Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Berige og udvide sjældne Antigen-specifikke T-celler med magnetisk nanopartikler

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58640
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,4
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 2Institute for Cell Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 3Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 4Department of Pathology, School of Medicine, Johns Hopkins University

Summary

Antigen-specifikke T-celler er vanskeligt at karakterisere eller udnytte på terapier på grund af deres ekstremt lavfrekvente. Heri, giver vi en protokol for at udvikle en magnetisk partikel, som kan binde sig til antigen-specifikke T-celler til at berige disse celler og derefter at udvide dem flere hundred-fold til både karakterisering og terapi.

Abstract

Vi har udviklet et værktøj til at både berige og udvide antigen-specifikke T-celler. Dette kan være nyttigt i tilfælde såsom A) afsløre eksistensen af antigen-specifikke T-celler, B) sonde dynamikken i antigen-specifikke svar, C) forstå sådan antigen-specifikke svar påvirker sygdommen stat som autoimmunitet, D) afmystificere heterogene svar til antigen-specifikke T-celler eller E) udnytte antigen-specifikke celler for terapi. Værktøjet er baseret på en magnetisk partikel at vi konjugat antigen-specifikke og T-celle co-stimulatory signaler, og at vi betegner som kunstige antigen præsentere celler (aAPCs). Derfor, da teknologien er nemt at producere, det kan let vedtages af andre laboratorier; således, vores formål her er at beskrive i detaljer, fabrikation og efterfølgende brug af aAPCs. Vi forklare, hvordan du vedhæfter antigen-specifikke og co-stimulatory signaler til aAPCs, hvordan du udnytter dem til at berige for antigen-specifikke T-celler, og hvordan at udvide antigen-specifikke T-celler. Derudover vil vi fremhæve engineering design overvejelser baseret på eksperimentel og biologiske oplysninger af vores erfaring med karakterisering af antigen-specifikke T-celler.

Introduction

Med fremkomsten af mange immunoterapi er der behov for at kunne karakterisere og styre immunrespons. Især er den adaptive immunrespons af interesse på grund af specificitet og holdbarhed af celler. For nylig, kimære-antigen-receptor T-celle terapi er blevet godkendt til kræftbehandling; antigen-receptorer er imidlertid baseret off den fælles celle overflade antigen CD19, i stedet for de antigener, der er specifikke for kræft1. Ud over specificitet, kan immunoterapi også lider af manglen på kontrol og begrænset forståelse den dynamiske immunrespons inden for kræft eller autoimmunitet.

En af udfordringerne ved at studere antigen-specifikke svar er deres ekstremt lavfrekvente, fx., antigen-specifikke T-celler er 1 af hver 104 til 106 T celler2,3. Således, for at undersøge hvilke T celler er til stede eller reagerer, cellerne skal enten beriget og udvidet, eller deres signalet skal forstærkes. Det er dyrt og vanskeligt at opretholde feeder celler ved hjælp af aktuelle teknikker der fokuserer på ekspansion af antigen-specifikke celler. Nuværende metoder, der fokuserer på forstærke signalet fra antigen-specifikke T-celler, som de enzym-forbundet immunospot (ELISPOT) assay, begrænse anvendelsen af disse T celler4. Endelig, på grund af lav følsomhed, disse to teknikker skal ofte kombineres til antigen-specifikke tælling.

For at løse disse problemer, har vi udviklet den magnetiske nanopartikel-baserede kunstige antigen præsentere celler (aAPC)5,6,7,8. AAPC kan være functionalized med en antigen-specifikke signal-peptid indlæst store histocompatibility complex (pMHC)- og co-stimulatory molekyler -f.eks., en anti-CD28 antistof-både berige antigen-specifikke T-celler og derefter efterfølgende stimulere deres ekspansion (figur 1). Partiklerne kan således være en omkostningseffektiv off-the-shelf produkt, der kan være både tilpasses antigen-specifikke stimulering og standardiseret på tværs af eksperimenter og patienter. Udfører berigelse og udvidelse processen resulterer i flere hundrede til tusinder-fold ekspansion af antigen-specifikke CD8 + T celler og kan resultere i frekvenser op til 60 procent efter blot en uge, gør det muligt for karakterisering eller terapeutisk brug af den store antallet af celler. Heri, vi beskriver hvordan man laver nanopartikel aAPCs, nogle vigtige Designovervejelser i at vælge egenskaberne nanopartikel og viser nogle typiske resultater i at udnytte disse partikler i isolering og udvide sjældne antigen-specifikke CD8 + T celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle mus blev opretholdt pr. retningslinjer godkendt af Johns Hopkins Universitys institutionelle Review Board.

