Summary
Presentamos un protocolo para evaluar los niveles de expresión de microRNAs (miRNAs) que circulan en las muestras de plasma de pacientes con cáncer. En particular, se utilizó un kit disponible comercialmente para la extracción de miRNA y transcripción reversa de la circulación. Por último, hemos analizado un panel de 24 miRNAs seleccionados usando las placas personalizadas de sonda previamente manchado en tiempo real.
Abstract
Existe un creciente interés en líquido biopsia para el diagnóstico de cáncer, el pronóstico y el seguimiento terapéutico, creando la necesidad de marcadores biológicos confiables y útiles para la práctica clínica. Aquí, presentamos un protocolo para extraer, retroceso transcribir y evaluar los niveles de expresión de miRNAs de muestras de plasma de pacientes con cáncer colorrectal (CCR) de circulación. microRNAs (miRNAs) son una clase de RNAs no codificantes de 18-25 nucleotides en longitud que regulan la expresión de genes diana a nivel traduccional y juegan un papel importante, incluyendo el de la función de pro - y anti-angiogénicos, en la fisiopatología de varios órganos. miRNAs son estables en fluidos biológicos como el suero y el plasma, que los hace ideal circulación biomarcadores para cáncer diagnóstico, pronóstico y tratamiento la toma de decisiones y monitoreo. Extracción de miRNA de circulación se realizó mediante un método rápido y eficaz que consiste en métodos orgánicos y basados en la columna. Para miRNA retrotranscripción, se utilizó un procedimiento de múltiples paso que considera poliadenilación en 3' y la ligadura de un adaptador a 5' de los miRNAs maduros, seguido de pre-amplificación miRNA al azar. Seleccionamos un panel personalizado 24-miRNA a prueba por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) y vistos los sondeos miRNA en placas personalizadas de matriz. Se realizaron carreras de placa de qRT-PCR en un sistema de PCR en tiempo real. Limpieza miRNAs de normalización fueron seleccionados utilizando el software GeNorm (v. 3.2). Los datos se analizaron utilizando el software de la suite de expresión (v 1.1) y se realizaron análisis estadísticos. El método demostró para ser confiable y técnicamente robusto y puede ser útil para evaluar los niveles de biomarcadores en muestras líquidas como el plasma o suero.
Introduction
CRC representa la tercera más frecuentemente diagnosticada la malignidad y la cuarta causa de muerte relacionada con cáncer en todo el mundo. Hasta la fecha, (B) el bevacizumab, un anticuerpo monoclonal dirigido contra el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y (C) el cetuximab o panitumumab (P), anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), han sido aprobados para tratamiento de primera línea en combinación con regímenes de quimioterapia (CT).
Las mutaciones en los genes K-ras y N-RAS son los biomarcadores clínicamente útiles sólo capaces de identificar pacientes que tienen menos probabilidades de beneficiarse de las CT basadas en anti-EGFR Aunque se han realizado varios estudios para buscar biomarcadores que son predictores de respuesta al TC de B, todavía hay una falta importante de drogas eficaces y confiables para su uso en la práctica clínica1.
miRNAs son RNAs pequeños (18-25 nucleotides en longitud) que regulan la traducción de genes diana y desempeñan un papel crucial en numerosos procesos fisiopatológicos, incluyendo la embriogénesis y la carcinogénesis. Estas moléculas son muy estables en fluidos biológicos como el plasma, suero, orina y esputo, que los hace robustos biomarcadores para muestreo no invasivo2. Usando un panel de miRNAs involucrados en la vía angiogénica, se procuró identificar circulando nuevos biomarcadores capaces de predecir el resultado clínico en pacientes con CCR metastático (mCRC) tratados con un régimen de CT basados en B.
