Summary
Biz mikroRNA (miRNAs) dolaşan ifade düzeylerini değerlendirmek için bir protokol kanserli hastalarda plazma örnekleri mevcut. Özellikle, biz piyasada bir kit miRNA çıkarma ve ters transkripsiyon dolaşan için kullanılır. Son olarak, gerçek zamanlı önceden benekli sonda özel plakaları kullanarak 24 seçili miRNAs oluşan bir panel analiz ettik.
Abstract
Orada sıvı biyopsi için kanser tanı, teşhis ve tedavi kontrolü, ilgi klinik uygulaması için güvenilir ve yararlı biyolojik gereksinimini oluşturma artmaktadır. Burada, ayıklamak için bir iletişim kuralı mevcut ters uyarlamak ve kolorektal kanser (CRC) hastalarda plazma örneklerinden miRNAs dolaşan ifade düzeyini değerlendirin. MikroRNA (miRNAs) kodlamayan RNA'ların translasyonel düzeyinde hedef genlerin ifade düzenleyen ve pro - ve anti-anjiogenik işlevi, Fizyopatoloji da dahil olmak üzere önemli bir rol oynamaktadır 18-25 nükleotid uzunluğunda, sınıfıdır çeşitli organları. miRNAs serum ve onları ideal biyolojik kanser tanı, teşhis ve tedavi karar için dolaşan ve izleme işler plazma gibi biyolojik sıvı stabildir. MiRNA ayıklama dolaşan hem organik hem de sütun tabanlı yöntemleri içerir hızlı ve etkin bir yöntemle gerçekleştirildi. MiRNA retrotranscription için biz 3' ve bir bağdaştırıcı, 5' in rasgele miRNA öncesi amplifikasyon tarafından takip olgun miRNAs ligasyonu Poliadenilasyon dikkate alır bir çok adım yordam kullanılır. Nicel gerçek zamanlı Polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) tarafından test edilecek, özel bir 24-miRNA bölmesi seçili ve miRNA probları dizi özel Tabaklarda gördü. Biz qRT-PCR plaka ishal üstünde bir gerçek zamanlı PCR sistemi uygulandı. Temizlik miRNAs normalleştirme için GeNorm yazılım (v. 3.2) kullanarak seçildi. Veri ifade suite yazılımı (v 1.1) kullanarak analiz edildi ve istatistiksel analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu yöntem güvenilir ve teknik olarak sağlam olduğu ortaya çıktı ve plazma ve/veya serum gibi sıvı örnekleri biyomarker düzeyleri değerlendirmek için yararlı olabilir.
Introduction
CRC temsil eden üçüncü en sık malignite ve dördüncü ölüm sebebi kanser ile ilgili dünya çapında tanısı. Bugüne kadar bevacizumab (B), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve cetuximab (C) veya panitumumab (P), monoklonal antikorlar karşı epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), yönetmen karşı Monoklonal antikor onaylanmış olan birinci basamak tedavi kemoterapi (CT) rejimleri ile birlikte.
K-RAS ile N-RAS gen mutasyonlar tek klinik olarak yararlı biyolojik anti-EGFR tabanlı CT yararlanmak en az olan hastalar belirleme yeteneğine sahip olan Yanıt CT B tabanlı akıllı biyolojik aramak için çeşitli çalışmalar yapılmıştır rağmen hala güvenilir ve etkili ilaçların klinik pratikte1kullanmak için önemli bir eksikliği olduğunu.
miRNAs çeviri hedef genlerin düzenleyen ve embriyo ve karsinojenezis dahil olmak üzere çok sayıda Fizyopatolojik işlemlerinde çok önemli bir rol oynamak küçük RNA'lar (18-25 nükleotid uzunluğunda) vardır. Bu moleküller biyolojik sıvı plazma/serum, idrar ve non-invaziv örnekleme2için kullanmak için sağlam biyolojik işler balgam gibi son derece kararlı. MiRNAs anjiogenik yolu yer Masası, biz tanımlamak için amaçlayan yeni biyolojik metastatik CRC (mCRC) olan hastalarda klinik sonuçlar oluşabileceğini yetenekli dolaşan bir B tabanlı CT rejimi ile tedavi.