1. Læg dimerisk Major Histocompatibility Complex Immunoglobulin Fusion Protein (MHC-Ig) med ønskede Antigen peptid sekvens.

Bemærk: Hvis du bruger H - 2Kb: Ig, så Følg protokollen detaljeret i trin 1.1; Hvis du bruger H-2Db:Ig og derefter følge protokollen detaljeret i trin 1.2.

  1. Aktive indlæsning af peptid sekvens i H - 2Kb: Ig.
    1. Forberede nødvendige buffere. Forberede denaturering buffer ved at gøre en løsning af 150 NaCl og 15mM Na2CO3 i deioniseret vand og derefter justere pH til 11,5. Forberede genopretning buffer ved at gøre en løsning af 250 mM Tris HCl i deioniseret vand og justere pH til 6,8.
      Bemærk: Typisk, det vil kræve ca. 5 mL både denaturering og genopretning buffere til 1 mg af H - 2Kb: Ig.
    2. Denaturere H - 2Kb: Ig til at tillade øget peptid bindende. Bringe H - 2Kb: Ig koncentration til mellem 0,5-2 mg/mL med fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Derefter fortyndes H - 2Kb: Ig til en endelig koncentration på 100-200 µg/mL med 5-10 bind ækvivalenter af denaturering buffer og tillade for at Inkuber ved stuetemperatur i 15 min.
    3. Tilføje 50 kindtand overskud af peptid sekvens (normalt stock peptid holdes på 1 mM på-80 ° C) til H - 2 Kb: Ig løsning.
      Bemærk: Normalt peptid antigener bliver nødt til at være opløst inden for mindst 10% dimethylsulfoxid (DMSO) og derefter tilsættes langsomt til PBS skal forblive opløselige. Afhængigt af aminosyresekvens, kan mængden af DMSO skal øges.
    4. Renaturere H - 2Kb: Ig med peptid. Umiddelbart efter tilsætning af peptid, bringes opløsningen til en pH-værdi på 7,4 ved at tilføje genopretning buffer. Den neutraliseret opløsning henstår inkuberes i 48 timer ved 4 ° C.
    5. Koncentrere sig og vaske peptid-loaded H - 2Kb: Ig. udnytter en centrifugal koncentrator med 50 kDa molekylvægt afskæring (MWCO), skal du følge producentens anvisninger til at vaske det peptid-loaded H - 2Kb: Ig løsning 3 gange med PBS, koncentrere sig til mindst 1 mg/mL og kvantificere koncentrationen på et spektrofotometer.
  2. Aktive indlæsning af peptid sekvens i H-2Db:Ig.
    1. Forberede nødvendige buffere. Forberede denaturering buffer ved at gøre en løsning af 131 mM citronsyre, 150 mM NaCl og 124 mM Na2HPO4 i deioniseret vand og derefter justere pH-værdien til 6,5. Forberede genopretning buffer ved at gøre en løsning af 120 mM Tris HCl i deioniseret vand og justere til pH 8,8.
      Bemærk: Typisk, det vil kræve ca. 5 mL denaturering buffer og 1 mL af genopretning buffer til 1 mg af H-2Db:Ig.
    2. Denaturere H-2Db:Ig at tillade øget peptid bindende. Bringe H-2Db:Ig koncentration til en endelig koncentration på 0,5-2 mg/mL med PBS. Derefter fortyndes H-2Db:Ig til en endelig koncentration på 100-200 µg/mL med 5-10 bind ækvivalenter af denaturering buffer.
    3. Tilføje 50 kindtand overskud af peptid sekvens (normalt stock peptid holdes på 1 mM på-80 ° C) til H-2Db:Ig løsning og Inkuber i 1 time ved 37 ° C.
    4. Tilføje β2 mikroglobulin og renaturere H-2Db:Ig med peptid. Tilføje 2-fold kindtand overskud af β2 mikroglobulin. Derefter bringes opløsningen til en pH-værdi på 7,4 ved at tilføje genopretning buffer. Den neutraliseret opløsning henstår inkuberes i 24 timer ved 4 ° C.
    5. Koncentrere sig og vaske peptid-loaded H-2Db:Ig. udnytter en centrifugal koncentrator med en 50 kDa MWCO, Følg producentens anvisninger til at vaske det peptid-loaded H - 2 Kb: Ig løsning 3 gange med PBS, koncentrat til mindst 1 mg/mL og kvantificere de koncentration på et spektrofotometer.