Hemos analizado una serie de 52 mCRC pacientes tratados con CT B basado en el prospectivo multicéntrico aleatorizado fase III ensayo "italiano prueba en avanzado cáncer colorrectal" (ITACa). El presente Protocolo fue aprobado por el Comité de ética Local (Comitato Etico área Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo por lo dei de Studio e la Cura Tumori (IRST) IRCCS, Nº 674) en 19th septiembre de 2007. Todos los pacientes dieron consentimiento informado antes de la recogida de muestras de sangre. Para cada paciente, se recogieron muestras de sangre venosa antes del tratamiento y en la primera evaluación clínica (después de 8 semanas) para evaluar la expresión del miRNA de línea de base y su modulación durante el tratamiento en relación con los resultados de los pacientes.
A través de una búsqueda de la literatura, se seleccionaron 21 miRNAs correlacionados con el proceso angiogénico que son conocidos por ser detectable en el plasma humano: p ha-miR-107, ha-miR-126-3, ha-miR-145-5 p, p ha-miR-194-5, ha-miR-199a - 5p, ha-miR-200b - 3P, ha-miR-20b - 5p , ha-miR-21-5 p, p ha-miR-210-3, ha-miR-221-3 p, p ha-miR-24-3, p ha-miR-27a - 3P, ha-miR-29b - 3P, ha-miR-335-5, p ha-miR-424-5, ha-miR-497-5 p, p ha-miR - 520d - 3P, ha-miR-92a - 3P, ha-miR-17-5 y ha-miR-155-5 p. También seleccionamos p ha-miR-223-3 y ha-mir-484 para normalización endógena3,4,5,6y cel-miR-39 purificaron de C. elegans como un punto de normalización exógeno. Normalizar los datos se realizaron utilizando el método de ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
La detección de circulación miRNAs presenta algunas dificultades técnicas porque las moléculas están presentes en niveles muy bajos en el plasma y su amplificación es químicamente un desafío dada su secuencia corta. Por estas razones, hemos seleccionado un procedimiento que considera la extracción orgánica con fenol y una metodología basada en la columna de fibra de vidrio. Extracción de miRNA de circulación es un tema candente en el área de líquido biopsia, y seleccionamos un kit comercial que ha demostrado ser uno de los más confiables en términos de cantidad y calidad de rendimientos recuperados7,8. Hemos seleccionado un protocolo para invertir transcriba miRNAs por la adición de un adaptador en 5' y una cola de poly(A) a 3' de lo miRNA maduro para mejorar la selectividad y especificidad de la reacción.
Dada la robustez del método, diseñamos personalizadas platos con sondas previamente manchadas para RT-PCR evaluar cada muestra por duplicado y análisis a 2 pacientes dentro de cada placa, como se muestra en la figura 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: Realizar todos los pasos siguientes bajo una campana de humos esterilizados según buenas prácticas de laboratorio (BPL).
1. almacenamiento y recogida de plasma
- Recoger 3 mL de muestra de sangre periférica en un tubo de EDTA K3E.
- Centrifugar el tubo a temperatura ambiente en 1.880 x g durante 15 minutos.
- Recupera el plasma sobrenadante en alícuotas de 450 μl.
- Almacenar las muestras a-80 ° C hasta su uso.
Nota: Proceso del tubo de sangre periférica dentro de las 2 h de colección. Cuando se recupera el plasma del tubo, no molestes a la capa de linfocitos.
2. extracción de circulación miRNAs de muestras de Plasma (tabla de materiales)
-
Preparar todas las soluciones necesarias y descongelar las muestras para los pasos de extracción.
- Añadir 375 μl de 2-Mercaptoetanol a la solución de x denaturating 2 y mezclar bien.
- Agregar 21 mL de etanol al 100% grado ACS a la solución de lavado miRNA I y mezcla bien.
- Añadir 40 mL de etanol al 100% grado ACS a la solución de lavado 2/3 y mezclar bien.
- Permiten un plasma alícuota a descongelar a temperatura ambiente y luego comenzar los pasos de extracción.
-
Extracción orgánica
- Transfiera 400 μL de la muestra de plasma en un tubo de 2 mL libre de Rnasa.
- Añadir 400 μL de solución de x denaturating 2, mezclar por Vortex y centrifugar brevemente.
