Summary
Vi presenterer en protokoll for å evaluere uttrykk nivåene av sirkulerende microRNA (miRNAs) i plasmaprøver fra pasienter. Spesielt brukte vi en kommersielt tilgjengelig kit for sirkulerende miRNA utvinning og omvendt transkripsjon. Til slutt, vi analyserte et panel av 24 valgte miRNAs ved hjelp av sanntids pre flekkete sonde egendefinerte plater.
Abstract
Det er økende interesse i flytende biopsi for kreftdiagnose, prognose og terapeutiske overvåking, opprette behovet for pålitelig og nyttig biomarkers for klinisk praksis. Her presenterer vi en protokoll trekke ut revers transkribere og evaluere uttrykk nivåene av sirkulerende miRNAs fra plasmaprøver av pasienter med tykktarmskreft (CRC). microRNAs (miRNAs) er en klasse av ikke-koding RNAs av 18-25 nukleotider i lengde som regulerer uttrykket av målet gener på translasjonsforskning nivå og spiller en viktig rolle, inkludert pro - og anti-angiogenic funksjon, i physiopathology av ulike organer. miRNAs er stabile i biologiske væsker som serum og plasma, som gjør dem ideelle sirkulerende biomarkers for kreft diagnose, prognose og behandling beslutningstaking og overvåking. Sirkulerende miRNA utvinning ble utført med en rask og effektiv metode som involverer både organisk og kolonne-baserte metoder. For miRNA retrotranscription brukte vi en flertrinns prosedyre som vurderer polyadenylation på 3 og ligation av et kort på 5' av det eldre miRNAs, etterfulgt av tilfeldige miRNA pre forsterkning. Vi valgte et 24-miRNA egendefinerte panel å bli testet av kvantitative sanntids polymerasekjedereaksjons (qRT-PCR) og oppdaget miRNA sonder på matrisen egendefinerte plater. Vi utførte qRT PCR plate kjører på en sanntids PCR-System. Rengjøring miRNAs for normalisering ble valgt med GeNorm programvare (v. 3.2). Dataene ble analysert bruker uttrykket suite programvare (v 1.1) og statistiske analyser ble utført. Metoden viste seg for å være pålitelige og teknisk robust og kan være nyttig å vurdere biomarkør nivåer i flytende prøver som plasma og/eller serum.
Introduction
CRC representerer tredje mest diagnosen kreft og fjerde dødsårsaken kreft relatert over hele verden. Hittil er bevacizumab (B), et monoklonalt antistoff rettet mot vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), og cetuximab (C) eller panitumumab (P), monoklonale antistoffer rettet mot epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), godkjent for første-linje behandling i kombinasjon med kjemoterapi (CT) regimer.
Mutasjoner i K-RAS og N-RAS gener er de eneste klinisk nyttig biomarkers kan identifisere pasienter som er minst sannsynlig å ha nytte av anti-EGFR-baserte CT. Selv om flere studier har vært gjennomført for å søke etter biomarkers som er prediktive for svar på B-baserte CT, er det fortsatt en betydelig mangel på pålitelig og effektiv narkotika for bruk i klinisk praksis1.
miRNAs er små RNAs (18-25 nukleotider i lengde) som regulerer oversettelsen av målet gener og spiller en avgjørende rolle i mange physiopathological prosesser, inkludert embryogenesis og kreft. Disse molekylene er svært stabile i biologiske væsker som plasma/serum, urin og sputum, som gjengir dem robust biomarkers bruke for ikke-invasiv prøvetaking2. Bruker et panel av miRNAs involvert i angiogenic veien, vi som mål å identifisere nye sirkulerende biomarkers kan forutsi kliniske utfallet hos pasienter med metastatisk CRC (mCRC) behandlet med en B-baserte CT diett.