2. konjugat MHC-peptid komplekser og Co-Stimulatory molekyler på overfladen af magnetiske nanopartikler at danne nanopartikel kunstige Antigen præsentere celler. Brug en af tre forskellige metoder afhængigt af partikelstørrelse og anvendelse.

Bemærk: En række forskellige teknikker kan bruges til konjugat proteiner til overfladen af partikler. 3 separate tilgange er beskrevet: Amin-belagt partikler (trin 2.1), N-hydroxysuccinimide (NHS)-coatede partikler (trin 2.2) og biotin-belagt partikler (trin 2.3). Disse processer er også blevet beskrevet i detaljer i afsnittet metoder i to afhandlinger publicerede6,7. Udføre alle trinene i en biosikkerhed stinkskab med steril løsninger at bevare steriliteten af stock aAPC partikler.

  1. Frakke antigen-specifikke og stimulerende signaler til Amin-belagt magnetiske partikler (figur 2). Denne proces er beskrevet for 100 nm, Amin-belagt superparamagnetisk nanopartikler.
    Bemærk: Detaljerede protokoller til fastgørelse af antistof på overfladen af en Amin belagt partikel kan findes på https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, hvor Technote 201 beskriver hvordan til thiolate antistoffer og konjugat til maleimide functionalize partikler og 202 beskrive processen skulle functionalize Amin-belagt partikler med maleimide funktionelle grupper. Her, er kun mindre ændringer fremhævet for MHC-Ig og co-stimulatory signaler tilknyttet disse partikler.
    1. Thiolate antistoffer med Trauts reagens (Technote 201).
      1. Forberede en 10 x PBS-ethylendiamintetra syre (EDTA) buffer (0,1 M PBS og 100 mM EDTA). Tilføje 10 x PBS-EDTA buffer til antistoffer på en 1:10 forhold at forhindre oxidation af frie dithioler føjet til antistoffer.
      2. Tilføj 20 kindtand overskud af Trauts reagens (2-iminothiolane) til antistoffet og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur med blanding. Afmåle den Traut reagens (tørt pulver) inden for en kemisk stinkskab at undgå respiration som det konverterer amine grupper til thiol grupper.
      3. Vask grundigt med 1 x PBS-EDTA buffer 3 gange ved hjælp af en centrifugal koncentrator med en 50 kDa MWCO, og følg producentens anvisninger, at koncentrere indtil en endelige mængden af 500 µL. måle koncentrationen af antistof løsning ved hjælp af en Spektrofotometer.
    2. Konvertere Amin funktionelle grupper på den magnetiske nanopartikel til maleimide grupper ved hjælp af sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyklohexan-1-carboxylat (Sulfo-Investeringsfondene, Technote 202).
      1. Tilføje 10 x PBS-EDTA buffer til antistoffer på en 1:10 forholdet til partiklerne.
      2. Opløse Sulfo-Investeringsfondene i deioniseret vand og vortex til resuspend ved en koncentration på 1 mg/mL. Afmåle Sulfo-Investeringsfondene (tørt pulver) inden for en kemisk stinkskab at undgå respiration som det konverterer amine grupper til maleimide grupper.
      3. Tilføje 0,016 nmol Sulfo-Investeringsfondene løsning for hver kvadrat millimeter areal af partikler. 1 mg 100 nm partiklerne, bruge 0,3 mg af Sulfo-Investeringsfondene. Gør det muligt for at reagere i 1,5 timer ved stuetemperatur.
      4. Vaske partikler med 1 x PBS-EDTA buffer 3 gange ved hjælp af et magnetfelt med en magnetisk kolonne og resuspend i 500 µL 1 x PBS-EDTA buffer.
        Bemærk: Hvis du bruger partikler mindre end 200 nm, som for 100 nm partikler beskrevet heri, mest sandsynligt permanente magneter vil ikke være kraftig nok til at trække partikler for vask eller koncentrere formål. Således, for at vaske de mindre partikler, bruge en magnetisk kolonne består af ferromagnetisk kugler til at forstærke det magnetiske felt.
    3. Reagere maleimide-functionalized partikler med thiolated antistoffer (Technote 201).
      1. Tilføje partikler til et glas scintillation hætteglas, tilføje en mini-magnetiske rør bar, placere bare en tomme over en magnetisk røre pladen og fremkalde magnetiske blanding af partikel løsning.