- Añadir 4 μL de 1 nM punto, mezclar por Vortex y centrifugar brevemente.
- Añadir 800 μl de ácido fenol-cloroformo.
- Vórtice de 60 s y centrifugar a máxima velocidad (≥10, 000 x g) durante 15 minutos.
- Transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo. No molestes a la interfase. Nota el volumen recuperado y descartar el tubo que contiene la fase no-acuoso.
Nota: 2 x solución de desnaturalización se almacena a 4 ° C y puede solidificar a esta temperatura. Antes de usar, caliente la solución a 37 ° C, agitando de vez en cuando durante 10-15 minutos procure retirar la fase inferior que contiene el ácido fenol-cloroformo, no el buffer acuoso que se encuentra encima de la mezcla. Precalentar la solución de elución o agua libre de nucleasas hasta 95 ° C. Tenga cuidado al calentar un volumen adecuado de solución (100 μl por muestra + 10% de exceso).
-
Enriquecimiento de RNA pequeños
- Añada 1/3 volumen de etanol 100% a la fase acuosa del paso 2.2.6 y mezcle bien.
- Coloque un cartucho de filtro en un tubo de la colección nueva para cada muestra.
- Transferencia de hasta 700 μl de lisado de paso 2.3.1 y etanol en el cartucho del filtro y centrifugar a 10.000 x g durante 30 s.
- Si hay > 700 μl de mezcla de izquierda, colocar el filtrado en un tubo nuevo y repita el paso 2.3.3; Repita hasta que la mezcla ha pasado a través del cartucho de filtro.
- Medir el volumen total del paso.
- Añadir 2/3 volumen de etanol 100% a filtrar y mezclar bien.
- Colocar un segundo cartucho de filtro en un tubo de recogida fresca.
- Transferencia de hasta 700 μl de volumen de la muestra en el cartucho y centrifugar a 10.000 x g durante 30 s. descarte el flujo a través.
- Repita el paso 2.3.8 hasta que la mezcla ha pasado a través del cartucho de filtro.
- 700 μl de solución de lavado miRNA 1 se aplica al cartucho de filtro y centrifugue el cartucho del filtro con el tubo de la colección a 10.000 x g durante 15 s. descarte el flujo a través. Coloque el cartucho en el mismo tubo de la colección.
- Aplicar 500 μl de solución de lavado 2/3 para el cartucho del filtro y centrifugue el cartucho del filtro con el tubo de la colección a 10.000 x g para descartar s. 15 el flujo a través. Coloque el cartucho del filtro en un tubo de colección fresca.
- Coloque el cartucho del filtro en un tubo de colección fresca y repetir el paso 2.3.11 con 500 μl de solución de lavado 2/3. Deseche el flujo a través y transfiera el cartucho del filtro a un tubo de colección fresca.
- Centrifugar los tubos con los cartuchos de filtro a 10.000 x g durante 1 minuto.
- Transfiera el cartucho del filtro en un tubo de colección de frescos 1,5 mL y añadir 100 μl de solución de elución de precalentado (95 ° C) o agua libre de nucleasa.
- Centrifugar a 10.000 x g durante 30 s para recuperar miRNAs y almacenar a-80 ° C.
Nota: Se puede formar un precipitado blanco en la solución de lavado 2/3. Se trata de exceso EDTA liberado de la solución. Evitar la elaboración de estos cristales durante los pasos de pipeteo.
3. realizar la transcripción inversa y miRNA pre-amplificación (tabla de materiales)
-
Realizar la reacción de poliadenilación
- Descongelar todos los reactivos en el hielo, y luego brevemente vortex y centrifugar a girar hacia abajo el contenido. Además, el deshielo 50% PEG 8000, lo que le permite alcanzar la temperatura ambiente.
- Preparar la mezcla de reacción en un tubo de centrífuga 0.5ml, obteniendo un volumen final de 3 μl de reacción cóctel para cada muestra. Utilice los siguientes volúmenes, además de volumen exceso de 10% para cada reactivo.
