Summary
Vi præsenterer en protokol for at evaluere udtryk niveauer af cirkulerende mikroRNA (miRNAs) i plasmaprøver fra patienter. Navnlig, brugte vi et kommercielt tilgængeligt kit for cirkulerende miRNA udvinding og omvendt transkription. Endelig, vi analyseret et panel af 24 udvalgte miRNAs ved hjælp af real-time pre plettede sonde brugerdefinerede plader.
Abstract
Der stigende interesse i flydende biopsi for kræftdiagnose, prognose og terapeutiske overvågning, oprettelse af behovet for pålidelig og nyttige biomarkører for klinisk praksis. Vi præsenterer her, en protokol til at udtrække, reverse transskribere og evaluere udtryk niveauer af cirkulerende miRNAs fra plasmaprøver af patienter med tarmkræft (CRC). MicroRNA (miRNAs) er en klasse af ikke-kodende RNA'er af 18-25 nukleotider i længde, der regulerer udtryk for target gener på translationel niveau og spiller en vigtig rolle, herunder pro - og anti-angiogene funktion, i Patofysiologi af forskellige organer. miRNAs er stabile i biologiske væsker som serum og plasma, hvilket gør dem ideelle cirkulerende biomarkører for cancer diagnose, prognose og behandling beslutningstagning og overvågning. Cirkulerende miRNA udvinding blev udført ved hjælp af en hurtig og effektiv metode, der involverer både økologisk og kolonne-baserede metoder. For miRNA retrotranscription brugte vi en multi-trins procedure, der finder polyadenylation på 3' og ligatur af et netværkskort på 5' af den modne miRNAs, efterfulgt af tilfældige miRNA pre forstærkning. Vi valgte en 24-miRNA brugerdefineret panel skal testes ved kvantitative real-time polymerase kæde reaktion (qRT-PCR) og spottet miRNA sonder array brugerdefinerede plader. Vi udførte qRT-PCR pladen kører på en real-time PCR-System. Husholdning miRNAs for normalisering blev udvalgt ved hjælp af GeNorm software (v. 3.2). Data blev analyseret ved hjælp af udtrykket suite-software (version 1.1) og statistiske analyser blev udført. Metoden viste sig for at være pålidelig og teknisk robust og kunne være nyttigt at evaluere biomarkør niveauer i flydende prøver såsom plasma og/eller serum.
Introduction
CRC repræsenterer tredje hyppigst diagnosticeret malignitet og den fjerde årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan. Til dato, er bevacizumab (B), et monoklonalt antistof rettet mod vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), og cetuximab (C) eller panitumumab (P), monoklonale antistoffer rettet mod epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), blevet godkendt til første-linie behandling i kombination med kemoterapi (CT) regimer.
Mutationer i K-RAS og N-RAS gener er de eneste klinisk nyttige biomarkører i stand til at identificere patienter, der er mindst tilbøjelige til at drage fordel af anti-EGFR-baserede CT. Selv om flere undersøgelser er blevet gennemført for at søge efter biomarkører, der er prædiktive for respons på B-baserede CT, er der stadig en betydelig mangel på pålidelige og effektive lægemidler til brug i klinisk praksis1.
miRNAs er små RNA'er (18-25 nukleotider i længde), der regulerer oversættelse af target gener og spiller en afgørende rolle i mange physiopathological processer, herunder embryogenese og carcinogenese. Disse molekyler er yderst stabil i biologiske væsker såsom plasma/serum, urin og spyt, hvilket gør dem robuste biomarkører til brug for non-invasiv prøveudtagning2. Ved hjælp af et panel af miRNAs involveret i angiogene pathway, vi havde til formål at identificere nye cirkulerende biomarkører i stand til at forudsige kliniske resultater hos patienter med metastatisk CRC (mCRC) behandlet med en B-baserede CT regime.
