1.
4. eseguire la PCR in tempo reale
- Diluire ogni cDNA campione 01:10 in buffer di 0.1 x TE.
- Calcolare il numero di pozzetti/replicati per ciascun campione. Preparare la miscela di reazione in una provetta da centrifuga con i seguenti volumi per ciascun campione, l'aggiunta di 10% del volume in eccesso.
- Aggiungere 4 µ l di acqua RNAsi-libera, 10 µ l di 2 mix avanzato master x veloce (Tabella materiali) e infine 5 µ l di cDNA diluito.
- Mescolare nel vortex e centrifugare brevemente per rallentare il contenuto.
- Trasferire 19 µ l di miscela di reazione per ciascun pozzetto, sigillare la piastra e centrifugare brevemente.
- Eseguire il protocollo termico (tabella 2) su un sistema di RT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Abbiamo analizzato un panel di Mirna circolanti angiogenesi-correlate in relazione alla sopravvivenza libera da progressione (PFS), il tasso globale del sopravvivenza (OS) e risposta obiettiva (ORR) in un mCRC 52 pazienti trattati con B-base CT. La valutazione di tali biomarcatori in campioni di plasma è impegnativa a causa di difficoltà tecniche. Abbiamo utilizzato metodi consolidati per l'estrazione di miRNA da campioni di plasma paziente, trascrizione d'inversione e pre-amplificazione. Seguendo le istruzioni del produttore e con solo alcune modifiche necessarie, soprattutto nei passaggi estrazione, abbiamo valutato con successo tutti i nostri obiettivi nella popolazione di pazienti (Figura 2).
In particolare, abbiamo analizzato 2 plasma campioni/paziente, correlando la linea di base ed espressione dei miRNA terapia-modificato con outcome del paziente.
Abbiamo effettuato diluizioni seriali del cel-miR-39 a 0,05 nM, 0,5 nM, 5nM e 17 in 800 µ l di plasma (400 µ l di plasma più 400 µ l di soluzione di x denaturating 2) di esempio per determinare la concentrazione di picco-in da utilizzare. Come illustrato nella Figura 4, il controllo esogeno ha mostrato ciclo soglia valori (Ct) che erano congruenti con le diluizioni seriali, che indica la robustezza del protocollo intero (cioè, estrazione, retrotrascrizione e valutazione qRT-PCR). Inoltre, queste diluizioni seriali permette di selezionare la concentrazione di picco-in che non avrebbe interferito con il d'inversione-trascrizione di tutti i target Mirna.
Questo metodo ci ha permesso di correlare i miRNA basale con le caratteristiche patologiche cliniche. In particolare, abbiamo trovato che ha-miR-199a - 5p, ha-miR-335-5 p e ha-miR - 520d - 3P significativamente sono stati aumentati a sinistra-parteggiato rispetto alle lesioni di destra-parteggiato (p = 0,03, p = 0,006 e p = 0,008, rispettivamente). Al contrario, ha-miR-21-5 p downregulated significativamente in pazienti RAS-mutato (K-RAS, p = 0,01 e N-RAS, p = 0.008), mentre ha-miR-221-3 p era sovraregolati (p = 0.05, p = 0,01, K - e N-RAS, rispettivamente).
Confrontando i livelli di espressione di miRNA tra previsione e prima valutazione clinica, abbiamo osservato che un aumento nei livelli di espressione di ha-miR-155-5 p è stato associato con più breve PFS (p = 0,04) e OS (p = 0,02). In particolare, in pazienti con un aumento di ≥ 30% in ha-miR-155-5 p, PFS è stata di 9,5 mesi (95% CI, 6.8-18,7) e OS era 15,9 mesi (CI di 95%, 8,4-non raggiunto) rispetto a 22,3 mesi (95% CI, 10.2-25.5) e 42,9 mesi (95% CI, 24,8-non raggiunto) per quelli con un < 30% aumento (Figura 3). Il valore mediano di variazione in serie di caso (30%) è stato impostato come il punto di taglio. Livelli basali di circolazione di Mirna sono stato dicotomizzati in "alta" o "bassa" secondo valori mediani9.