- Agregar 1,7 μl de agua libre de ARNasa, 0.5 μl de 10 x tampón Poly(A), 0.5 μl de 10 mM ATP y finalmente 0,3 μl 5 U/μl PolyA enzima.
- Brevemente vortex y centrifugar la mezcla cocktail a girar hacia abajo el contenido.
- Transferencia de 2 μl de la muestra a cada pocillo de la placa de reacción o tubo de ensayo y agregar 3 μl de la reacción de cóctel. Brevemente vortex y centrifugar a girar hacia abajo el contenido.
- Coloque los placa y tubos en un termociclador y realice los pasos siguientes.
- Incubar a 37 ° C por 45 minutos (paso de poliadenilación).
- Incubar a 65 ° C durante 10 minutos (parada de la reacción), con un asimiento siguiente a 4 ° C.
-
Realizar la reacción de ligadura.
- Preparar la mezcla de reacción en un tubo de centrífuga con los siguientes volúmenes para cada muestra y el 10% del volumen en exceso.
- Agregar 0,4 μL de agua libre de ARNasa, 3 μl de 5 x buffer ligasa de ADN, 0,6 μl de 25 x adaptador ligadura, 4.5 μl 50% PEG 8000 y finalmente 1.5 μl de ligasa de RNA.
- Brevemente vortex y centrifugar la mezcla cocktail a girar hacia abajo el contenido.
- Añadir 10 μl de la mezcla a cada tubo de reacción bien poly(A) el producto relave. Mezcle por un vibrador de placa a 1.900 rpm durante 1 min o vórtex brevemente y giro de los contenidos.
- Colocar los tubos de la placa, reacción en un termociclador con los ajustes siguientes: incubación a 60 º C durante 60 min, con los siguientes mantener a 4 ° C.
Nota: 50% PEG 8000 es altamente viscoso. Utilizar a temperatura ambiente, aspiración y dispensación lentamente. Después de cada aspiración y dispensación de paso, mantener el condensador de 10 s para permitir que el reactivo a fluir hacia arriba y hacia abajo.
-
Realizar la reacción de transcripción reversa.
- Preparar la mezcla de reacción en un tubo de centrífuga, con los siguientes volúmenes para cada muestra y el 10% del volumen en exceso.
- Añadir 3,3 μl de Rnasa agua, 6 μl de 5 x buffer de RT, 1,2 μl de dNTP mix (25 mM), 1,5 μl de 20 x primers universales RT y finalmente 3 μl de 10 x mezcla de enzimas RT.
- Brevemente vortex y centrifugar la mezcla cocktail a girar hacia abajo el contenido.
- Añada 15 μl de la mezcla a cada tubo de reacción así que contiene el producto de la ligadura. Mezcle por un vibrador de placa a 1.900 rpm durante 1 min o vórtex brevemente y giro de los contenidos.
- Lugar la reacción de placa de tubos en un termociclador con los siguientes ajustes.
- Incubar a 42 ° C por 15 min (transcripción inversa).
- Incubar a 85 ° C durante 5 minutos (parada de la reacción), con un asimiento siguiente a 4 ° C.
Nota: El producto RT ahora puede ser almacenado a-20 ° C y permanecerá estable hasta 2 meses.
-
Realizar la reacción de miR-Amp (tabla de materiales).
- Preparar la mezcla de reacción en un tubo de centrífuga con los siguientes volúmenes para cada muestra y el 10% del volumen en exceso.
- Añadir 17.5 μl de agua libre de ARNasa, 25 μl de la mezcla principal de miR-Amp 2 x y 2.5 μl de 20 x mezcla de primer miR-Amp.
- Brevemente vortex y centrifugar la mezcla cocktail a girar hacia abajo el contenido.
- Para cada muestra, transferencia de 45 μl de la mezcla de reacción a cada pocillo de una placa nueva de reacción o un tubo de reacción. Añadir 5 μl del producto de RT a cada tubo de pozo o de la reacción. Mezcle por un vibrador de placa a 1.900 rpm durante 1 min o vórtex brevemente y giro de los contenidos.