Vi analysert en rekke 52 mCRC pasienter behandlet med B-baserte CT innenfor den potensielle multisenter tilfeldiggjort fase III prøve "italiensk Trial i avansert Colorectal Cancer" (ITACa). Nåværende protokollen ble godkjent av den lokale etikk (Comitato Etico området Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (første) IRCCS, nr. 674) på 19th September 2007. Alle pasienter ga samtykke før blod prøvetaking. For hver pasient, ble venøs blodprøver samlet før behandling og den første kliniske vurderingen (etter 8 uker) for å evaluere planlagte miRNA uttrykk og dens modulering under behandling i forhold til pasient utfall.
Gjennom et søk litteratur, vi valgte 21 miRNAs korrelert med angiogenic prosessen som er kjent for å være synlig i humant plasma: har-miR-107, har-miR-126-3 p, har-miR-145-5 p, har-miR-194-5 p, har-miR-199a - 5p, har-miR-200b - 3p, har-miR-20b - 5p , har-miR-21-5 p, har-miR-210-3 p, har-miR-221-3 p, har-miR-24-3 p, har-miR-27a - 3p, har-miR-29b - 3p, har-miR-335-5 p, har-miR-424-5 p, har-miR-497-5 p, har-miR - 520d - 3p, har-miR-92a - 3p, har-miR-17-5 p og har-miR-155-5 p. Vi valgte også har-miR-223-3 p og har-mir-484 i endogene normalisering3,4,5,6, og cel-miR-39 renset fra C. elegans som et topp for eksogene normalisering. Alle data normalizations ble utført med metoden 2 ̂ ̄(ΔΔCt).
Gjenkjenning av sirkulerende miRNAs presenterer noen tekniske problemer fordi molekylene er tilstede på svært lave nivåer i plasma og deres forsterkning er kjemisk utfordrende gitt deres kort sekvens. For disse grunner valgte vi en prosedyre som vurderer både organisk ekstraksjon med fenol og glassfiber kolonnen-basert metode. Circulating miRNA utvinning er et hett tema innen flytende biopsi, og vi merket en kommersiell kit som har vist seg for å være en av de mest pålitelige mengden og kvaliteten på gjenopprettede gir7,8. Vi valgte en protokoll for å reversere transkribere miRNAs med tillegg av en adapter på 5' og en poly(A) hale å 3' av den eldre miRNA å forbedre selektivitet og spesifisitet av reaksjonen.
Gitt robust metoden, vi designet egendefinerte plater med pre flekkete sonder for RT PCR å vurdere hvert utvalg i duplikat og analysert 2 pasienter i hver plate, som vist i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Utføre alle de følgende trinnene under sterilisert avtrekksvifte etter gode laboratorium praksis (GLP).
1. plasma innsamling og oppbevaring
- Samle 3 mL perifert blodprøve i et K3E EDTA rør.
- Sentrifuge røret ved romtemperatur 1880 x g i 15 min.
- Gjenopprette supernatant plasma i dele 450 µL.
- Lagre prøvene ved-80 ° C før bruk.
Merk: Behandle perifert blod røret innen 2 t samling. Når du gjenoppretter plasma fra tuben, ikke forstyrr lymfocytt laget.
2. utvinning av sirkulerende miRNAs fra plasmaprøver (tabell av materialer)
-
Forberede alle nødvendige løsningene og tine prøvene utvinning trinnene.
- Legge 375 µL av 2-mercaptoethanol til 2 x denaturating løsningen og bland godt.
- Legge til 21 mL av ACS klasse 100% etanol vaskeløsning miRNA jeg og bland godt.
- Legge til 40 mL av ACS klasse 100% etanol vaskeløsning 2/3 og bland godt.
- Tillate en plasma aliquot å tine ved romtemperatur og deretter begynne utvinning trinnene.
-
Organisk utvinning
- Overføre 400 µL av plasmaprøve i en RNase-gratis 2 mL tube.
- Legge til 400 µL av 2 x denaturating løsning, blande av vortexing og kort sentrifuge.
