Summary
우리는 암 환자에서 플라즈마 샘플에 예측에 관한 (miRNAs) 순환의 식 수준을 평가 하는 프로토콜을 제시. 특히, 우리는 순환 미르 추출 및 반전 녹음 방송에 대 한 상용 키트를 사용 합니다. 마지막으로, 우리는 실시간으로 미리 발견된 프로브 사용자 지정 접시를 사용 하 여 24 선택한 miRNAs의 패널 분석.
Abstract
거기는 증가 액체 생 검 암 진단, 예 후 및 치료 모니터링에 대 한 관심이 임상 연습을 위한 안정적이 고 유용 생체에 대 한 필요성을 만들기. 여기, 선물이 추출, 프로토콜 반전 녹음 하 고 환자 대 장 암 (CRC)의 플라즈마 샘플에서 miRNAs 순환의 식 수준 평가. microRNAs (miRNAs)는 변환 수준에서 대상 유전자의 표정을 통제 하 고 중요 한 역할의 physiopathology에서 프로 및 안티 신생 함수를 포함 하는 길이 18-25 뉴클레오티드의 비 코딩 RNAs의 클래스 다양 한 기관입니다. miRNAs는 혈 청 및 플라즈마, 암 진단, 예 후 및 치료 결정에 대 한 생체 순환 고 모니터링 그들을 렌더링 같은 생물 학적 체액에 안정. 미르 추출 순환 유기 및 열 기반 방법론 관련 된 신속 하 고 효과적인 방법을 사용 하 여 수행 되었다. MiRNA retrotranscription, 고려에서 3' 5 ' 뒤에 임의의 미르 사전 증폭 성숙한 miRNAs의 어댑터의 결 찰 polyadenylation 멀티 단계 절차를 사용 했습니다. 우리 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 시험 될 24-미르 사용자 패널을 선택 하 고 배열 사용자 지정 접시에 미르 프로브를 발견. 우리는 실시간 PCR 시스템에서 실행 되는 qRT-PCR 플레이트를 수행. 정규화에 대 한 가사 miRNAs (3.2) 대 GeNorm 소프트웨어를 사용 하 여 선정 됐다. 데이터 식을 스위트 소프트웨어 (v 1.1)을 사용 하 여 분석 했다 고 통계 분석을 수행 했다. 메서드는 안정적이 고 기술적으로 강력한 것을 입증 하 고 플라즈마 혈 청 등 액체 샘플의 바이오 마커 수준 평가에 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
CRC 나타냅니다 3 가장 자주 악성 종양 및 암 관련 된 죽음은 전세계의 4 번째 원인 진단. 날짜 하려면, bevacizumab (B), 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), cetuximab (C) 또는 panitumumab (P), 단일 클론 항 체 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR)에 대 한 감독에 대 한 감독 단일 클론 항 체 승인에 대 한 첫 번째 라인 치료 (CT) 화학요법 식이요법과 함께.
K-RAS 및 N-RAS 유전자에 있는 돌연변이 유일한 임상적으로 유용한 생체 혜택 EGFR 기반 시작 안티 코네티컷에서 같다 적어도 환자 식별 가능 비록 B 기반 CT에 대 한 응답의 예측은 생체에 대 한 검색을 여러 연구를 실시 했습니다, 아직 임상 실습1에서 사용 하기 위해 안정적이 고 효과적인 약물의 상당한 부족이 이다.
miRNAs는 대상 유전자의 번역을 통제 하 고 embryogenesis와 발암을 포함 하 여 수많은 physiopathological 프로세스에서 중요 한 역할을 하는 작은 RNAs (18-25 뉴클레오티드 길이에서). 이 분자는 혈장/혈 청, 소변,가 래, 비-침략 적 샘플링2에 사용할 강력한 생체 그들을 렌더링 등 생물 학적 체액에서 매우 안정 된. 우리 식별 하기 위한 신생 통로에 관련 된 miRNAs의 패널을 사용 하 여, B 기반 CT 처방으로 치료 새로운 전이성 CRC (mCRC)를 가진 환자에 있는 임상 결과 예측할 수 있는 biomarkers를 순환.