52 bir dizi analiz randomize potansiyel multicenter içinde B tabanlı CT ile tedavi edilen mCRC hastaların evre III deneme "İtalyan deneme içinde gelişmiş kolorektal kanser" (Itaca). Mevcut iletişim kuralı yerel Etik Komitesi tarafından kabul edildi (Comitato Etico alan Vasta e Istituto bilimsel Enstitüsü Romagnolo başına lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, No 674) 19th Eylül 2007 tarihinde. Tüm hasta Onam kanı örnek toplama önce verdi. Her bir hasta için Venöz kan örneği tedavi öncesi ve (sonra 8 hafta) ilk klinik değerlendirme, temel miRNA ifade ve hasta sonuç ile ilgili olarak tedavi sırasında onun modülasyon değerlendirmek için toplandı.
Edebiyat bir arama, biz insan plazmada tespit olduğu bilinmektedir anjiogenik işlemle ilişkili 21 miRNAs seçilmiş: vardır-miR-107, sahip-miR-126-3 p, vardır-miR-145-5 p, vardır-miR-194-5 p, vardır-miR-199a - 5p, vardır-miR-200b - 3p, vardır-miR-20b - 5p , vardır-miR-21-5 p, sahip-miR-210-3 p, sahip-miR-221-3 p, sahip-miR-24-3 p, vardır-miR-27a - 3p, vardır-miR-29b - 3p, vardır-miR-335-5 p, vardır-miR-424-5 p, vardır-miR-497-5 p, vardır-miR - 520d - 3p, vardır-miR-92a - 3p, vardır-miR-17-5 p ve vardır-miR-155-5 p. Biz de sahip-miR-223-3 p ve seçilen vardır-mir-484 endojen normalleştirme3,4,5,6ve cel-miR-39 spike bileşeni olarak eksojen normalleştirme için C. elegans arıtılmış. Tüm veri normalizations 2 ̂ ̄(ΔΔCt) yöntemiyle yapıldı.
MiRNAs dolaşan algılama molekülleri plazmada çok düşük düzeylerde varsa ve onların amplifikasyon kısa sırasına verilen kimyasal olarak zordur çünkü bazı teknik sorunlar sunar. Bu nedenlerden dolayı biz fenol ile organik çıkarma ve sütunlara göre bir cam elyaflı metodoloji dikkate alır bir yordam seçildi. MiRNA ayıklama dolaşan sıvı biyopsi alanında bir konu olduğunu ve biz en güvenilir olmak göstermiştir bir ticari kiti seçili tutar ve kurtarılan verimleri7,8kalite açısından. Biz tersine çevirmek için bir iletişim kuralı seçili selectivity geliştirmek için bir adaptör 5' ve Poli(a) kuyruğu için 3' olgun miRNA eklenmesi ve reaksiyon özgüllüğü tarafından miRNAs uyarlamak.
Sağlamlık yöntemi göz önüne alındığında, biz özel plakaları önceden benekli probları yinelenen her örnekte değerlendirmek RT-PCR ile tasarlanmış ve her plaka içinde 2 hasta şekil 1' de gösterildiği gibi analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Tüm iyi laboratuar uygulaması (GLP) göre steril duman başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
1. plazma toplama ve depolama
- 3 mL periferik kan örneği K3E EDTA tüp içinde toplamak.
- Tüp 1,880 x g 15dk için de oda sıcaklığında santrifüj kapasitesi.
- Aliquots 450 µL süpernatant plazmada kurtarmak.
- -80 ° C'de örnekleri kullanmak kadar saklamak.
Not: Periferik kan tüpü 2s toplama içinde işlemek. Plazma tüpünden kurtarırken, lenfosit katman rahatsız etmeyin.
2. miRNAs plazma numuneleri (malzemeler tablo) üzerinden dolaşan ayıklama
-
Tüm gerekli çözümler hazırlamak ve örnekleri için ayıklama adımları çözülme.
- 2-mercaptoethanol 375 µL 2 x denaturating ekleyin ve iyice karıştırın.
- ACS notu % 100 etanol 21 mL miRNA yıkama çözüm eklemek için ben ve mix de.
- ACS notu % 100 etanol 40 mL yıkama 2/3 ekleyin ve iyice karıştırın.
- Bir plazma aliquot oda sıcaklığında erimek ve ayıklama adımları başlamak için izin verir.
-
Organik çıkarma
- Plazma örneği 400 µL RNase free 2 mL tüp içine aktarın.
- Vortexing tarafından mix ve kısaca santrifüj kapasitesi 400 µL 2 x denaturating çözüm ekleyin.