      2. De blande løsning, tilføje thiolated antistoffer (0,5 mg af antistof til hver 1 mg partikler) dråbevis. Gør det muligt for at reagere natten over ved stuetemperatur.
      3. Vask med 1 x PBS buffer 3 gange ved hjælp af et magnetisk felt og resuspend i 500 µL 1 x PBS. Etiket og opbevares ved 4 ° C i op til 6 måneder.
        Bemærk: Maksimal konjugation effektivitet opstår, når maleimide-functionalized partikler er straks blandet med thiolated protein.
  2. Frakke antigen-specifikke og stimulerende signaler til NHS-belagt magnetiske partikler (figur 3). Denne proces er beskrevet for 200 nm, NHS-belagt superparamagnetisk nanopartikler.
    1. Forberede resuspension buffer, quenching buffer og opbevaring buffer. Resuspension buffer er 25 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre (MES) med 0,01% Tween 20 justeres til pH 6.0. Den dæmper buffer er en 100 mM løsning af Tris-HCl pH-værdi på 7,4. Opbevaring buffer er en opløsning af 10 mM PBS og 0,01% Tween ved pH 7,4.
    2. Resuspend de frysetørrede partikler i 1 mL af resuspension buffer. Vortex kraftigt i mindst 15 min. indtil ingen aggregater er synlige.
    3. Placer de magnetiske partikler på en magnetisk stand til at fjerne supernatanten, resuspend med 0,5 mL af resuspension bufferen og overføre til et glas scintillation hætteglas. Vortex indtil ingen aggregater er synlige.
    4. Tilføje 0,1 mg samlede proteinindhold i 1 mg af resuspenderede partikler. Vortex at blande og reagere ved stuetemperatur i 2,5 timer mens blanding.
    5. Der tilsættes 0,1 mL quenching buffer og reagere ved stuetemperatur i 30 min. mens blanding.
    6. Placer scintillation hætteglasset på en magnetisk stå og vaske partikler. Vent, indtil supernatanten er klart til at fjerne. Fjerne partiklerne fra magnetiske standeren, tilsættes 1 mL af resuspension buffer og vortex, indtil nogen aggregater er synlige. Gentag denne proces, tre gange og resuspend partiklerne i 1 mL af resuspension buffer. Gemme partikler ved 4 ° C i op til 6 måneder.
  3. Frakke antigen-specifikke og stimulerende signaler til biotin-belagt magnetiske partikler (figur 4). Denne proces er beskrevet for 50-100 nm, anti-biotin superparamagnetisk nanopartikler.
    1. Biotinylate MHC-Ig eller co-stimulatory molekyler.
      1. Justere proteinkoncentration til 0,5-2 mg/mL i PBS buffer. Resuspend sulfo-NHS-biotin i en koncentration på 10 mg/mL deioniseret vand og tilføje 20-fold kindtand overskydende til stimulerende antistof. Inkuber ved stuetemperatur i 45 min.
      2. Vask grundigt med PBS 3 gange ved hjælp af en centrifugal koncentrator med en 50 kDa MWCO, Følg fabrikantens anvisninger, koncentrerer sig indtil en endelige mængden af 500 µL. måle koncentrationen af antistof løsning ved hjælp af et spektrofotometer.
    2. Konjugerede biotinylated MHC-Ig og/eller co-stimulatory signaler til anti-biotin nanopartikler. Til 500 µL af stock anti-biotin partikler, tilføje 0,5 nmol stimulerende antistof og inkuberes ved 4 ° C natten over.
    3. Vask konjugeret aAPC nanopartikler. Da disse partikler er mindre end 200 nm, våd en magnetisk kolonne og sat på et magnetisk stativ.
    4. Tilføje partikel/protein suspension til kolonnen. Tillad alle protein/partikler ind helt kolonnen.
    5. Vask ved at tilføje 0,5 mL PBS tre gange til kolonnen.
    6. Elueres ved at fjerne kolonnen fra magnetiske standeren, tilføje 0,5 mL PBS til kolonnen og bruge stemplet, expulse partikel aAPCs i et glas scintillation hætteglas. Gemme partikler ved 4 ° C i op til 6 måneder.
      Bemærk: Partikler er stabile ved 4 ° C (ikke må være frosne) for op til 6 måneder. Højere temperaturer nedsætte funktionaliteten af partikler og nogle partikel sammenlægning har overholdt (data ikke vist). Må ikke holde ved stuetemperatur i længere perioder af tid som dette betydeligt reducerer holdbarheden af partikler.