Analyserede vi en serie af 52 mCRC patienter behandlet med B-baserede CT i den prospektive multicenter randomiseret fase III forsøg "italienske retssag i avanceret kolorektal Cancer" (ITACa). Denne protokol blev godkendt af det lokale etiske udvalg (Comitato Etico område Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, nr. 674) på 19th September 2007. Alle patienter gav informeret samtykke før blod prøve samling. For hver patient, blev venøse blodprøver indsamlet før behandling og ved den første klinisk evaluering (efter 8 uger) for at vurdere baseline miRNA udtryk og dets graduering under behandling i forhold til patienten resultat.
Gennem en søgning i litteraturen, har vi valgt 21 miRNAs korreleret med angiogene proces, der er kendt for at kunne påvises i humant plasma: har-miR-107, har-miR-126-3 p, har-miR-145-5 p, har-miR-194-5 p, har-miR-199a - 5p, har-miR-200b - 3p, har-miR-20b - 5p , har-miR-21-5 p, har-miR-210-3 p, har-miR-221-3 p, har-miR-24-3 p, har-miR-27a - 3p, har-miR-29b - 3p, har-miR-335-5 p, har-miR-424-5 p, har-miR-497-5 p, har-miR - 520d - 3p, har-miR-92a - 3p, har-miR-17-5 p og har-miR-155-5 p. Vi valgte også har-miR-223-3 p og har-mir-484 for endogene normalisering3,4,5,6, og cel-miR-39 renset fra C. elegans som en spike til eksogene normalisering. Alle data normalizations blev udført ved hjælp af metoden 2 ̂ ̄(ΔΔCt).
Påvisning af cirkulerende miRNAs præsenterer nogle tekniske vanskeligheder, fordi molekylerne er til stede på et meget lavt niveau i plasma og deres forstærkning er kemisk udfordrende givet deres kort sekvens. Af disse grunde har valgt vi en procedure, der finder både økologisk ekstraktion med phenol og en glas-fiber kolonne-baseret metode. Cirkulerende miRNA ekstraktion er et varmt emne i feltet af flydende biopsi, og vi valgte en kommerciel kit, der har vist sig for at være en af de mest pålidelige med hensyn til mængde og kvalitet af gendannede udbytter7,8. Vi valgte en protokol til at tilbageføre transskribere miRNAs ved tilsætning af et netværkskort på 5' og en poly(A) hale til 3' af den modne miRNA at øge selektiviteten og specificitet af reaktionen.
Givet robustheden af metoden, vi designet brugerdefinerede plader med pre plettede sonder til RT-PCR til at vurdere hver prøve i to eksemplarer og analyseret 2 patienter inden for hver plade, som vist i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Udføre alle de følgende trin under en steriliseret stinkskab ifølge Good Laboratory praksis (GLP).
1. plasma indsamling og opbevaring
- Indsamle 3 mL af perifert blodprøven i en K3E EDTA tube.
- Der centrifugeres rør ved stuetemperatur på 1.880 x g i 15 min.
- Genskab den supernatanten plasma i delprøver af 450 µL.
- Gemme prøver på-80 ° C indtil brug.
Bemærk: Processen perifert blod røret inden for 2 h af samling. Når inddrive plasma fra røret, Forstyr ikke lymfocyt lag.
2. udvinding af cirkulerende miRNAs fra plasmaprøver (tabel af materialer)
-
Forberede alle nødvendige løsninger og tø prøver til udtræk trin.
- Tilsæt 375 µL af 2-mercaptoethanol til 2 x denaturating løsningen og bland godt.
- 21 mL tilsættes ACS grade 100% ethanol til miRNA vaskeopløsning jeg og bland godt.
- Der tilsættes 40 mL ACS grade 100% ethanol til vaskeopløsning 2/3 og bland godt.
- Tillade en plasma alikvot at tø op ved stuetemperatur og derefter starte udvinding trin.
-
Økologisk udvinding
- Overføre 400 µL af plasmaprøve i en RNase-fri 2 mL tube.