- Vortexing tarafından mix ve kısaca santrifüj kapasitesi 1 nM spike-in 4 µL ekleyin.
- Asit fenol kloroform 800 µL ekleyin.
- 60 s ve 15dk için maksimum hızda (≥10, 000 x g) santrifüj için girdap.
- Üst sulu faz için taze bir tüp aktarın. Interphase rahatsız etmeyin. Not Ses kurtarıldı ve sigara acqueous faz içeren tüp atın.
Not: 2 çözüm denaturing x 4 ° C'de depolanan ve bu sıcaklıkta sağlamlaştırmak. Kullanmadan önce sıcak 37 ° C, bazen 10-15 dk. ajitasyon çözüm asit fenol kloroform, değil üstüne karışımı yatıyor acqueous arabellek içeren alt aşaması çekilmeye dikkat et. Elüsyon çözüm veya nükleaz ücretsiz su ile 95 ° c Onceden Yeterli bir çözüm (örnek + % 10 aşırı başına 100 µL) hacmi ısıtmak dikkatli olun.
-
Küçük RNA zenginleştirme
- Etanol %100 hacmi 1/3 sulu Faz 2.2.6 adımından ekleyip iyice karıştırın.
- Bir taze koleksiyonu tüp her örnek için bir filtre kartuşu yerleştirin.
- Lysate, 700 µL filtre kartuşu ve 10.000 x g , santrifüj 30 adım 2.3.1 ve etanol aktarmak s.
- Eğer > 700 µL sol, karışımı filtrate taze bir tüp içinde yerleştirin ve tekrar adım 2.3.3; Tüm karışımı filtre kartuşu geçene kadar yineleyin.
- Akış yoluyla toplam hacmi ölçmek.
- 2/3 birim etanol %100 filtrate ve iyice karıştırın ekleyin.
- İkinci filtre kartuşu bir taze toplama tüpü yerleştirin.
- Numune hacmi 700 µL kartuşun aktarmak ve 10.000 x g 30 s. atma için akış yoluyla santrifüj kapasitesi.
- Tüm karışımı filtre kartuşu geçene kadar 2.3.8 adımları yineleyin.
- MiRNA yıkama çözüm 1 700 µL filtre kartuşu uygulamak ve filtre kartuşu 10.000 x g de koleksiyon tuplü 15 s. atma için akış yoluyla santrifüj kapasitesi. Filtre Kartuşu aynı toplama tüpü yerleştirin.
- Yıkama çözüm 2/3 filtre kartuşu ve santrifüj filtre kartuşu 10.000 x g de koleksiyon tuplü 500 µL akışı aracılığıyla 15 s. atma için geçerlidir. Filtre Kartuşu bir taze toplama tüpü yerleştirin.
- Bir taze koleksiyonu tüp içinde filtre kartuşu yerleştirin ve 2.3.11 500 µL ile yıkama çözüm 2/3 arasındaki adımları yineleyin. Akışı aracılığıyla atın ve filtre kartuşu bir taze koleksiyonu tüp aktarmak.
- 10.000 x g 1 dk. için filtre kartuşları ile tüpler santrifüj kapasitesi.
- Filtre Kartuşu bir taze 1,5 mL toplama tüp içine aktarmak ve Önceden ısıtılmış (95 ° C) elüsyon çözüm veya nükleaz ücretsiz su 100 µL ekleyin.
- 30 için 10.000 x g , santrifüj miRNAs yeniden elde etmek ve-80 ° C'de depolamak için s
Not: Bir beyaz çökelti yıkama çözüm 2/3 oluşabilir. Aşırı EDTA eriyik--dan serbest bırakmak bu. Bu kristaller pipetting adımları uyguladığınızda çizim kaçının.
3. gerçekleştirmek ters transkripsiyon ve miRNA öncesi amplifikasyon (malzemeler tablo)
-
Poliadenilasyon reaksiyonu gerçekleştirmek
- O zaman kısaca girdap ve santrifüj dönmeye içeriği aşağı buz üzerinde tüm reaktifler çözülme. Buna ek olarak, tezcan % 50 oda sıcaklığında ulaşmak izin 8000, PEG.
- Tepki her örnek için kokteyl 3 µL son hacmi elde etmek bir 0.5 mL santrifüj tüpü tepki karışımda hazırlayın. Aşağıdaki birimler artı % 10 aşırı cilt her reaktif için kullanın.