- Legge til 4 µL av 1 nM pigg, blande av vortexing og kort sentrifuge.
- Legge til 800 µL av syre fenol-kloroform.
- Vortex for 60 s og sentrifuge med maksimal hastighet (≥10, 000 x g) i 15 min.
- Overføre den øvre vandige fasen til en frisk rør. Ikke forstyrr interphase. Merk volumet gjenopprettet og kast røret som inneholder ikke-acqueous fasen.
Merk: 2 x denaturing løsningen er lagret i 4 ° C og kan stivne ved denne temperaturen. Før bruk, varm løsningen på 37 ° C, agiterte behov for 10-15 min. Pass trekke den nederste fasen som inneholder den syre fenol-kloroform, ikke acqueous bufferen som ligger på toppen av blandingen. Forvarm elueringsrør oppløsningen eller nuclease-fritt vann til 95 ° C. Pass på å varme et tilstrekkelig volum løsning (100 µL per eksempel + 10% overflødig).
-
Liten RNA berikelse
- Legge til 1/3 volumet av etanol 100% i den vandige fasen fra trinn 2.2.6 og bland godt.
- Plass et filterelement i en fersk samling rør for hvert utvalg.
- Overføre opptil 700 µL av lysate fra trinn 2.3.1 og etanol i filterelementet og sentrifuger 10.000 x g for 30 s.
- Hvis det er > 700 µL av blanding venstre, plasser filtratet i en fersk rør og gjentar trinn 2.3.3; Gjenta til alle blandingen har passert gjennom filteret kassetten.
- Måle det totale volumet av gjennomflytsenhet.
- Legge til 2/3 volumet av etanol 100% Filtrer og bland godt.
- Sett en andre filterelementet i en fersk samling rør.
- Overføre opptil 700 µL av prøven inn i kassetten og sentrifuge 10.000 x g for 30 s. kast gjennomflytsenhet.
- Gjenta trinn 2.3.8 til alle blandingen har passert gjennom filteret kassetten.
- 700 µL av miRNA vaskeløsning 1 gjelder filterelementet og sentrifuge filterelementet med samling røret på 10.000 x g for 15 s. kast gjennomflytsenhet. Sett filterelementet i samme samling rør.
- Bruke 500 µL av vaskeløsning 2/3 filterelementet og sentrifuger filterelementet med samling røret på 10.000 x g for 15 s. kast gjennomflytsenhet. Sett filterelementet i en fersk samling rør.
- Gjenta trinn 2.3.11 med 500 µL vaskeløsning 2/3 Sett filterelementet i en fersk samling rør. Forkaste gjennomflytsenhet og overføre filterelementet til en fersk samling rør.
- Sentrifuge rør med filterets 10.000 x g for 1 min.
- Overføre filterelementet i en fersk 1,5 mL samling rør og legge 100 µL forvarmet (95 ° C) elueringsrør løsning eller nuclease-fritt vann.
- Sentrifuger 10.000 x g for 30 å gjenopprette miRNAs og lagre på-80 ° C.
Merk: En hvit bunnfall kan danne i vaskeløsning 2/3. Dette er overflødig EDTA løslatt fra løsningen. Unngå å trekke opp disse krystallene under pipettering trinnene.
3. Utfør omvendt transkripsjon og miRNA pre forsterkning (tabell av materialer)
-
Utføre polyadenylation reaksjon
- Tine reagenser på is, så kort vortex og sentrifuger å spinne ned innholdet. I tillegg pinne tine 50% 8000, slik at det nå romtemperatur.
- Klargjør reaksjon blandingen i en 0,5 mL sentrifuge tube, skaffe et endelig antall 3 µL av reaksjonen cocktail for hvert utvalg. Bruk de følgende volumer, pluss 10% overflødig volumet for hver reagens.