3. karakterisere proteinindhold på kunstige Antigen præsentere celle nanopartikler med påvisning af fluorescerende antistof.

Bemærk: Dette er en nyttig kontrol med kvaliteten af den producerede kunstige antigen præsentere celler. Mængden af stimulerende signal bruges også til at producere tilsvarende aAPC doser på tværs af partier og forskellige aAPC-typer (fx., forskellige størrelser).

  1. Måle partikel koncentrationen af belagt aAPCs.
    1. Bruge ukonjugeret partikler fra stamopløsningen og gøre en 1:2 dosis titreres i en opløsning af PBS på tværs af en 96-brønd fladbundede plade med 100 µL pr. brønd.
    2. Læs partikler på en plade-læsning Spektrofotometer ved 405 nm til at oprette en standardkurve fra en kendt partikel koncentration.
    3. Tage en prøve af den konjugerede aAPCs, fortyndes i PBS til en samlet maengde paa 100 µL og læse på spektrofotometret.
  2. Fjerne en prøve af fabrikerede aAPCs og plette med fluorescerende antistoffer.
    1. For at beregne hvor meget prøve at fjerne, estimere antallet af antistoffer på overfladen af partiklen.
      Bemærk: Disse teknikker, Antag en tæthed på omkring 1000 antistoffer/µm2 partikel overfladeareal. For at være i stand til at opdage fluorescens, kræver det omkring 1011 MHC-Ig eller CD28 molekyler samlede pr. fluorescerende test.
    2. Bringe den samlede mængde af aAPCs op til 100 µL i PBS, tilføje farvning antistoffer i en 1: 100 fortynding og Inkuber i 1 time ved 4 ° C.
      Bemærk: Eksempel antistoffer med held brugt FITC konjugeret rotte-anti mus Ig λ1, λ2, λ3 lys kæde, klon R26 46 ægprodukters MHC-Ig, og FITC konjugeret mus anti armensk/syriske hamster IgG, klon G192-1, for at opdage anti-mus CD28.
  3. Vask partiklerne og læse fluorescens på en fluorescerende pladelæseren.
    1. Magnetisk vask (som beskrevet i trin 2) farvede aAPC brøker tre gange med 0,5 mL PBS.
    2. Elueres den vasket aAPCs med 0,5 mL PBS.
    3. Tilføje 100 µL af den eluted aAPCs til en 96-brønd fladbundede plade at læse koncentrationen ved hjælp af absorbans som i trin 3.1.
    4. Tag de resterende 400 µL, delt op i to 200 µL delprøver og tilføje to brønde i en sort, polystyren 96-brønd, fladbundede plade. Titreres i forholdet 1:2 ned pladen ved at tage 100 µL af opløsningen og blande med den næste brønd, der har 100 µL af PBS i hvert godt mindst fire gange.
      NOTE: Gennemsnitlige flere replikater af måling til at reducere støj i målingen.
    5. Den samme sorte 96-brønd plade, foretag en standardkurve fluorescerende antistof bruges til plet, ved at tilføje det i 1:200 i en brønd med 200 µL af PBS og tilsætningen ned på 1:2 forholdet til mindst 12 brønde.
    6. Efter både aAPC og fluorescerende antistoffer er på pladen, læse pladen med en fluorescerende pladelæseren.
  4. Beregne mængden af protein pr. partikel. Bestemme koncentrationen af antistof ved at sammenligne værdier på standardkurven, hvor antistof koncentration er kendt, forudsat at forholdet 1:1 af farvning antistof mod opdaget antistof. Derefter dividere dette koncentrationen af detekterede antistof med koncentrationen af partikler bestemmes af absorbans analysen vil give antallet af antistoffer per partikel.