- 1.7 µL RNase ücretsiz su, 10 Poli(a) arabellek x 0.5 µL, 0.5 µL 10 mM ATP ve son olarak 0.3 µL 5 ekleyin U/µL PolyA enzim.
- Kısaca girdap ve santrifüj dönmeye kokteyl mix içeriği aşağı.
- Örnek 2 µL tepki plaka veya tepki tüp her şey aktarmak ve kokteyl tepki 3 µL ekleyin. Kısaca girdap ve santrifüj dönmeye içeriği aşağı.
- Plaka/tüpler termal cycler yerleştirin ve aşağıdaki adımları uygulayın.
- 45 dk (Poliadenilasyon adım) için 37 ° C'de kuluçkaya.
- 4 ° C'de aşağıdaki bir tutun ile 65 ° c 10 dk (stop reaksiyon), kuluçkaya
-
Tüp ligasyonu tepki gerçekleştirin.
- Her örnek ve aşırı hacminin % 10 bir santrifüj tüpü aşağıdaki birimler ile reaksiyon karışımda hazırlayın.
- Eklemek 0.4 µL RNase ücretsiz su, DNA ligaz tampon, 25 ligasyonu adaptör x 0.6 µL, 4,5 µL % 50 x 5 3 µL PEG 8000 ve RNA ligaz sonunda 1,5 µL.
- Kısaca girdap ve santrifüj dönmeye kokteyl mix içeriği aşağı.
- Mix 10 µL her şey/tepki tüp Poli(a) takip ürün içeren ekleyin. 1 dk. için 1900 devirde bir plaka shaker veya kısaca vortexing ve içeriği aşağı spin karıştırın.
- Aşağıdaki ayarlarla bir termal cycler plaka/tepki tüpler yerleştirin: kuluçka için bir sonraki ile 60 dk 60 ° C'de 4 ° C'de tutun
Not: 8000 PEG çok viskoz % 50'dir. Oda alıyorum ve yavaş yavaş dağıtımı sıcaklığında kullanın. Plugger 10 için tutun her aspirasyon ve dağıtım adım sonra s reaktif yukarı ve aşağı akışı izin vermek için.
-
Ters transkripsiyon tepki gerçekleştirin.
- Her örnek ve aşırı hacminin % 10 için aşağıdaki birimler ile bir santrifüj tüpü tepki karışımda hazırlayın.
- 3.3 µL RNase ücretsiz su, 5 RT tampon, 1.2 µL dNTP mix (25 mM her), 1,5 µL evrensel RT astar x 20 x 6 µL ve sonunda 3 µL 10 x RT enzim karışımı ekleyin.
- Kısaca girdap ve santrifüj dönmeye kokteyl mix içeriği aşağı.
- Mix 15 µL her şey/tepki tüp ligasyonu ürün içeren ekleyin. 1 dk. için 1900 devirde bir plaka shaker veya kısaca vortexing ve içeriği aşağı spin karıştırın.
- Aşağıdaki ayarlarla bir termal cycler plaka/tepki tüpler yerleştirin.
- 15 dakika (ters transkripsiyon) 42 ° C'de kuluçkaya.
- 4 ° C'de aşağıdaki bir tutun ile 85 ° c 5 min (stop reaksiyon) için kuluçkaya
Not: RT ürün-20 ° C'de hafızaya ve 2 aya kadar kararlı olmaya devam edecektir.
-
MiR-Amp reaksiyon (malzemeler tablo) gerçekleştirin.
- Her örnek ve aşırı hacminin % 10 bir santrifüj tüpü aşağıdaki birimler ile reaksiyon karışımda hazırlayın.
- 17,5 µL RNase ücretsiz su, 2 x miR-Amp ana Mix 25 µL ve 2.5 µL 20 x miR-Amp astar karışımı ekleyin.
- Kısaca girdap ve santrifüj dönmeye kokteyl mix içeriği aşağı.
- Her örnek için yeni bir reaksiyon tabak ya da bir tepki tüp her iyi tepki Mix 45 µL aktarın. RT ürünün 5 µL her şey ya da bir tepki tüp ekleyin. 1 dk. için 1900 devirde bir plaka shaker veya kısaca vortexing ve içeriği aşağı spin karıştırın.
- Plaka/tepki tüpler içinde termal cycler yerleştirin ve Tablo 1' de gösterildiği gibi çalıştırın.
4. gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek
- Her cDNA Örnek 1:10 0,1 x TE arabellek sulandırmak.