52의 시리즈 분석 무작위로 예비 multicenter 내 B 기반 CT로 치료 하는 mCRC 환자 단계 III 예 심 "이탈리아 재판에 고급 대 장 암" (ITACa). 현재 프로토콜 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (Comitato Etico 지역 Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo 당 소호 스튜디오 e 라 Cura 데이 Tumori (IRST) IRCCS, no. 674) 19회 2007 년 9 월에. 모든 환자는 혈액 샘플 수집 하기 전에 동의 했다. 각 환자에 대 한 정 맥 혈액 샘플 기준선 미르 식 및 환자 결과 관하여 치료 하는 동안 그것의 변조 치료 전과 (8 주) 후 첫 번째 임상 평가에서 수집 되었습니다.
문학의 검색을 통해 우리는 인간 플라스마에서 감지 것으로 알려져 있다 21 miRNAs 신생 프로세스와 상관을 선택: 있다-미르-107, 미르-126-3 p는-미르-145-5 p, 있다-미르-194-5 p, 있다-미르-199a-5 p, 있다-미르-200b-3 p, 있다-미르-20b-5 p 은-미르-21-5 p,-미르-210-3 p,-미르-221-3 p,-미르-24-3 p, 있다-미르-27a-3 p, 있다-미르-29b-3 p, 있다-미르-335-5 p, 있다-미르-424-5 p, 있다-미르-497-5 p, 있다-미르-520 d-3 p, 있다-미르-92a-3 p, 있다-미르-17-5 p는-미르-155-5 p. 우리는 또한-미르-223-3 p를 선택 하 고 있다-미르-484 생 정규화3,,45,6, 및 cel-미르-39 세 정규화에 스파이크도 C. 선 충 에서 정화. 모든 데이터 정규화 2 ̂ ̄(ΔΔCt) 메서드를 사용 하 여 수행 했다.
순환 miRNAs의 검출 분자 플라즈마에 매우 낮은 수준에서 존재 하 고 그들의 증폭은 화학적 도전 그들의 짧은 순서를 부여 하기 때문에 몇 가지 기술적인 어려움을 선물 한다. 이러한 이유로, 우리는 페 놀과 유기 추출 및 유리 섬유 열 기반 방법론을 고려 하는 절차를 선택. 미르 추출 순환 액체 생 검의 분야에서 뜨거운 주제 이며 우리가 선택 중 가장 신뢰할 수 있는 표시는 상업 키트 복구 된 수익률7,8의 품질과 금액. 우리는 반대 하는 프로토콜을 선택 miRNAs의 선택도 향상 시키기 위해 5'과 3 ' 성숙한 miRNA의 많은 꼬리에서 어댑터 추가 및 반응의 특이성에 의해 속기.
방법의 견고성을 감안할 때, 우리는 미리 발견 프로브 RT-PCR 중복에서 각 샘플을 평가 대 한 사용자 지정 접시를 설계 하 고 그림 1에서 보듯이 각 배지 내의 2 환자를 분석.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고: 모든 소독된 연기 후드 좋은 연구실 관행 (GLP)에 따라 다음 단계를 수행 합니다.
1. 플라즈마 수집 및 저장
- 3 mL K3E EDTA 튜브에 주변 혈액 샘플을 수집 합니다.
- 1880 x g 15 분 동안에 실내 온도에 튜브 원심
- 450 µ L의 aliquots에서 표면에 뜨는 플라즈마를 복구 합니다.
- 사용까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
참고: 말 초 혈 관 컬렉션의 2 시간 안에 처리 합니다. 튜브에서 플라즈마를 복구할 때 림프 구 레이어를 방해 하지 마십시오.
2. 플라즈마 샘플 (자료 테이블)에서 miRNAs 순환의 추출
-
모든 필요한 솔루션을 준비 하 고 녹여 추출 단계에 대 한 샘플.
- 2 x denaturating 솔루션 2-mercaptoethanol의 375 µ L을 추가 하 고 잘 혼합.
- 추가 ACS 학년 100% 에탄올의 21 mL 미르 세척 솔루션에 어 믹스 잘 합니다.
- 세척 솔루션 2/3를 ACS 학년 100% 에탄올 40 mL를 추가 하 고 잘 혼합.
- 플라즈마 aliquot 실 온에서 해 동 하 여 다음 추출 단계를 시작 하실 수 있습니다.
-
유기 추출
- RNase 무료 2 mL 튜브에 플라즈마 샘플의 400 µ L를 전송 합니다.
- 2 x denaturating 솔루션의 400 µ L을 추가 하 고 vortexing에 의해 혼합 짧게 원심.
- 1 nM 스파이크에서의 4 µ L을 추가 하 고 vortexing에 의해 혼합 짧게 원심.