- Tilføj 400 µL af 2 x denaturating løsning, mix af vortexing og kort der centrifugeres.
- Tilføj 4 µL 1 nM spike-in, mix af vortexing og kort der centrifugeres.
- Tilføje 800 µL af syre phenol-chloroform.
- Vortex for 60 s og centrifugeres ved maksimal hastighed (≥10, 000 x g) i 15 min.
- Overføre den øverste vandige fase til en frisk tube. Lave ikke forstyrre interfasen. Bemærk volumen genvundet og kassere de rør, der indeholder ikke-acqueous fase.
Bemærk: 2 x denatureringen løsning opbevares ved 4 ° C og kan størkne ved denne temperatur. Før brug, varm løsning til 37 ° C, idet lejlighedsvis for 10-15 min. være omhyggelig med at trække den nederste fase indeholdende den syre phenol-chloroform, ikke den acqueous buffer, som ligger på toppen af blandingen. Forvarm eluering løsning eller nukleasen-gratis vand til 95 ° C. Vær omhyggelig med at opvarme et passende volumen af løsning (100 µL pr. prøve + 10% overskydende).
-
Små RNA berigelse
- Tilsæt 1/3 volumen af ethanol 100% til den vandige fase fra trin 2.2.6 og bland grundigt.
- Placere en filterpatron i en frisk collection tube for hver prøve.
- Overføre op til 700 µL af lysate fra trin 2.3.1 og ethanol til filterpatron og centrifuger på 10.000 x g i 30 s.
- Hvis der er > 700 µL af blandingen venstre, placere filtratet i et frisk rør og Gentag trin 2.3.3; Gentag, indtil alle blandingen har passeret gennem filter cartridge.
- Måle det samlede volumen af gennemstrømning.
- Tilføje 2/3 volumen af ethanol 100% til filtratet og blandes grundigt.
- Placer en anden filterpatron i en frisk collection tube.
- Overføre op til 700 µL af prøven volumen i patronen og centrifugeres ved 10.000 x g for 30 s. udsmid gennemstrømnings.
- Gentag trin 2.3.8 indtil alle blandingen har passeret gennem filter cartridge.
- Anvende 700 µL miRNA vaskeopløsning 1 på filter cartridge og centrifugeres filterpatron med collection tube på 10.000 x g i 15 s. udsmid gennemstrømnings. Placer filter cartridge i den samme collection tube.
- Anvende 500 µL vaskeopløsning 2/3 til den filter cartridge og centrifugeres filterpatron med collection tube på 10.000 x g for 15 s. udsmid gennemstrømnings. Placer filter cartridge i en frisk collection tube.
- Placer filter cartridge i en frisk collection tube og Gentag trin 2.3.11 med 500 µL vaskeopløsning 2/3. Kassér gennemstrømnings- og overføre filter cartridge til en frisk collection tube.
- Der centrifugeres rør med filterpatroner på 10.000 x g i 1 minut.
- Overføre filter cartridge ind i en frisk 1,5 mL indsamling rør og tilsæt 100 µL forvarmet (95 ° C) eluering løsning eller nukleasen-gratis vand.
- Der centrifugeres ved 10.000 x g i 30 s til at inddrive miRNAs og opbevares ved-80 ° C.
Bemærk: Et hvidt bundfald kan danne i vaskeopløsning 2/3. Dette er overskydende EDTA frigivet fra løsningen. Undgå at udarbejde disse krystaller under pipettering trin.
3. udføre Reverse transkription og miRNA pre forstærkning (tabel af materialer)
-
Udføre polyadenylation reaktion
- Tø alle reagenser på is, så kortvarigt vortex og centrifugeres spin ned indholdet. Derudover PLØK tø 50% 8000, gør det muligt at nå stuetemperatur.