- 1.7 µL RNase uten vann, 0,5 µL av 10 x Poly(A) buffer, 0,5 µL 10 mM ATP og endelig 0,3 µL 5 U/µL PolyA enzym.
- Kort ned vortex og sentrifuger cocktail mix å spinne innholdet.
- Overføre 2 µL av utvalget i hver brønn reaksjon plate eller reaksjon rør og legge 3 µL av reaksjonen cocktail. Kort ned vortex og sentrifuger å spinne innholdet.
- Plasser platen/rør i en termisk cycler og utfører du følgende trinn.
- Inkuber ved 37 ° C i 45 min (polyadenylation trinn).
- Inkuber ved 65 ° C i 10 min (Stopp reaksjon), med følgende tak på 4 ° C.
-
Utføre ligation reaksjonen.
- Klargjør reaksjon blandingen i en sentrifuge rør med følgende volumer for hver utvalget og 10% av volumet i overkant.
- Legg 0,4 µL RNase uten vann, 3 µL av 5 x DNA ligase buffer, 0,6 µL 25 x ligation adapter, 4,5 µL av 50% pinne 8000, og endelig 1,5 µL av RNA-ligase.
- Kort ned vortex og sentrifuger cocktail mix å spinne innholdet.
- Legge til 10 µL av blandingen i hver brønn/reaksjon rør som inneholder poly(A) tailing produktet. Bland ved en plate shaker 1900 RPM for 1 min eller kort vortexing og rotere ned innholdet.
- Plasser platen/reaksjon rør i en termisk cycler med følgende innstillinger: inkubasjon ved 60 ° C i 60 min, med følgende holder på 4 ° C.
Merk: 50% pinne 8000 er svært tyktflytende. Bruk i romtemperatur, aspirating og dispensing sakte. Etter hver aspirasjon og dispensering trinn, holder tippen for 10 å tillate reagensen å strømme opp og ned.
-
Utføre omvendt transkripsjon reaksjonen.
- Klargjør reaksjon blandingen i en sentrifuge tube, med følgende volumer for hver utvalget og 10% av volumet i overkant.
- Legg 3.3 µL RNase-gratis vann, 6 µL av 5 x RT buffer, 1,2 µL dNTP mix (25 mM hver), 1,5 µL av 20 x Universal RT primere, og til slutt 3 µL av 10 x RT enzym blanding.
- Kort ned vortex og sentrifuger cocktail mix å spinne innholdet.
- Legge til 15 µL av blandingen i hver brønn/reaksjon rør som inneholder ligation produktet. Bland ved en plate shaker 1900 RPM for 1 min eller kort vortexing og rotere ned innholdet.
- Plass platen/reaksjon rør i en termisk cycler med følgende innstillinger.
- Ruge på 42 ° C i 15 min (omvendt transkripsjon).
- Ruge på 85 ° C i 5 min (Stopp reaksjon), med følgende tak på 4 ° C.
Merk: RT produktet kan nå lagres på 20 ° C og vil forbli stabil i opp til 2 måneder.
-
Utføre miR-Amp reaksjonen (tabell av materialer).
- Klargjør reaksjon blandingen i en sentrifuge rør med følgende volumer for hver utvalget og 10% av volumet i overkant.
- Legg 17,5 µL RNase uten vann, 25 µL av 2 x miR-Amp master mix og 2,5 µL av 20 x miR-Amp primer blanding.
- Kort ned vortex og sentrifuger cocktail mix å spinne innholdet.
- For hver prøve, overføre 45 µL av reaksjonen blanding i hver brønn av en ny plate reaksjon eller en reaksjon rør. Legge til 5 µL av RT produktet i hver brønn eller reaksjon rør. Bland ved en plate shaker 1900 RPM for 1 min eller kort vortexing og rotere ned innholdet.
- Plasser platen/reaksjon rør i en termisk cycler og kjører som vist i tabell 1.
4. utføre sanntid PCR
- Fortynn hver cDNA eksempel 1:10 inne 0.1 x TE buffer.