- 산 페 놀-클로 프롬의 800 µ L를 추가 합니다.
- 60 s를 15 분에 대 한 최대 속도 (≥10, 000 x g)에서 원심 분리기와 동.
- 신선한 튜브를 위 수성 단계를 전송 합니다. Interphase는 방해 하지 마십시오. 참고 볼륨 복구 및 폐기 비 acqueous 단계를 포함 하는 관.
참고: 솔루션을 변성 시키기 x 2는 4 ° C에 저장 되며이 온도에서 응고 될 수 있습니다. 사용 하기 전에 따뜻한 37 ° c, 10-15 분 위해 때때로 agitating 솔루션 조심 포함 하는 산 성 페 놀-클로 프롬, 혼합물의 위에 속 인 다 acqueous 버퍼 하지 아래 단계를 철회 하는 것. 차입 솔루션 또는 95 ° c 물 nuclease 무료 예 열 열 솔루션 (샘플 + 10% 초과 당 100 µ L)의 적절 한 볼륨을 주의 해야 합니다.
-
작은 RNA 농축
- 2.2.6 단계에서 수성 단계로 에탄올 100%의 1/3 볼륨을 추가 하 고 철저 하 게 혼합.
- 각 샘플에 대 한 신선한 컬렉션 튜브에 필터 카트리지를 넣으십시오.
- 필터 카트리지 및 30에 대 한 10000 x g 에서 원심 분리기로 단계 2.3.1과 에탄올에서 lysate의 최대 700 µ L를 전송 s.
- 경우 > 왼쪽, 혼합물의 700 µ L는 filtrate에 신선한 튜브 고 반복 단계 2.3.3; 모든 혼합 필터 카트리지 통과 될 때까지 반복 합니다.
- 통해 흐름의 전체 볼륨을 측정 합니다.
- 여과 하 여 철저 하 게 혼합 에탄올 100%의 2/3 볼륨을 추가 합니다.
- 신선한 수집 관에서 두 번째 필터 카트리지를 놓습니다.
- 카트리지에 샘플 볼륨의 최대 700 µ L를 전송 하 고 흐름 통해 30 s. 폐기를 위해 10000 x g 에서 원심.
- 2.3.8 단계를 반복 하 여 모든 혼합 필터 카트리지를 통과 했다.
- 필터 카트리지를 미르 세척 솔루션 1의 700 µ L을 적용 하 고 흐름 통해 15 s. 폐기를 위해 10000 x g 에서 컬렉션 튜브 필터 카트리지를 원심. 동일한 컬렉션 튜브에 필터 카트리지를 놓습니다.
- 통해 흐름 필터 카트리지 및 분리기 필터 카트리지 10000 x g 에서 컬렉션 튜브 세척 솔루션 2/3의 500 µ L 15 미 삭제 신청. 신선한 수집 튜브에서 필터 카트리지를 놓습니다.
- 신선한 수집 튜브에서 필터 카트리지를 놓고 세척 솔루션 2/3의 2.3.11 500 µ L 단계를 반복 합니다. 통해 흐름 무시 하 고 신선한 컬렉션 튜브에 필터 카트리지를 전송.
- 1 분 동안 10000 x g 에서 필터 카트리지와 튜브 원심
- 신선한 1.5 mL 컬렉션 튜브로 필터 카트리지를 전송 하 고 데워 (95 ° C) 차입 솔루션 또는 nuclease 무료 물 100 µ L를 추가 합니다.
- 30에 대 한 10000 x g 에서 원심 분리기 miRNAs 복구-80 ° c.에 저장 하는 s
참고: 흰색 침전 세척 솔루션 2/3에에서 형성 수 있습니다. 이것은 초과 EDTA 솔루션에서 출시입니다. Pipetting 단계 동안 이러한 결정을 그리기 하지 마십시오.
3. 수행 반전 녹음 방송 그리고 미르 사전 증폭 (자료 테이블)
-
Polyadenylation 반응 수행
- 짧게 소용돌이 회전 원심 분리기 아래 내용을 다음 얼음, 모든 시 약을 녹여. 또한, 해 동 50% 말뚝 8000, 실내 온도 도달할 수 있도록.
- 0.5 mL 원심 분리기 튜브, 반응 각 샘플에 대 한 칵테일의 3 µ L의 최종 볼륨을 얻는 반응 혼합을 준비 합니다. 다음 볼륨 플러스 10% 초과 볼륨을 사용 하 여 각 시 약에 대 한.