- Lugar la reacción de placa de los tubos en un termociclador y ejecutar como se muestra en la tabla 1.
4. realizar la PCR en tiempo real
- Diluir cada cDNA muestra 1:10 en tampón de TE x 0,1.
- Calcular el número de pozos/repeticiones para cada muestra. Preparar la mezcla de reacción en un tubo de centrífuga con los siguientes volúmenes para cada muestra, agregar 10% de volumen en exceso.
- Añadir 4 μL de agua libre de ARNasa, 10 μl de 2 x rápido avanzado master mix (Tabla de materiales) y finalmente 5 μl de cDNA diluido.
- Mezclar por Vortex y centrifugar brevemente para girar por el contenido.
- Transferencia de 19 μl de mezcla de reacción para cada bien, sellar la placa y centrifugar brevemente.
- Realizar el protocolo térmico (tabla 2) en un sistema de RT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hemos analizado un panel de miRNAs circulantes relacionados con la angiogénesis en relación con la supervivencia libre de progresión (PFS), general supervivencia y respuesta objetiva tarifa (ORR) en un mCRC 52 pacientes tratados con base B CT. La evaluación de estos biomarcadores en muestras de plasma es un reto debido a dificultades técnicas. Utilizamos métodos establecidos para la extracción de miRNA de las muestras de plasma paciente, transcripción inversa y amplificación previa. Siguiendo las instrucciones del fabricante y con sólo algunas modificaciones requeridas, especialmente en los pasos de extracción, se evaluaron con éxito todos nuestros objetivos en la población de pacientes (figura 2).
En particular, hemos analizado 2 muestras de paciente y el plasma, la correlación de línea de base y expresión de miRNA terapia modificada con los resultados de los pacientes.
Se realizaron diluciones seriadas de cel-miR-39 a 0.05 nM 0,5 nM, 5nM y 17:00 en 800 μl de plasma de la muestra (400 μL de plasma plus 400 μL de solución 2 x denaturating) para determinar la concentración pico en utilizar. Como se muestra en la figura 4, el control exógeno mostró ciclo umbral valores (Ct) que eran congruentes con las diluciones seriadas, lo que indica la robustez del protocolo entero (es decir, extracción, transcripción inversa y la evaluación de qRT-PCR). Por otra parte, estas diluciones seriadas nos permitieron seleccionar la concentración de spike que no interfiriera con la reverso-transcripción de los miRNAs de destino.
Este método nos permitió correlacionar los miRNAs de línea de base con características clínicas patológicas. En particular, encontramos que ha-miR-199a - 5p, p ha-miR-335-5 y ha-miR - 520d - 3P fueron significativamente upregulated en lado izquierdo con respecto a las lesiones de lado derecho (p = 0.03, p = 0,006 y p = 0.008, respectivamente). Por el contrario, ha-miR-21-5 p fue significativamente regulada en pacientes mutados de RAS (K-RAS, p = 0.01 y N-RAS, p = 0.008), mientras que p ha-miR-221-3 era upregulated (p = 0.05, p = 0.01, K - y N-RAS, respectivamente).
Comparando los niveles de expresión de miRNA entre línea base y la primera evaluación clínica, se observó que un aumento en los niveles de expresión de p ha-miR-155-5 se asoció con PFS más corta (p = 0,04) y OS (p = 0,02). En particular, en pacientes con un aumento de ≥30% en ha-miR-155-5p, PFS fue de 9,5 meses (IC del 95%: 18,7 6,8) y OS fue de 15,9 meses (IC del 95%, 8.4-no alcanzado) en comparación con 22,3 meses (IC del 95%, 25.5 10.2) y 42,9 meses (IC del 95%, 24.8-no alcanzado) para aquellos con un < 30% aumento (figura 3). El valor promedio de la variación en la serie de casos (30%) se estableció como el punto de corte. Niveles circulantes basales de miRNAs se dicotomiza en "alta" o "baja" según valores medianos9.