- Kuyu/çoğaltır her örnek için sayısını hesaplayın. Aşağıdaki birimler bir santrifüj tüpü tepki karışımda fazla hacminin % 10 ekleyerek her örnek için hazır olun.
- 4 µL RNase ücretsiz su, 2 x hızlı gelişmiş ana karıştırmak (Malzemelerin tablo) 10 µL ve seyreltilmiş cDNA sonunda 5 µL ekleyin.
- Vortexing tarafından mix ve kısaca içeriği spin santrifüj kapasitesi.
- Her şey, plaka mühür ve kısaca santrifüj kapasitesi için tepki karışımı 19 µL aktarın.
- Termal Protokolü (Tablo 2) bir RT-PCR sistem üzerinde gerçekleştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analiz ettik angiogenez ilgili dolaşan miRNAs ilerleme-Alerjik hayatta kalma (PFS) ile ilgili olarak bir panel, genel olarak hayatta kalma (OS) ve objektif yanıt oranı (ORR) B tabanlı CT ile hasta tedavi 52 mCRC içinde Plazma numuneleri böyle biyolojik değerlendirilmesi teknik zorluklardan dolayı zordur. Biz hasta plazma örnekleri, ters transkripsiyon ve öncesi amplifikasyon miRNA çıkarılması için kurulan yöntemleri kullanılır. Üreticinin yönergelerini izleyerek ve sadece gerekli, özellikle ayıklama adımları, bir kaç değişiklik ile başarılı bir şekilde hedeflerimizi hasta popülasyonda (şekil 2) değerlendirildi.
Özellikle, biz 2 analiz plazma örnekleri/hasta, temel ve terapi-modified miRNA ifade hasta sonuç ile birleştiriliyor.
Biz cel-miR-39 0,05, seri dilutions gerçekleştirilen nM, 0.5 nM, 5nM ve 5 (plazma 400 µL artı 2 x denaturating çözüm 400 µL) kullanmak için spike bileşenini konsantrasyonu belirlemek için örnek de 800 µL plazma içinde. Şekil 4' te gösterildiği gibi eksojen denetim eşik döngüsü tüm iletişim kuralı (yani, ayıklama, ters transkripsiyon ve qRT-PCR değerlendirme) sağlamlık gösteren seri dilutions ile uyumlu (Ct) değerleri gösterdi. Ayrıca, bu seri dilutions bize tüm hedef miRNAs ters-transkripsiyon ile müdahale olmaz spike konsantrasyon seçmek etkin.
Bu yöntem temel miRNAs klinik patolojik özellikleri ile ilişkilendirmek izin verdi. Özellikle, biz vardır-miR-199a - 5 p, vardır-miR-335-5 p ve vardır-miR - 520 d - 3 p önemli ölçüde upregulated içinde bulundu sol taraflı sağ taraflı lezyonlar ile ilgili olarak (p 0.03, p = 0.006 ve p = 0.008, sırasıyla =). Tersine, vardır-miR-21-5 p oldu önemli ölçüde RAS mutasyona uğramış hastalarda downregulated (K-RAS, p 0,01 ve N-RAS, p = 0.008 =), oysa sahip-miR-221-3 p upregulated (p = 0,05, p = 0,01, K ve N RAS, sırasıyla).
MiRNA temel ve ilk klinik değerlendirme arasındaki ifade düzeyde karşılaştırma, biz bir artış vardır-miR-155-5 p ifade düzeyleri daha kısa PFS ile ilişkili gözlendi (p = 0.04) ve OS (p 0,02 =). Özellikle, bir ≥30% artış vardır-miR-155-5 p olan hastalarda PFS 9,5 ay (% 95 GA, 6,8-18,7) ve OS oldu 15.9 22.3 ay (% 95 GA, 10.2-25.5) ve 42,9 ay (% 95 GA 24,8-değil ulaştı) göre ay (% 95 GA, 8.4-değil ulaştı) olanlar için bir < % 30 artış (şekil 3). Durum serisi (% 30) varyasyon medyan değeri kesme noktası olarak kuruldu. MiRNAs dolaşımdaki bazal düzeyleri içine "yüksek" ya da "düşük" medyan değerleri9göre dichotomized.