- Beregne antall brønner/gjentak for hvert utvalg. Klargjør reaksjon blandingen i en sentrifuge rør med følgende volumer for hver prøve, å legge 10% av volumet i overkant.
- Legg 4 µL RNase uten vann, 10 µL av 2 x rask avanserte master mix (Tabell for materiale) og til slutt 5 µL av fortynnet cDNA.
- Blanding av vortexing og kort sentrifuge for å spinne ned innholdet.
- Overføre 19 µL av reaksjonen blanding hver Vel, forsegle platen og kort sentrifuge.
- Utføre termisk protokollen (tabell 2) på en RT PCR-system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi analyserte et panel av angiogenese-relaterte sirkulerende miRNAs i forhold til progresjon overlevelse (PFS), total overlevelse (OS) og objektive svar rate (ORR) i en 52 mCRC pasienter behandlet med B-baserte CT. Evalueringen av slike biomarkers i plasmaprøver er utfordrende på grunn av tekniske problemer. Vi brukte etablerte metoder for miRNA utvinning fra pasienten plasmaprøver, omvendt transkripsjon og pre forsterkning. Produsentens instruksjoner og med bare noen få endringer kreves, spesielt på utvinning trinnene, vurdert vi har alle våre mål i pasienten befolkningen (figur 2).
Spesielt vi analyserte 2 plasma prøver/pasient, samkjøre baseline og terapi endret miRNA uttrykk med pasient utfall.
Vi utførte føljetong fortynninger av cel-miR-39 på 0,05 nM, 0,5 nM, 5nM og 5 pM i 800 µL av plasma prøve (400 µL av plasma pluss 400 µL av 2 x denaturating løsning) for å bestemme konsentrasjonen spike-i å bruke. Som vist i figur 4, viste eksogene kontrollen terskelen syklus (Ct) verdiene som var sammenfallende med de serielle fortynninger, indikerer robusthet av hele protokollen (dvs. utvinning, omvendt transkripsjon og qRT PCR evaluering). Videre mulig disse føljetong fortynninger for oss å velge topp i konsentrasjonen som ikke ville forstyrre den omvendte-Transkripsjonen av alle målet miRNAs.
Denne metoden tillot oss å korrelere planlagte miRNAs med kliniske patologisk funksjoner. Spesielt vi fant at har-miR-199a - 5p, har-miR-335-5 p og har-miR - 520d - 3p var betydelig upregulated i venstre-sidig forhold til høyre-sidig lesjoner (p = 0,03, p = 0.006 og p = 0.008, henholdsvis). Derimot har-miR-21-5 p var betydelig downregulated i RAS-mutert pasienter (K-RAS, p = 0,01 og N-RAS, p = 0.008), mens har-miR-221-3 p var upregulated (p = 0,05, p = 0,01, K - og N-RAS, henholdsvis).
Sammenligne uttrykk nivåer av miRNA mellom planlagt og første klinisk evaluering, observerte vi at en økning i har-miR-155-5 p uttrykk nivåene var assosiert med kortere PFS (p = 0,04) og OS (p = 0,02). Spesielt hos pasienter med en ≥30% økning i har-miR-155-5 p, PFS var 9,5 måneder (95% CI, 6.8-18,7) og OS var 15.9 måneder (95% CI, 8,4-ikke nådd) sammenlignet med 22.3 måneder (95% CI, 10.2-25,5) og 42.9 måneder (95% CI, 24,8 ikke nådd) for de med en < 30% øke (figur 3). Median verdien av variasjon i tilfelle serien (30%) ble satt som cutoff punkt. Sirkulerende basale nivåer av miRNAs var dichotomized i "høy" eller "lav" Ifølge median verdiene9.