- 추가 RNase 무료 물 1.7 µ L, 10 배 많은 버퍼의 0.5 µ L, 0.5 µ L의 10mm ATP, 그리고 마지막으로 0.3 µ L 5 U / µ L PolyA 효소.
- 짧게 소용돌이 원심 회전 칵테일 믹스 다운과 내용을.
- 반응 판 또는 반응 관의 각 음에 2 µ L의 샘플을 전송 하 고 칵테일 반응의 3 µ L를 추가 합니다. 짧게 소용돌이 회전 원심 분리기 다운과 내용을.
- 열 cycler에 접시/튜브를 놓고 다음 단계를 수행 합니다.
- 45 분 (polyadenylation 단계) 37 ° C에서 품 어.
- 10 분 (정지 반응), 65 ° C에서 4 ° c.에 다음 보류와 품 어
-
결 찰 반응을 수행 합니다.
- 각 샘플 및 초과에서 볼륨의 10%에 대 한 다음 볼륨 원심 분리기 튜브에 반응 혼합을 준비 합니다.
- RNase 무료 물 0.4 µ L, DNA 리가 버퍼, 결 찰 어댑터 x 25의 0.6 µ L, 50%의 4.5 µ L x 5의 3 µ L 추가 말뚝 8000 그리고 RNA 리가의 마지막 1.5 µ L.
- 짧게 소용돌이 원심 회전 칵테일 믹스 다운과 콘텐츠.
- 많은 미행 제품에 포함 된 각 잘/반응 관에 믹스의 10 µ L를 추가 합니다. 1 분에 1900 rpm에서 접시 통 또는 짧게 vortexing 및 내용 아래로 회전 혼합.
- 다음 설정 가진 열 cycler에 접시/반응 관 장소: 부 화 다음으로 60 분 동안 60 ° C에서 4 ° c.에서 개최
참고: 50% 말뚝 8000 높은 점성 이다. 실내 온도에, 발음 하 고 천천히 분배 사용 합니다. 각 포부와 분배 단계 후 10 plugger 잡고 아래로 흐름에 시 약을 허용 하는 s.
-
반전 녹음 방송 반응을 수행 합니다.
- 원심 분리기 튜브, 각 샘플 및 초과에서 볼륨의 10%에 대 한 다음 볼륨에에서 반응 혼합을 준비 합니다.
- 3.3 µ L의 RNase 무료 물, RT 버퍼, dNTP 믹스 (각 25 mM)의 1.2 µ L, 보편적인 RT 뇌관, x 20의 1.5 µ L x 5의 6 µ L RT 효소 혼합 x 10의 마지막 3 µ L를 추가 합니다.
- 짧게 소용돌이 원심 회전 칵테일 믹스 다운과 내용을.
- 각 잘/반응 관 결 찰 제품을 포함 하 게 믹스의 15 µ L를 추가 합니다. 1 분에 1900 rpm에서 접시 통 또는 짧게 vortexing 및 내용 아래로 회전 혼합.
- 다음 설정 사용 하 여 열 cycler에 접시/반응 튜브를 배치 합니다.
- 15 분 (반전 녹음 방송) 42 ° C에서 품 어.
- 5 분 (정지 반응), 85 ° C에서 4 ° c.에 다음 보류와 품 어
참고: RT 제품-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다 하 고 최대 2 개월까지 안정적으로 유지 됩니다.
-
미르-앰프 반응 (자료 테이블)을 수행 합니다.
- 각 샘플 및 초과에서 볼륨의 10%에 대 한 다음 볼륨 원심 분리기 튜브에 반응 혼합을 준비 합니다.
- RNase 무료 물 17.5 µ L, 2 x 미르 앰프 마스터 믹스의 25 µ L 및 미르 앰프 뇌관 믹스 x 20의 2.5 µ L를 추가 합니다.
- 짧게 소용돌이 원심 회전 칵테일 믹스 다운과 내용을.
- 각 샘플에 대 한 새로운 반응 플레이트 또는 반응 관의 각 음에 반응 혼합의 45 µ L을 전송 합니다. 각 잘 반응 관에 RT 제품의 5 µ L를 추가 합니다. 1 분에 1900 rpm에서 접시 통 또는 짧게 vortexing 및 내용 아래로 회전 혼합.