- Forberede mastermix i et 0,5 mL centrifugeglas, at opnå en endelige mængden af 3 µL af reaktion cocktail for hver prøve. Brug følgende diskenheder, plus 10% overskydende volumen for hver reagens.
- Tilføje 1,7 µL af RNase-fri vand, 0,5 µL af 10 x Poly(A) buffer, 0,5 µL af 10 mM ATP og endelig 0,3 µL 5 U/µL PolyA enzym.
- Kort ned vortex og centrifugeres cocktail mix for at dreje indholdet.
- Overføre 2 µL af prøven til hver brønd reaktion plade eller reaktion tube og tilføje 3 µL af reaktionen cocktail. Kort ned vortex og centrifugeres spin indholdet.
- Placere plade/rør ind i en termisk cycler og udføre følgende trin.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 45 min (polyadenylation trin).
- Der inkuberes ved 65 ° C i 10 min (stop reaktion), med følgende fat ved 4 ° C.
-
Udføre ligatur reaktion.
- Forberede mastermix i et centrifugeglas følgende mængder for hver stikprøve og 10% af volumen i overskud.
- Tilføje 0,4 µL af RNase-fri vand, 3 µL af 5 x DNA ligase buffer, 0,6 µL af 25 x ligatur adapter, 4,5 µL af 50% PLØK 8000, og endelig 1,5 µL af RNA ligase.
- Kort ned vortex og centrifugeres cocktail mix for at dreje indhold.
- Tilføje 10 µL af blandingen til hver brønd/reaktion tube poly(A) hale produkt indeholdende. Bland en plade shaker på 1.900 rpm i 1 minut eller kort vortexing og spin-ned indholdet.
- Placere plade/reaktion rør i en termisk cycler med følgende indstillinger: inkubation ved 60 ° C i 60 min, med en følgende hold ved 4 ° C.
Bemærk: 50% PLØK 8000 er meget tyktflydende. Brug ved stuetemperatur, sugning og udlevering langsomt. Efter hver aspiration og udlevering skridt, holde plugger for 10 s at tillade reagens til at flyde op og ned.
-
Udføre reverse transkription reaktion.
- Forberede mastermix i et centrifugeglas, med de følgende mængder for hver stikprøve og 10% af volumen i overskud.
- Tilføje 3,3 µL af RNase-fri vand, 6 µL af 5 x RT buffer, 1,2 µL af dNTP mix (25 mM), 1,5 µL af 20 x Universal RT primere og endelig 3 µL af 10 x RT enzym mix.
- Kort ned vortex og centrifugeres cocktail mix for at dreje indholdet.
- Tilføje 15 µL af blandingen til hver brønd/reaktion rør indeholdende ligatur produkt. Bland en plade shaker på 1.900 rpm i 1 minut eller kort vortexing og spin-ned indholdet.
- Placere plade/reaktion rør i en termisk cycler med følgende indstillinger.
- Der inkuberes ved 42 ° C i 15 min (reverse transkription).
- Der inkuberes ved 85 ° C i 5 min (stop reaktion), med følgende fat ved 4 ° C.
Bemærk: RT produkt kan nu opbevares ved-20 ° C og vil forblive stabil i op til 2 måneder.
-
Udføre miR-Amp reaktion (tabel af materialer).
- Forberede mastermix i et centrifugeglas følgende mængder for hver stikprøve og 10% af volumen i overskud.
- Tilføje 17,5 µL af RNase-fri vand, 25 µL af miR-Amp 2 x master mix og 2,5 µL af 20 x miR-Amp primer mix.
- Kort ned vortex og centrifugeres cocktail mix for at dreje indholdet.
- For hver prøve, skal du overføre 45 µL af mastermix hvert hul i en ny reaktion plade eller en reaktion tube. Tilføj 5 µL af RT produkt til hver brønd eller reaktion tube. Bland en plade shaker på 1.900 rpm i 1 minut eller kort vortexing og spin-ned indholdet.