Şekil 1: Özel plaka düzeni tasarımını. Sonda her kuyuya önceden benekli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: qRT-PCR güçlendirme araziler örnekleri. (A)amplifikasyon arsa bir tek qRT-PCR özel tabak. Tüm işaretleri her iki tek plaka örneklerinde değerlendirilebilir. (B) qRT-PCR vardır-miR-17-5 p genel durum serisi yılında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: deneysel ve klinik sonuçları vardır-miR-155-5 s. göre (A) Ct değerleri vardır-miR-155-5 p. Amplifikasyon arsa vardır-miR-155-5 p genel durum serisi yılında. (B) PFS ve OS ≥30% hastalarda veya < % 30 artış vardır-miR-155-5 p dolaşan. PFS randomizasyon tarihinden itibaren zaman ilk belgelenmiş kanıtlar tümör ilerleme, son tümör değerlendirme veya hastalık ilerleme yokluğunda ölüm tarihinden hesaplanır. OS randomizasyon tarihinden itibaren ölüm tarihinden itibaren herhangi bir neden ya da son takip için saat olarak hesaplanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: deneysel sonuçlar forcel-miR-39 seri seyreltme. (A)qRT-PCR için cel-miR-39, seri dilutions (B) göreli Cts. Dilutions ile 5'te gerçekleştirilen nM, 0.5 nM, 0,05 nM ve plazma numuneleri aynı hastadan 5 pM. Böyle tahlil doğrusallık bize genel durum serisi kullanmak için en iyi konsantrasyon seçmek etkin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Adım | Sıcaklık | Süresi | Döngüleri |
| Enzim harekete geçirmek | 95 ° C | 5 dk | 1 |
| Denatüre | 95 ° C | 3 s | 14 |
| Tavlama/uzatmak | 60 ° C | 30 s | |
| Tepki bırak | 99 ° C | 10 dk | 1 |
| Basılı tutun | 4 ° C | Basılı tutun | ∞ |
Tablo 1: Termal iletişim kuralı mir-AMP tepki.
| Adım | Sıcaklık | Süresi | Döngüleri |
| Enzim harekete geçirmek | 95 ° C | 20 s | 1 |
| Denatüre | 95 ° C | 3 s | 40 |
| Tavlama/uzatmak | 60 ° C | 30 s | |
| Basılı tutun | 4 ° C | Basılı tutun | ∞ |
Tablo 2: Termal qRT-PCR protokolü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
miRNAs küçük RNA'lar (18-25 nükleotid uzunluğunda) 3' UTR bölge hedeflerinin mesajcı RNA bağlama ve inhibe ve/veya aşağılayıcı, yetenekli kodlamayan. Böylece gen ifade düzenleyiciler translasyonel düzeyde kabul edilebilir. Son on yılda birkaç miRNAs kanser başlatma ve geliştirme, tanı, teşhis ve tedavisi için yararlı klinik biyolojik geliştirmelerde ile ilişkili. RNases tarafından korunan, miRNAs kan, plazma, serum, idrar ve tükürük, potansiyel kullanışlılığı klinik pratikte10büyüyen bir ilgi yol açmıştır gibi biyolojik sıvı istikrarlı bir biçimde mevcut.
Buna rağmen değerlendirme miRNAs dolaşan bir iştir ve zorluklar ile ilgili örnek koleksiyon, hedef çıkarma, platformu seçim ve küresel normalleştirme bilimsel topluluk içinde hararetli tartışılan konulardır.
Örnek toplama ve depolama için önceden analitik değişkenleri işleme ve işleme plazma yakından bağlantılıdır. Verilen bu yüksek miRNA konsantrasyonlarda ikinci, büyük olasılıkla bu moleküller koagülasyon işlemi10,11,12 sırasında sürümü nedeniyle yeterli kanıt biz serum yerine plazma örnekleri üzerinde duruldu . Hücresel nükleik asitleri kan hücre lizis türetmenin sürümü sorunu gidermek için kan toplama 2 h içinde örnekleri centrifuged. Çünkü diğer anti-pıhtılaştırıcı amplifikasyon adımlarla (yani, heparin) müdahale bilinmektedir ve hemoliz (yani, sitrat) tetikleyebilir Ayrıca K3E EDTA borular kullanılır. Önceden analitik aşamasında trombosit ve lenfosit kirlenmesini önlemek için önemlidir, biz plazma tüp sizden çok yavaş kaldırıldı ve son ~ 50 µL tüp örneğinin Aspire değil.