- 열 cycler에 접시/반응 튜브를 놓고 표 1에서 같이 실행 합니다.
4. 실시간 PCR을 수행
- 각 cDNA 샘플 1:10 0.1 x TE 버퍼에 희석.
- 각 샘플에 대 한 웰 스/복제의 수를 계산 합니다. 다음 볼륨 원심 분리기 튜브에 반응 혼합 초과에서 볼륨의 10%를 추가 하는 각 샘플에 대 한 준비.
- RNase 무료 물 4 µ L, 2 x 빠른 고급 마스터 믹스 (자료 테이블)의 10 µ L와 희석된 cDNA의 마지막으로 5 µ L를 추가 합니다.
- Vortexing에 의해 혼합 하 고 간단히 내용을 아래로 회전 원심.
- 각 잘 밀봉 하는 접시 고 짧게 원심 반응 혼합의 19 µ L를 전송 합니다.
- RT-PCR 시스템에 열 프로토콜 (표 2)를 수행 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
진행 성 자유로운 생존 (PFS) 관련 신생 관련 순환 miRNAs의 패널 분석, 전반적인 생존 (OS) 및 객관적인 응답 속도 (오 어) 52 mCRC 중부 B 기반으로 환자 치료에 플라즈마 샘플에서 이러한 바이오 마커의 평가 기술적인 어려움 때문에 도전 이다. 우리는 환자 혈장 샘플, 반전 녹음 방송 및 사전 증폭에서 미르 추출 설립된 메서드를 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라과 추출 단계에서 특히 요구 하는 몇 가지 수정만 우리가 성공적으로 우리의 모든 대상 환자 인구 (그림 2)를 평가 한다.
특히, 우리 2 분석 플라즈마 샘플/환자, 기준선과 치료 수정 미르 식 환자 결과와 연관.
우리가 cel-미르-39 0.05의 직렬 희석 수행, 0.5 nM, 5nM 및 플라즈마의 800 µ L에 5 오후에 (플라즈마의 400 µ L 더하기 2 x denaturating 솔루션의 400 µ L) 사용 하 여 스파이크에 농도 결정 하기 위해 샘플. 그림 4에서처럼 exogenous 제어 임계값 사이클 전체 프로토콜 (즉, 추출, 반전 녹음 방송 및 qRT-PCR 평가)의 견고성을 나타내는 직렬 희석 일치 했다 (코네티컷) 값을 보여주었다. 또한, 이러한 직렬 희석 사용 스파이크-농도 모든 대상 miRNAs의 반전 녹음 방송 방해 하지 것입니다를 선택 하.
이 메서드를 사용 하 여 임상 병리학 특징 기준 miRNAs 연관 수 있었습니다. 특히, 우리는 발견 했다-미르-199a-5 p, 있다-미르-335-5 p, 있다-미르-520 d-3 p 크게 upregulated에 왼쪽 오른쪽 양면 병 변 기준 면 (p = 0.03, p = 0.006, p = 0.008, 각각). 반대로, 있다-미르-21-5 p는 크게 downregulated RAS 변이 환자에서 (K-RAS, p 0.01 N-RAS, p = 0.008 =)-미르-221-3 p upregulated 반면, (p = 0.05, p = 0.01, K 및 N RAS, 각각).
우리는-미르-155-5 p 식 레벨 증가 짧은 PFS와 관련 되었다 관찰 기준선 사이의 첫 번째 임상 평가 miRNA의 식 수준을 비교, (p = 0.04) 및 OS (p = 0.02). 특히, 환자에서 있다-미르-155-5 p에서 ≥30% 증가, PFS 9.5 개월 (95 %CI, 6.8-18.7) 이었고, OS 22.3 개월 (95 %CI, 10.2 25.5) 및 42.9 개월 (95 %CI, 24.8-아니 도달)에 비해 15.9 개월 (95 %CI, 8.4-아니 도달) 그는 < 30% 증가 (그림 3). 케이스 시리즈 (30%)에서의 중간 값 컷오프 지점으로 설정 했다. MiRNAs의 순환 기초 수준 "높음" 또는 "낮은" 중간 값9에 따르면 dichotomized 했다.