Figura 1: diseño de maquetación personalizada placa. Las puntas de prueba fueron previamente manchados en cada pozo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: ejemplos de diagramas de qRT-PCR amplificación. Parcela (A) amplificación de una placa personalizada solo qRT-PCR. Todos los marcadores fueron evaluables en ambas muestras de la placa única. (B) qRT-PCR de p ha-miR-17-5 en la serie del caso general. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: resultados experimentales y clínicos en relación con p. ha-miR-155-5 Valores de (A) TC ha-miR-155-5 p. Diagrama de amplificación de p ha-miR-155-5 en la serie del caso general. (B) SLP y la SG de pacientes con un ≥30% o < 30% de aumento en la circulación de p ha-miR-155-5. PFS se calculó como el tiempo desde la fecha de aleatorización hasta la fecha de la primera evidencia documentada de progresión tumoral, la última evaluación del tumor o la muerte en la ausencia de progresión de la enfermedad. OS se calculó como el tiempo desde la fecha de aleatorización hasta la fecha de la muerte de cualquier causa o de la carta recordativa pasada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: dilución seriada de resultados experimentales forcel-miR-39. (A) qRT-PCR para diluciones seriadas de cel-miR-39, con relativa (B) Cts. las diluciones se realizaron en 5 nM, 0,5 nM, 0,05 nM y 17:00 en las muestras de plasma del mismo paciente. Tal linealidad análisis nos permitió seleccionar la mejor concentración para usar en la serie de casos en general. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Paso | Temperatura | Duración | Ciclos de |
| Activación enzimática | 95 ° C | 5 min | 1 |
| Desnaturalizar | 95 ° C | 3 s | 14 |
| Recocido/ampliar | 60 ° C | 30 s | |
| Detener la reacción | 99 ° C | 10 min | 1 |
| Mantenga | 4 ° C | Mantenga | ∞ |
Tabla 1: Protocolo térmico de reacción mir-AMP.
| Paso | Temperatura | Duración | Ciclos de |
| Activación enzimática | 95 ° C | 20 s | 1 |
| Desnaturalizar | 95 ° C | 1 de 1 | 40 |
| Recocido/ampliar | 60 ° C | 30 s | |
| Mantenga | 4 ° C | Mantenga | ∞ |
Tabla 2: Protocolo térmico de qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
miRNAs son pequeños no-codificación RNAs (18-25 nucleotides en longitud) capaces de atar la región 3' UTR de su objetivo de ARN mensajero e inhibiendo o lo degradantes. Así se pueden considerar los reguladores de expresión génica a nivel traduccional. En la última década, varios miRNAs se han correlacionado con cáncer iniciación y desarrollo, haciéndolos útiles biomarcadores clínicos para el diagnóstico, pronóstico y terapia. Protegido por RNasas, miRNAs están presentes en una forma estable en fluidos biológicos como sangre, plasma, suero, orina y saliva, que ha llevado a un creciente interés por su posible utilidad en práctica clínica10.
A pesar de ello, la evaluación de miRNAs de circulación es una tarea difícil y dificultades con respecto a la recogida de muestras, extracción de objetivo, elección de plataforma y normalización global son temas muy debatidos dentro de la comunidad científica.
Para recogida de muestras y almacenamiento, variables pre analíticas están estrechamente vinculadas al manejo y procesamiento de plasma. Nos hemos centrado en las muestras de plasma en lugar de suero dado que hay amplia evidencia de altas concentraciones de miRNA en el último, posiblemente debido a la liberación de estas moléculas durante la coagulación proceso10,11,12 . Para abordar la cuestión de la liberación de los ácidos nucleicos celulares derivados de lisis de células de la sangre, centrifugaron las muestras dentro de las 2 h de recogida de sangre. También utilizamos tubos EDTA K3E porque otros anticoagulantes son conocidos por interferir con pasos de amplificación (por ejemplo, heparina) y pueden provocar hemólisis (es decir, citrato). Es fundamental para evitar la contaminación de plaquetas y linfocitos en la fase pre analítica, nos quita el plasma del tubo muy lentamente como no aspirar el último ~ 50 μl de la muestra del tubo.