Çeşitli çalışmalar guanidin/fenol/kloroform tabanlı protokolleri11,13sütunlara göre çıkarma yöntemleri üstünlüğünü göstermiştir ama Khoury vd. etkili bir şekilde izole kaliteli serum gibi kullanarak gelen küçük RNA'ların reaktifler kirlenme14olmadan. Biz ardışık olarak kullanılan ticari seti uygun miRNA verimleri spike bileşenini konsantrasyonları açısından izin her iki ayıklama yöntemi gerçekleştirir. Sadece bir değişiklik ile ilgili prosedürü yerine getirin, yani gerçekleştirilen, taze koleksiyonu tüpler ortadan kaldırmak/reaktif bulaşma riskini azaltmak için her zaman her filtre kartuşu çamaşır adımdan sonra kullanılmıştır. Bizim örneklerinde gibi en iyi spike konsantrasyonu belirlemek ve böylece sonraki reaksiyonlar girişimi engellemek için biz tüm iletişim kuralı medyan ifade düzeylerini değerlendirmek için ayıklama adımı sırasında cel-miR-39 eklemeden yapılan ilk Hedeflerimiz. Sonra de novo miRNA çıkarma plazma numuneleri aynı hasta bizim durum serisi (şekil 4) plazma örnekleri eklemek için en iyi konsantrasyon tanımlamak için cel-miR-39 seri bir dilüsyonu kullanılarak gerçekleştirilir. Ancak, tek bir örnek için tanımlanan en iyi cel-miR-39 konsantrasyonu genel durum serisi için en iyi konsantrasyon daha yaşı, cinsiyeti ya da yaşam alışkanlıkları gibi iç değişkenleri bir dizi nedeniyle mutlaka olmayabilir altı çizili olması gerekir hangi mutlak miRNA ifade kan içinde etkileyebilir.
miRNA ters transkripsiyon ve amplifikasyon 2 kritik adımları temsil eder. MiRNA algılama (i.e., qRT-PCR ve Mikroarray) için iki ana teknikleri, biz qRT-PCR yüksek hassasiyeti ve miRNAs (bir büyük Bu metodoloji kısıtlamasıdır onun iş hızı düşük) yalnızca seçilen bir panel değerlendirmek gerek bizim verilen seçti15. Ters transkripsiyon kimya 3' polyA takip ve 5' ligasyonu adaptör dizileri dayalı olgun miRNA genişletmek ve evrensel RT astar tavlama izin vermek için kullanılır. Üzerinde tek baz çifti tanıma göre 5' ligasyonu adaptör olanlar 5' uyuşmazlığı için bağlantılı gibi ortak önyargıları önlemek için yardımcı olabilir. Bu seti de plazma gibi düşük verim örnekleri için gerekli bir ön amplifikasyon adım içerir. Gerekli olmasa da, bu adımı algılama adım önce bazı amplifikasyon önyargıları tanıştırabilirim.
Bu protokol için 24 seçili miRNAs angiogenez ile ilişkili bir panel analiz ettik. Özellikle, biz önceden benekli sonda özel plakaları seçti ve üreticinin talimatlarına qRT-PCR çalışmaları için. MiRNA qRT-PCR için ilgili ana konuları başvuru genler ve onların sonraki veri analizi normalleştirme seçimdir.
Normalleştirme için kullanılacak en iyi miRNA tanımlamak için çok sayıda çalışma yapılmıştır rağmen üniforma oybirliği ulaşıldı. Bu sınırlama gidermek için biz bizim durum serisi genlerinde başvuru olarak kullanılan dolaşımdaki miRNAs tanımlamak için bir edebiyat arama gerçekleştirdi.
Biz de güçlü kanıtlar mCRC hastalarda plazma numuneleri istikrarlı ifade ile 4 miRNAs seçilen ve onları bizim durum serisi daha küçük bir kısmı test. 2 en kararlı miRNAs temizlik genler referans olarak GeNorm analizi ile tespit edilmiştir.
Sonuç olarak, periferik kan örneklerinde miRNAs dolaşan değerlendirme bilinen sorunlar vardır. Ancak, biz biz kullanılan metodolojiler güvenilir ve sağlam, kolorektal kanser için tedavi senaryo değiştirme potansiyeline sahip bu biyolojik bir daha detaylı ve doğru çalışması için izin inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Bu çalışmada kısmen Roche S.p.A. ve İtalyan ilaç Ajansı (AIFA) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1,000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
- Luo, H. -Y., Xu, R. -H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