그림 1: 사용자 지정 접시 레이아웃의 디자인. 프로브에 각 잘 미리 목격 했다입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: qRT-PCR 증폭 플롯의 예. (A) 증폭 단일 qRT-PCR 사용자 지정 접시의 플롯. 모든 마커 evaluable 둘 다 단일 플레이트 샘플에 있었다. (B) qRT-전반적인 케이스 시리즈에는 미르-17-5 p의 레이디얼 승용차 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 실험 및 임상 결과-미르-155-5 피 기준으로 (A) Ct 값은-미르-155-5 p. 전반적으로 케이스 시리즈에는 미르-155-5 p의 증폭 줄거리. (B) PFS 및 환자의 ≥30 %의 운영 체제 또는 < 있다-미르-155-5 p 순환에 30% 증가. PFS는 종양 진행, 마지막 종양 평가 또는 질병 진행의 부재에서 죽음의 첫 번째 문서화 된 증거의 날짜에 랜덤의 날짜에서 시간으로 계산 되었다. 운영 체제는 어떤 원인 또는 마지막 속 행에서 죽음의 날짜에 랜덤의 날짜에서 시간으로 계산 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 실험 결과 forcel-미르-39 직렬 희석. (A) qRT-PCR 희석 Cts. (B) 상대와 cel-미르-39, 직렬 희석에 대 한 5에서 수행한 nM, 0.5 nM, 0.05 nM와 같은 환자에서 혈장 샘플에 5 오후. 이러한 분석 결과 선형성은 전체 케이스 시리즈에 사용 하 여 최고의 농도 선택 하 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 단계 | 온도 | 기간 | 사이클 |
| 효소 활성화 | 95 ° C | 5 분 | 1 |
| 변성 | 95 ° C | 3 s | 14 |
| Anneal/확장 | 60 ° C | 30 s | |
| 반응을 중지합니다 | 99 ° C | 10 분 | 1 |
| 보류 | 4 ° C | 보류 | ∞ |
표 1: 미르 앰프 반응의 열 프로토콜.
| 단계 | 온도 | 기간 | 사이클 |
| 효소 활성화 | 95 ° C | 20 s | 1 |
| 변성 | 95 ° C | 3 s | 40 |
| Anneal/확장 | 60 ° C | 30 s | |
| 보류 | 4 ° C | 보류 | ∞ |
표 2: qRT-PCR의 열 프로토콜.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
miRNAs는 작은 비 코딩 RNAs (18-25 뉴클레오티드 길이에서) 그들의 목표 메신저 RNA의 3' UTR 지역 바인딩 및 억제 및 그것을 타락 하는 것은 가능. 그들은 따라서 변환 수준에서 유전자 식 레 귤 레이 터를 간주 될 수 있습니다. 지난 10 년간, 몇몇 miRNAs 암 개시 및 개발, 진단, 예 후 및 치료에 대 한 유용한 임상 바이오 마커 들을 만들고 상관 되어 있다. RNases에 의해 보호, miRNAs은 혈액, 혈장, 혈 청, 소변과 타 액, 임상 연습10에 그들의 잠재적인 유용성에 성장 관심사를 주도하 고 있다 같은 생물 학적 체액에서 안정적 형태로 존재 한다.
그럼에도 불구 하 고, 순환 miRNAs의 평가 과제 이며 샘플 수집, 대상 추출, 플랫폼 선택 및 글로벌 표준화에 관한 어려움은 과학 지역 사회 내에서 뜨겁게 논쟁된 주제.
샘플 수집 및 저장에 대 한 사전 분석 변수는 플라즈마 처리 및 처리 밀접 하 게 연결 됩니다. 응고 과정10,11,12 동안 이러한 분자의 출시로 인해 아마도 후자에 더 높은 miRNA 농도의 충분 한 증거가 있다 그 주어진 우리 플라즈마 보다는 혈 청 샘플에 집중 . 혈액 세포 세포의 용 해에서 파생 하는 세포 핵 산의 분리의 문제를 해결 하려면 우리 혈액 컬렉션의 2 h 이내 샘플을 centrifuged. 우리는 또한 다른 안티 coagulants 증폭 단계 (즉, 헤 파 린)을 방해으로 알려져 있으며 혈 (즉, 시트르산)를 실행할 수 있기 때문에 K3E EDTA 튜브 사용. 그것은 사전 분석 단계에서 혈소판 및 림프 구 오염 방지에 중요 한, 우리 아주 천천히 튜브에서 플라스마를 제거 하 고 튜브에서 샘플의 마지막 ~ 50 µ L를 발음 하지 않았다.