Diversos estudios han demostrado la superioridad de los métodos de extracción basados en columna sobre protocolos de guanidina/fenol/cloroformo basado en11,13, pero Khoury et al. efectivamente aislado buena calidad pequeño RNAs del suero usando tales reactivos sin contaminación14. El kit comercial que utilizamos secuencialmente realiza ambos métodos de extracción, permitiendo miRNA adecuados rendimientos en términos de concentraciones de spike. Sólo realizamos una modificación con respecto a las instrucciones del fabricante, es decir, tubos de frescos fueron utilizados siempre después de cada etapa de lavado del cartucho de filtro para eliminar/reducir el riesgo de contaminación del reactivo. Con el fin de identificar el mejor punto en concentración en nuestras muestras y así evitar interferir en las reacciones posteriores, primero realizamos el protocolo entero sin agregar el cel-miR-39 durante la etapa de extracción para evaluar los niveles de expresión media de nuestros objetivos. Luego realizamos la extracción de miRNA de novo de las muestras de plasma del mismo paciente utilizando una dilución seriada de cel-miR-39 para identificar la mejor concentración para agregar a las muestras de plasma de nuestra serie de casos (figura 4). Sin embargo, se subraya que la concentración óptima de cel-miR-39, para sólo una muestra, puede no necesariamente ser la mejor concentración de la serie en general caso debido a una serie de variables internas tales como los hábitos de vida, género o edad, que podría influir en absoluto miRNA expresión en sangre.
miRNA de transcripción inversa y amplificación representan pasos críticos 2. De las dos principales técnicas para la detección de miRNA (es decir., qRT-PCR y microarrays), optamos por qRT-PCR dada su alta sensibilidad y la necesidad de evaluar sólo un grupo seleccionado de miRNAs (una limitación importante de esta metodología es su bajo rendimiento)15. Utilizamos química reversa de la transcripción basado en 3' polyA colas 5' ligadura adaptador secuencias y extender lo miRNA maduro y permiso de recocido de cebadores universales de RT. Basada en el reconocimiento de pares de base única, el adaptador de ligadura 5' podría ayudar a evitar sesgos comunes como aquellos vinculados a 5' desajuste. Este kit también incluye un paso de amplificación previa que se requiere para muestras de bajo rendimiento, tales como plasma. Aunque necesario, este paso podría introducir algunos sesgos de amplificación antes de la etapa de detección.
En este protocolo, hemos analizado un panel de 24 miRNAs seleccionados con angiogénesis. En particular, elegimos placas personalizadas sonda previamente manchado y había seguido las instrucciones del fabricante para los funcionamientos de qRT-PCR. Las principales cuestiones relativas a miRNA qRT-PCR son la elección de los genes de referencia y su normalización de análisis de datos posteriores.
Aunque se han realizado numerosos estudios para identificar la mejor miRNA para normalización, se ha alcanzado ningún consenso uniforme. Para solucionar esta limitación, se realizó una búsqueda bibliográfica para identificar los miRNAs circulante que puede ser utilizado como genes de referencia en nuestra serie de casos.
También seleccionamos los 4 miRNAs con fuerte evidencia de expresión estable en muestras de plasma de pacientes mCRC y había probado en una parte más pequeña de nuestra serie de casos. Los miRNAs más estables 2 fueron identificados por análisis de GeNorm como referencia genes housekeeping.
En conclusión, la evaluación de la circulación de miRNAs en muestras de sangre periférica tiene una serie de dificultades conocidas. Sin embargo, creemos que las metodologías que utilizamos son fiables y robustos, lo que permite un estudio profundo y exacto de estos biomarcadores que tienen el potencial para cambiar el escenario de tratamiento para el cáncer colorrectal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.
Acknowledgments
Este estudio fue parcialmente financiado por Roche S.p.A. y la agencia italiana de medicamentos (AIFA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1,000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
- Luo, H. -Y., Xu, R. -H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