4. berige Antigen-specifikke CD8 + T celler med rede nanopartikel kunstige Antigen præsentere celler.

  1. Isolere CD8 + T-celler.
    1. Aflive dyr ved eksponering for isofluran efterfulgt af cervikal dislokation.
    2. Fjern milt og lymfeknuder fra vildtype C57BL/6j mus og placere i en opløsning af PBS. Udblødte organer og elueres celler gennem en steril 70 µm celle si med hyppig vask af PBS.
    3. For at fjerne ikke - CD8 + T celler, skal du bruge en no touch CD8 + T celle isolering kit og Følg fabrikantens anvisninger.
      Bemærk: Hver antigen betingelse kræver mindst 3 x 106 CD8 + T celler.
  2. Tilføje nanopartikel aAPCs bindes til CD8 + T-celler.
    1. Efter isolering, koncentreres til en volumen på 100 µL i PBS med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 2 mM EDTA.
    2. Bestem antallet af aAPCs til at tilføje ved at beregne baseret på forholdet mellem 1011 aAPC-bundet, peptid-læsset MHC-Ig for hver 106 CD8 + T celler.
    3. Inkubér aAPC partikler og CD8 + T celler i 1 time ved 4 ° C med kontinuerlig blanding i en steril 5 mL polystyren runde nederste rør.
  3. Forberede suppleres med medier og T-celle vækstfaktor (TCGF) at eluere og kultur CD8 + T-celler.
    1. Suppleres med medier, supplere komplet RPMI 1640 medier (med glutamin) med 1 x ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM natrium pyruvat, 0,4 x vitamin løsning, 92 µM 2-mercaptoethanol, 10 µM ciprofloxacin og 10% føtal bovint serum (FBS).
    2. At gøre TCGF, Følg de protokoller allerede etablerede og der refereres til her9.
      Bemærk: TCGF er en in-house cocktail af human immun cytokiner, som er afgørende for at give T-celler med ekstra stimulation signaler skal øges. TCGF kunne veksles til kendte T-celle stimulerende cytokiner såsom IL-2, IL-7, eller IL-15; dog kan hver polarisere T-celle respons i overensstemmelse hermed. Protokollen beskrevet heri ikke er blevet optimeret med disse cocktails; således andre teknikker bør konsulteres for koncentrationer og kombinationer hvis TCGF ikke bruges med eksempler opført10,11.
  4. Vask og berige aAPC og CD8 + T celle blanding.
    1. Vaske den magnetiske partikel aAPCs som beskrevet i trin 2. Dog vaskes først med PBS buffer med 0,5% BSA og 2 mM EDTA, anden bruger suppleret medier og tredje bruger suppleret medier med 1% TCGF.
    2. Elueres aAPCs og beriget CD8 + T-celler i 500 µL af suppleret medier med 1% TCGF.
    3. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer og plade i en 96 rundbundede plade i 160 µL pr. brønd suppleret medier med 1% TCGF i en koncentration på 2,5 x 105 CD8 + T celler/mL.
    4. Hvis isolere ved hjælp af aAPCs med kun læsset peptid-MHC-Ig på overfladen (ingen co-stimulatory signaler), derefter komplet trin 4.5. Hvis isolere ved hjælp af aAPCs med begge peptid-læsset MHC-Ig på de overflade og co-stimulatory signaler, derefter gå videre til trin 5.
  5. Tilføj de magnetiske partikler coated med co-stimulatory signaler på overfladen til den berigede brøkdel og tilføje et magnetisk felt for at samarbejde cluster de stimulerende signaler på overfladen af T-celler.
    1. Beriget fraktioner, tilføje en equimolar (eller mere afhængig af program-se afsnittet om aAPC egenskaber til kontrol) af stimulerende antistof til antallet af peptid-læsset MHC-Ig på partiklen.
    2. Tillad co-stimulatory magnetiske partikler til at binde til beriget CD8 + T-celler i 1 time ved 4 ° C.
    3. Tilføje magnetfelt ved at placere kultur plade mellem to neodym N52 disk magneter på 1,9 cm (0,75 tommer) i længden.
      Bemærk: N52 disk magneter har et meget stærkt felt. Bør udvises forsigtighed, både til at gemme dem med afstandsstykker mellem magneter, som det er svært at fjerne fra hinanden, og når de lægger dem på kultur plader. For at minimere magneter klistrer til metal komponenter i rugemaskinen, placere dem i 50 mL konisk tube Styrofoam containere på både i bunden og toppen.