Figura 1: progettazione del layout personalizzati piastra. Sonde sono state pre-macchiati in ciascun pozzetto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: esempi di qRT-PCR amplificazione trame. (A) amplificazione trama di un piatto personalizzato singolo qRT-PCR. Tutti i marcatori erano valutabili in entrambi esempi di piatto unico. (B) qRT-PCR di ha-miR-17-5 p della serie nel complesso caso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: risultati sperimentali e clinici relativi al ha-miR-155-5 p. Valori di (A) Ct per ha-miR-155-5 p. Trama di amplificazione di ha-miR-155-5 p della serie nel complesso caso. (B) PFS e OS dei pazienti con ≥ 30% o < aumento del 30% in circolazione ha-miR-155-5 p. PFS è stato calcolato come il tempo dalla data di randomizzazione alla data della prima testimonianza documentata della progressione del tumore, ultima valutazione del tumore o morte in assenza di progressione della malattia. OS è stato calcolato come il tempo dalla data di randomizzazione alla data di morte da qualsiasi causa o ultimo follow-up. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: diluizione seriale di risultati sperimentali forcel-miR-39. (A) qRT-PCR per diluizioni seriali del cel-miR-39, con relativa (B) Cts. diluizioni sono state eseguite a 5 nM, 0,5 nM, 0,05 nM e 17 in campioni di plasma dal paziente stesso. Tale linearità di analisi ci ha permesso di selezionare la migliore concentrazione di utilizzare la serie nel complesso caso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Passo | Temperatura | Durata | Cicli |
| Attivazione degli enzimi | 95 ° C | 5 min | 1 |
| Denaturare | 95 ° C | 3 s | 14 |
| Tempri/estendere | 60 ° C | 30 s | |
| Fermare la reazione | 99 ° C | 10 min | 1 |
| Tenere premuto | 4 ° C | Tenere premuto | ∞ |
Tabella 1: Protocollo termale di reazione di mir-AMP.
| Passo | Temperatura | Durata | Cicli |
| Attivazione degli enzimi | 95 ° C | 20 s | 1 |
| Denaturare | 95 ° C | 3 s | 40 |
| Tempri/estendere | 60 ° C | 30 s | |
| Tenere premuto | 4 ° C | Tenere premuto | ∞ |
Tabella 2: Protocollo termale di qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
i miRNA sono piccoli non-codificazione RNAs (18-25 nucleotidi di lunghezza) in grado di associazione regione 3' UTR del loro obiettivo di RNA messaggero e d'inibizione e/o degradanti si. Possono quindi essere considerati regolatori di espressione genica a livello traduzionale. Nell'ultimo decennio, diversi miRNA sono stati correlati con l'inizio del cancro e lo sviluppo, che li rende utile clinici biomarcatori per la diagnosi, prognosi e terapia. Protetto da RNasi, Mirna sono presenti in una forma stabile nei liquidi biologici quali sangue, plasma, siero, urine e saliva, che ha portato ad un crescente interesse nel loro potenziale utilità nella pratica clinica10.
Nonostante questo, la valutazione della circolazione Mirna è un compito impegnativo e difficoltà per quanto riguarda la raccolta del campione, estrazione di destinazione, scelta della piattaforma e normalizzazione globale sono argomenti oggetto di accesi dibattiti all'interno della comunità scientifica.
Per la raccolta del campione e deposito, variabili pre-analitiche sono strettamente legate al plasma manipolazione e trasformazione. Ci siamo concentrati su campioni di plasma, piuttosto che del siero, dato che ci sono ampie prove di più alte concentrazioni di miRNA in quest'ultimo, possibilmente dovuto il rilascio di queste molecole durante il processo della coagulazione10,11,12 . Per risolvere il problema del rilascio di acidi nucleici cellulari derivanti da lisi delle cellule del sangue, abbiamo centrifugato i campioni entro 2 h dalla raccolta di sangue. Abbiamo anche usato provette con EDTA K3E perché altri anticoagulanti sono conosciute per interferire con passaggi di amplificazione (cioè, eparina) e possono scatenare emolisi (cioè, citrato). Come è fondamentale per evitare la contaminazione delle piastrine e dei linfociti nella fase pre-analitica, abbiamo rimosso il plasma dal tubo molto lentamente e non ha fatto aspirare l'ultima ~ 50 µ l di campione dal tubo.