Figur 1: Design av egendefinerte plate layout. Sonder var pre flekkete i hver brønn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksempler på qRT PCR forsterkning tomter. (A) forsterkning handlingen i en enkelt qRT PCR egendefinerte plate. Alle indikatorer var evaluable i både enkelt plate prøver. (B) qRT-PCR har-miR-17-5 p i generelle tilfellet serien. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: eksperimentelle og kliniske resultater i forhold til har-miR-155-5 p. (A) Ct verdier for har-miR-155-5 p. Forsterkning plott har-miR-155-5 p i generelle tilfellet serien. (B) PFS og OS av pasienter med en ≥30% eller < 30% økning i sirkulerende har-miR-155-5 p. PFS beregnet som tiden fra datoen for tilfeldig til datoen for det første dokumenterte beviset for svulst progresjon, siste svulst vurdering eller død i fravær av sykdomsprogresjon. OS ble beregnet som tiden fra datoen for tilfeldig til datoen for død fra noen siste oppfølging. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: eksperimentelle resultater forcel-miR-39 føljetong fortynning. (A) qRT PCR for seriell fortynninger av cel-miR-39, med (B) relative Cts. fortynninger ble utført på 5 nM, 0,5 nM, 0,05 nM og 5 pM i plasmaprøver fra samme pasient. Slike analysen linearitet mulig for oss å velge konsentrasjonen til bruk i generelle tilfellet serien. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Trinn | Temperatur | Varighet | Sykluser |
| Enzym aktivisering | 95 ° C | 5 min | 1 |
| Denature | 95 ° C | 3 s | 14 |
| Anneal/utvide | 60 ° C | 30 s | |
| Stoppe reaksjon | 99 ° C | 10 min | 1 |
| Hold | 4 ° C | Hold | ∞ |
Tabell 1: Termisk protokollen mir-AMP reaksjon.
| Trinn | Temperatur | Varighet | Sykluser |
| Enzym aktivisering | 95 ° C | 20 s | 1 |
| Denature | 95 ° C | 3 s | 40 |
| Anneal/utvide | 60 ° C | 30 s | |
| Hold | 4 ° C | Hold | ∞ |
Tabell 2: Termisk protokollen qRT PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
miRNAs er små ikke-koding RNAs (18-25 nukleotider i lengde) kan binding 3 UTR regionen av deres mål budbringer RNA og hemme og/eller nedverdigende den. De kan dermed betraktes gene expression regulatorer på translasjonsforskning nivå. I det siste tiåret, har flere miRNAs vært korrelert med kreft initiering og utvikling, noe som gjør dem nyttige klinisk biomarkers for diagnose, prognose og behandling. Beskyttet av RNases, er miRNAs tilstede i et stabilt skjema i biologiske væsker som blodet, plasma, serum, urin og spytt, som har ført til en økende interesse i deres potensielle nytteverdien i klinisk praksis10.
Til tross for dette, evaluering av sirkulerende miRNAs er en utfordrende oppgave og problemer vedrørende prøvetaking, mål utvinning, plattform valg og globale normalisering er sterkt debattert emner i det vitenskapelige samfunnet.
For eksempel innsamling og oppbevaring, er pre analytisk variabler nært knyttet til plasma håndtering og prosessering. Vi fokusert på plasma i stedet for serum prøver gitt at det er rikelig bevis for høyere miRNA konsentrasjoner i det siste, muligens på grunn av utgivelsen av disse molekylene under den koagulering prosess10,11,12 . For å ta opp spørsmålet om utgivelsen av mobilnettet nukleinsyrer avledet fra blodlegemer lysis, sentrifugeres vi prøvene i 2 timer med blod samling. Vi brukte også K3E EDTA rør fordi andre anti-koaguleringsmidler er kjent for å forstyrre forsterkning trinn (dvs. heparin) og kan utløse hemolyse (dvs. sitrat). Som det er avgjørende å unngå blodplater og lymfocytt forurensning i pre analytisk fase, vi fjernet plasma fra røret veldig sakte og Sug opp ikke den siste ~ 50 µL av utvalget fra røret.