다양 한 연구 열 기반 추출 방법의 우월 guanidine/페 놀/클로 프롬 기반 프로토콜11,13, 이상 하지만 Khoury 외. 효과적으로 격리 좋은 품질 등을 사용 하 여 혈 청에서 작은 RNAs 오염14없이 시 약. 순차적으로 사용 하는 상용 키트 스파이크 농도 면에서 적합 한 미르 수확량을 허용 두 추출 방법을 수행 합니다. 우리만 즉, 제조업체의 지침에 관하여 1 개의 수정 수행, 신선한 컬렉션 튜브 항상 각 필터 카트리지 세척 단계 후를 사용한 시 약 오염 위험 제거/감소. 우리의 샘플에 최고의 스파이크에 농도 식별 하 고 따라서 후속 반응 간섭을 유발 하지 않도록, 우리가 먼저 수행 전체 프로토콜의 중간 식 수준을 평가 하는 추출 단계 동안 cel-미르-39를 추가 하지 않고 우리의 목표입니다. 우리는 다음 드 노 보 미르 추출 플라즈마 샘플에서 우리의 케이스 시리즈 (그림 4)의 플라즈마 샘플을 추가 하려면 같은 환자 cel-미르-39의 직렬 희석을 사용 하 여 최고의 농도 식별 하기 위해 수행 합니다. 그러나 그것은,, 해야 밑줄이 그 최적의 cel-미르-39 농도, 하나의 샘플에 대 한 식별 않을 수 있습니다 반드시 전체 케이스 시리즈에 대 한 최고의 농도 내부 변수, 나이, 성별, 생활 습관 등의 시리즈는 혈액 내에서 절대 미르 식 영향을 미칠 수 있습니다.
miRNA 반전 녹음 방송 및 증폭 2 중요 한 단계를 나타냅니다. MiRNA 탐지 (즉., qRT-PCR 및 microarray)에 대 한 두 가지 주요 방법 중 우리 qRT-PCR의 높은 감도 우리의 필요 (이 방법의 주요 한계는 그것의 낮은 처리량) miRNAs의 선택한 패널만 평가 하 선택15. 우리가 성숙한 miRNA를 확장 하 고 보편적인 RT 뇌관의 어 닐 링 허용 반전 녹음 방송 화학 3' polyA 미행 및 5' 결 찰 어댑터 시퀀스에 따라 사용. 단일 기지-쌍 인식에 따라, 결 찰 어댑터 5' 5' 불일치에 연결 되어 같은 일반적인 편견을 피하기 위해 도울 수 있었다. 이 키트는 또한 낮은 수익률 샘플, 플라즈마 등에 필요한 사전 증폭 단계를 포함 한다. 비록 필요한이 단계 검색 단계 전에 일부 증폭 편견을 소개 수 있습니다.
이 프로토콜에서 우리는 신생 연관 24 선택한 miRNAs의 패널 분석. 특히, 우리는 미리 발견된 프로브 사용자 지정 접시를 선택 하 고 qRT-PCR 실행에 대 한 제조업체의 지침을 따 랐 다. MiRNA qRT-PCR에 관련 된 주요 문제는 참고 유전자 및 그들의 연속적인 데이터 분석 정규화의 선택 이다.
정규화에 사용할 최고의 miRNA를 식별 하기 위해 수많은 연구를 실시 했습니다, 하지만 아무 균일 한 합의 도달 했습니다. 이 한계를 해결 하기 위해 우리는 우리의 케이스 시리즈에 참조 유전자로 사용 될 수 있는 순환 miRNAs 식별 하 문학 검색 실시.
우리는 또한 mCRC 환자에서 혈장 샘플에 안정적인 식의 강한 증거 4 miRNAs를 선택 하 고 우리의 케이스 시리즈의 작은 부분에서 그들을 테스트. 2 가장 안정적인 miRNAs는 하우스키핑 유전자를 참조 GeNorm 분석에 의해 확인 되었다.
결론적으로, miRNAs 주변 혈액 샘플에서 순환의 평가 알려진된 어려움의 여러. 그러나, 우리가 믿고 우리가 사용 하는 방법론은 안정적이 고 강력한, 대 장 암에 대 한 처리 시나리오를 바꿀 가능성이 있는 이러한 생체의 깊이 정확한 연구에 대 한 허용.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
이 연구로 기존과 이탈리아 약 기관 (AIFA)에 의해 부분적으로 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1,000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
- Luo, H. -Y., Xu, R. -H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