Vari studi hanno dimostrato la superiorità dei metodi di estrazione basata su colonne sopra guanidina fenolo/cloroformio protocolli11,13, ma Khoury et al efficacemente isolato buona qualità piccoli RNA dal siero utilizzando tale reagenti senza contaminazione14. Il kit commerciale che abbiamo usato in sequenza esegue entrambi i metodi di estrazione, permettendo rendimenti di miRNA adatto in termini di concentrazioni di picco. Abbiamo effettuato solo una modifica per quanto riguarda le istruzioni del produttore, vale a dire, collezione fresca tubi sono stati utilizzati sempre dopo ogni fase di lavaggio cartuccia filtro per eliminare/ridurre il rischio di contaminazioni. Al fine di identificare la migliore concentrazione di spike-nei nostri campioni e quindi evitare interferenze con le reazioni successive, abbiamo effettuato prima l'intero protocollo senza aggiungere il cel-miR-39 durante la fase di estrazione per valutare i livelli di espressione mediana di i nostri obiettivi. Abbiamo quindi effettuato de novo miRNA estrazione da campioni di plasma del paziente stesso utilizzando una diluizione seriale di cel-miR-39 per identificare la concentrazione migliore da aggiungere per i campioni di plasma della nostra serie di caso (Figura 4). Si deve, tuttavia, essere sottolineato che la concentrazione ottimale di cel-miR-39, identificata per un solo campione, non può necessariamente essere la migliore concentrazione per la serie nel complesso caso a causa di una serie di variabili interne come le abitudini di vita, sesso o età, che potrebbe influenzare l'espressione dei miRNA assoluta all'interno del sangue.
amplificazione e trascrizione d'inversione miRNA rappresentano 2 fasi critiche. Delle due tecniche principali per la rilevazione di miRNA (ovvero,., qRT-PCR e microarray), abbiamo scelto qRT-PCR, data la sua elevata sensibilità e la nostra necessità di valutare solo un gruppo selezionato di Mirna (una limitazione importante di questa metodologia è la sua bassa velocità effettiva)15. Abbiamo usato chimica di trascrizione inversa basato su sequenze 3' polyA tailing e 5' legatura adattatore per estendere il miRNA maturo e permesso di appaiamento dei primer RT universale. Basato sul singolo riconoscimento di base-accoppiamenti, l'adattatore di legatura 5' potrebbe contribuire ad per evitare pregiudizi comuni come quelle legate alla mancata corrispondenza di 5'. Questo kit include anche un passaggio di pre-amplificazione che è necessario per i campioni di basso rendimento, ad esempio al plasma. Sebbene sia necessario, questo passaggio potrebbe introdurre alcuni pregiudizi di amplificazione prima della fase di rilevazione.
In questo protocollo, abbiamo analizzato un panel di miRNA selezionati 24 correlato con l'angiogenesi. In particolare, abbiamo scelto piatti su ordinazione sonda pre-macchiato e seguite le istruzioni del produttore per i funzionamenti di qRT-PCR. Le questioni principali relative alla miRNA qRT-PCR sono la scelta dei geni di riferimento e loro normalizzazione di analisi di dati successivi.
Anche se numerosi studi sono stati condotti per identificare il miRNA migliore da utilizzare per la normalizzazione, non è stato raggiunto alcun consenso uniforme. Per risolvere questa limitazione, abbiamo effettuato una ricerca di letteratura per identificare i miRNA circolanti che possono essere utilizzati come geni di riferimento nella nostra serie di caso.
Abbiamo anche selezionato i 4 Mirna con forte espressione stabile in campioni di plasma da pazienti mCRC e li testati in una più piccola parte della nostra serie di caso. I miRNA più stabili 2 sono stati identificati dall'analisi di GeNorm come riferimento geni housekeeping.
In conclusione, la valutazione di Mirna in campioni di sangue periferici di circolazione ha un numero di note difficoltà. Tuttavia, riteniamo che le metodologie che abbiamo usato sono affidabili e robusti, consentendo per uno studio approfondito e accurato di questi biomarcatori che hanno il potenziale per cambiare lo scenario di trattamento per il cancro colorettale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.
Acknowledgments
Questo studio è stato parzialmente finanziato da Roche s.p.a. e l'agenzia italiana di farmaci (AIFA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1,000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
- Luo, H. -Y., Xu, R. -H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