- Placere plade/reaktion rør i en termisk cycler og køre som vist i tabel 1.
4. Udfør Real-time PCR
- Fortynd hver cDNA prøven 1:10 i 0,1 x TE buffer.
- Beregne antallet af brønde/flergangsbestemmelser for hver prøve. Forberede mastermix i et centrifugeglas følgende mængder for hver prøve, tilføjer 10% af volumen i overskud.
- Tilføj 4 µL af RNase-fri vand, 10 µL af 2 x hurtigt avancerede master mix (Tabel af materialer), og endelig 5 µL fortyndede cDNA.
- Blanding af vortexing og kortvarigt centrifugeres for at dreje ned indholdet.
- Overføre 19 µL af mastermix hver godt forsegle pladen og kortvarigt centrifugeres.
- Udføre den termiske protokol (tabel 2) på et system, RT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi analyseret et panel af angiogenese-relaterede cirkulerende miRNAs i forhold til progressionsfri overlevelse (PFS), total overlevelse (OS) og objektive svar sats (ORR) i en 52 mCRC patienter behandlet med B-baserede CT. Evalueringen af disse biomarkører i plasmaprøver er udfordrende på grund af tekniske vanskeligheder. Vi brugte etablerede metoder til miRNA udvinding fra patient plasmaprøver, reverse transkription og pre forstærkning. Efter fabrikantens anvisninger og med kun et par ændringer nødvendige, især i udvinding skridt, evalueret vi med held alle vores mål i patientgruppe (figur 2).
Navnlig, vi analyseret 2 plasma prøver/patienten, korrelerede baseline og terapi-modificerede miRNA udtryk med patienten resultat.
Vi udførte serielle fortyndinger af cel-miR-39 på 0,05 nM, 0,5 nM, 5nM og 5 pM i 800 µL plasma prøve (400 µL plasma plus 400 µL af 2 x denaturating løsning) til at bestemme koncentrationen spike-i at bruge. Som vist i figur 4, viste de eksogene kontrol tærskel cyklus (Ct) værdier, der var sammenfaldende med de serielle fortyndinger, der angiver robustheden af den hele protokol (dvs. udvinding, reverse transkription og qRT-PCR evaluering). Disse serielle fortyndinger endvidere muliggjort at vælge spike-i koncentration, der ikke ville forstyrre reverse-transskription af alle mål miRNAs.
Denne metode er tilladt os at korrelere baseline miRNAs med kliniske patologiske funktioner. Navnlig, vi fandt, at har-miR-199a - 5p, har-miR-335-5 p og har-miR - 520d - 3p var væsentligt upregulated i venstre-sidet med hensyn til højre-sidet læsioner (p = 0,03, p = 0,006 og p = 0,008, henholdsvis). Omvendt har-miR-21-5 p var væsentligt downregulated i RAS-muteret patienter (K-RAS, p = 0,01 og N-RAS, p = 0,008), hvorimod har-miR-221-3 p var upregulated (p = 0,05, p = 0.01, K - og N-RAS, henholdsvis).
Sammenligner udtrykket niveauer af miRNA mellem baseline og første klinisk evaluering, vi bemærkede, at en stigning i har-miR-155-5 p udtryk niveauer var associeret med kortere PFS (p = 0,04) og OS (p = 0,02). Især hos patienter med en ≥30% stigning i har-miR-155-5 p, PFS var 9,5 måneder (95% CI, 6,8-18.7) og OS var 15,9 måneder (95% CI, 8.4-ikke nået) i forhold til 22.3 (95% CI, 10.2-25,5) og 42,9 måneder (95% CI, 24,8-ikke nået) for dem med en < 30% øge (figur 3). Medianværdien af variation i case-serien (30%) blev sat som cutoff point. Cirkulerende basal niveauer af miRNAs var dichotomized i "høj" eller "lav" ifølge median værdier9.