Forskjellige studier viser overlegenhet kolonne-baserte utvinning metoder over guanidine/fenol/kloroform-baserte protokoller11,13, men Khoury et al. effektivt isolert god liten RNAs fra serum ved bruk av slike reagenser uten forurensning14. Kommersielle utstyret vi brukte sekvensielt utfører både utvinning metoder tillater egnet miRNA avkastning i forhold til topp-i konsentrasjoner. Vi bare utført en endring med hensyn til produsentens instruksjoner, dvs, fersk samling rør var alltid brukt etter hvert filter cartridge vask trinn for å eliminere/redusere risikoen for reagens forurensning. For å identifisere pigg i konsentrasjonen i våre prøver og dermed unngå interferens med påfølgende reaksjoner, fremført vi først hele protokollen uten å legge cel-miR-39 under utvinning foranstaltningen å evaluere median uttrykk nivåene av våre mål. Vi har utført de novo miRNA utvinning fra plasmaprøver av samme pasient ved hjelp av en seriell fortynning av cel-miR-39 for å identifisere konsentrasjonen legge til plasmaprøver av våre små serien (Figur 4). Det må imidlertid understrekes at den optimale cel-miR-39 konsentrasjonen, identifisert for bare ett eksempel ikke nødvendigvis være konsentrasjonen for generelle tilfellet serien på grunn av en rekke interne variabler som alder, kjønn eller liv vaner, som kan påvirke absolutt miRNA uttrykket i blodet.
miRNA omvendt transkripsjon og forsterkning representerer 2 avgjørende skritt. De to viktigste teknikkene for miRNA gjenkjenning (i.e., qRT PCR og microarray), vi valgte qRT PCR gitt dens høy følsomhet og vårt behov for å vurdere bare et valgte panel av miRNAs (en stor begrensning av denne metodikken er dens lav overføringshastighet)15. Vi brukte omvendt transkripsjon kjemi basert på 3 polyA tailing og 5' ligation adapter sekvenser å utvide den eldre miRNA og tillate annealing i universell RT primere. Basert på én base par anerkjennelse, kan 5' ligation adapteren bidra til å unngå vanlige skjevheter som knyttet til 5' feil. Dette settet inkluderer også en pre forsterkning trinn som kreves for lav yield utvalgene, for eksempel plasma. Selv om nødvendig, kunne dette trinnet introdusere noen forsterkning biases før oppdagelsen trinn.
I denne protokollen analyserte vi et panel av 24 valgte miRNAs korrelert med angiogenese. Spesielt vi valgte pre flekkete sonde egendefinerte plater og fulgte instruksjonene fra produsenten i qRT PCR går. De viktigste spørsmålene knyttet til miRNA qRT PCR er referanse gener og deres påfølgende data analyse normalisering.
Selv om mange studier har vært gjennomført for å identifisere de beste miRNA bruke normalisering, er ingen uniform konsensus nådd. For å løse denne begrensningen, gjennomført vi en litteratursøk å identifisere den sirkulerende miRNAs som kan brukes som referanse gener i vårt tilfelle serien.
Vi valgte de 4 miRNAs med sterke bevis stabil uttrykk i plasmaprøver fra mCRC pasienter og testet dem i en mindre del av serien vår sak. De 2 mest stabile miRNAs ble identifisert av GeNorm analyse som referanse housekeeping gener.
Avslutningsvis har evalueringen av sirkulerende miRNAs i perifert blodprøver en rekke kjente problemer. Imidlertid tror vi at metodikkene som vi brukte er pålitelig og robust, gir en detaljert og nøyaktig studie av disse biomarkers som har potensial til å endre behandling situasjonen for tykktarmskreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien var delvis finansiert av Roche S.p.A. og italienske legemidler Agency (AIFA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1,000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
- Luo, H. -Y., Xu, R. -H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