Figur 1: Design af brugerdefinerede plade layout. Sonder var allerede plettet i hver brønd. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksempler på qRT-PCR forstærkning plots. (A) forstærkning plot af en enkelt qRT-PCR brugerdefinerede plade. Alle markører blev evaluable i begge prøver, enkelt plade. (B) qRT-PCR har-miR-17-5 p i den samlede case serie. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: eksperimentel og klinisk resultater i forhold til er-miR-155-5 p. (A) Ct værdier for har-miR-155-5 p. Forstærkning plot af har-miR-155-5 p i den samlede case serie. (B) PFS og OS af patienter med en ≥30% eller < 30% stigning i cirkulerende har-miR-155-5 p. PFS var beregnet som tiden fra datoen for randomisering til datoen for den første dokumenterede beviser af tumor progression, sidste tumor vurdering eller død i mangel af sygdomsprogression. OS var beregnet som tiden fra datoen for randomisering til dato af død af enhver årsag eller sidste opfølgning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: forsøgsresultater forcel-miR-39 seriel fortynding. (A) qRT-PCR for serielle fortyndinger af cel-miR-39, med (B) relative Cts. fortyndinger blev udført på 5 nM, 0,5 nM, 0,05 nM og 5 pM i plasmaprøver fra den samme patient. Sådanne assay linearitet aktiveret os til at vælge den bedste koncentration til brug i den samlede case serie. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Trin | Temperatur | Varighed | Cykler |
| Enzym aktivering | 95 ° C | 5 min | 1 |
| Denaturere | 95 ° C | 3 s | 14 |
| Bind/udvide | 60 ° C | 30 s | |
| Stop reaktion | 99 ° C | 10 min | 1 |
| Hold | 4 ° C | Hold | ∞ |
Tabel 1: Termisk protokol af mir-AMP reaktion.
| Trin | Temperatur | Varighed | Cykler |
| Enzym aktivering | 95 ° C | 20 s | 1 |
| Denaturere | 95 ° C | 3 s | 40 |
| Bind/udvide | 60 ° C | 30 s | |
| Hold | 4 ° C | Hold | ∞ |
Tabel 2: Termisk protokol af qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
miRNAs er små ikke-kodende RNA'er (18-25 nukleotider i længde) i stand til at bindende 3' UTR region af deres mål messenger RNA og hæmmende og/eller nedværdigende det. De kan således betragtes gen expression lovgivere på translationel niveau. I det sidste årti, har flere miRNAs blevet korreleret med kræft indledning og udvikling, hvilket gør dem nyttige kliniske biomarkører for diagnose, prognose og terapi. Beskyttet af RNases, er miRNAs til stede i en stabil form i biologiske væsker som blod, plasma, serum, urin og spyt, som har ført til en stigende interesse i deres potentielle anvendelighed i klinisk praksis10.
Trods dette, evaluering af cirkulerende miRNAs er en udfordrende opgave og vanskeligheder med hensyn til prøvetagning, target udvinding, platform valg og globale normalisering er livligt diskuterede emner inden for det videnskabelige samfund.
For prøvetagning og opbevaring, er pre analytiske variabler tæt knyttet til plasma håndtering og forarbejdning. Vi fokuserede på plasma frem for serum prøver der er rigeligt med beviser for højere miRNA koncentrationer i sidstnævnte, muligvis på grund af frigivelsen af disse molekyler under koagulation proces10,11,12 . For at løse spørgsmålet om frigivelse af cellulære nukleinsyrer fra blodlegemer lysis, centrifugeres vi prøver inden for 2 h af blod samling. Vi brugte også K3E EDTA-rør, fordi andre antikoagulantia er kendt for at blande sig med forstærkning trin (dvs., heparin) og kan udløse hæmolyse (dvs., citrat). Som det er afgørende at undgå trombocyttal og lymfocyt forurening i den pre-analytiske fase, vi fjernet plasmaet fra røret meget langsomt og Aspirér ikke sidst ~ 50 µL af prøven fra røret.
Forskellige undersøgelser har vist overlegenhed af kolonne-baseret udvindingsmetoder over guanidin/fenol/chloroform-baserede protokoller11,13, men Khoury et al. effektivt isoleret god kvalitet små RNA'er fra serum bruge sådanne reagenser uden forurening14. Kommercielle sættet vi anvendes sekventielt udfører begge udvindingsmetoder, tillade passende miRNA udbytter i form af spike-i koncentrationer. Vi kun udføres en ændring med hensyn til fabrikantens anvisninger, dvs., frisk indsamling rør blev altid brugt efter hvert filter patron vask trin til at fjerne/reducere risiko for kontaminering, reagens. For at identificere de bedste spike-i koncentration i vores prøver og dermed undgå interferens med efterfølgende reaktioner, udføres vi først i hele protokollen uden at tilføje cel-miR-39 under ekstraktionstrinet at evaluere de mediane udtryk niveauer af vores mål. Vi udførte derefter de novo miRNA udvinding fra plasmaprøver af samme patienten bruger en seriel fortynding af cel-miR-39 til at identificere den bedste koncentration til at tilføje til plasmaprøver af vores case serie (figur 4). Det skal dog være understreget, at den optimale cel-miR-39 koncentration, identificeret for kun én prøve, ikke nødvendigvis er den bedste koncentration for den samlede case serie på grund af en række interne variabler såsom alder, køn eller liv vaner, som kunne påvirke absolutte miRNA udtryk inden for blod.
miRNA reverse transkription og forstærkning repræsenterer 2 kritiske trin. Af de to vigtigste teknikker til miRNA registrering (dvs.., qRT-PCR og microarray), vi valgte qRT-PCR givet sin høje følsomhed og vores behov for at evaluere kun en valgte panel af miRNAs (en stor begrænsning af denne metode er dens lave gennemløb)15. Vi brugte reverse transkription kemi baseret på 3' polyA hale og 5' ligatur adapter sekvenser til at udvide den modne miRNA og tillade Udglødning af universal RT primere. Baseret på enkelt-basepar anerkendelse, kunne 5' ligatur adapteren bidrage til at undgå fælles bias som dem knyttet til 5' uoverensstemmelse. Dette kit indeholder også en pre forstærkning skridt, der er nødvendig for lavt udbytte prøver, såsom plasma. Selv om fornødent kunne dette trin indføre nogle forstærkning bias før registrering skridt.
I denne protokol analyserede vi et panel af 24 udvalgte miRNAs korreleret med angiogenese. Navnlig, vi valgte pre plettede sonde brugerdefinerede plader og fulgt producentens anvisninger for qRT-PCR kører. De vigtigste spørgsmål vedrører miRNA qRT-PCR er valget af reference gener og deres efterfølgende data analyse normalisering.
Selv om mange undersøgelser er blevet gennemført for at identificere de bedste miRNA til brug for normalisering, er ingen ensartet konsensus nået. For at løse denne begrænsning, gennemførte vi en litteratursøgning til at identificere den cirkulerende miRNAs, der kan bruges som reference gener i vores case serie.
Vi har også valgt de 4 miRNAs med stærke beviser for stabil udtryk i plasmaprøver fra mCRC patienter og testet dem i en mindre del af vores case serie. De 2 mest stabile miRNAs blev identificeret ved GeNorm analyse som reference husholdning gener.
Sammenfattende har vurdering af cirkulerende miRNAs i perifert blodprøver en række kendte problemer. Men vi mener, at vi anvendte metoder er pålidelige og robuste, giver mulighed for en grundig og præcis undersøgelse af disse biomarkører, som har potentiale til at ændre behandling scenario for kolorektal cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
Denne undersøgelse var delvist finansieret af Roche S.p.A. og den italienske medicin (AIFA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1,000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
- Luo, H. -Y., Xu, R. -H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