5. Udvid og opdage Antigen-specifikke CD8 + T celler med rede nanopartikel kunstige Antigen præsentere celler.

  1. Tilføj de 96 rundbundede godt plade med aAPCs og CD8 + T-celler i en fugtig 5% CO2, 37 ° C inkubator for 3 dage. På dag 3, at fodre celler med 80 µL pr. brønd suppleret medier med 2% TCGF og sted tilbage i inkubatoren indtil dag 7.
  2. På dag 7, skal du høste stimuleres cellerne i en 5 mL rund bund tube til optælling.
  3. Når alle de af løsning er høstet, spin ned høstede celler til resuspend i 0,5 mL PBS med 0,05% natriumazid og 2% FBS. Optælle levedygtige celler ved farvning med trypan blå og regner med en hemocytometer.
  4. Fjern 50.000-500.000 optalte celler i to nye 5 mL rund bund rør til antigen-specifikke farvning. Et rør vil blive brugt til beslægtet peptid-MHC pletten, og andre røret bruges til ikke-cognate pletten til at bestemme baggrunden farvning.
  5. Tilføje 1 µg for biotinylated MHC-Ig (ved hjælp af den teknik beskrevet i trin 2) til de respektive cognate og ikke-cognate rør i 100 µL af PBS med 0,05% natriumazid og 2% FBS med allophycocyanin (APC)-konjugeret rotte anti-mus CD8a, klon 53-6,7 (fortyndingsforholdet af 1: 100) i 1 time ved 4 ° C.
  6. Tilføje sekundære streptavidin og levende døde pletter. Udviske overskydende biotinylated MHC-Ig med PBS gennem centrifugering. Derefter pletten alle prøver med en 1:350 forholdet mellem phycoerythrin (PE)-mærket streptavidin og 1:1000 forholdet mellem en live/døde fixable grønne døde celle plet i 15 min. ved 4 ° C.
  7. Læs alle prøver på en flow forskellige til at bestemme specificitet og antallet af antigen-specifikke celler.
    1. Udviske overskydende sekundære og live/døde pletter ved centrifugering og resuspend med 150 µL af PBS buffer med 0,05% natriumazid og 2% FBS at læse på en flow Flowcytometret.
  8. Bestemme antallet af og procent af antigen-specifikke celler med data analyse software.
    1. Bestem procentdelen af antigen-specifikke celler, skal du bruge følgende porte i de respektive rækkefølge live + lymfocyt + (forward scatter af side scatter), CD8 + og Dimer +. Find Dimer + porten ved at sammenligne den ikke cognate til beslægtet pletten.
    2. Bestemme procentdelen af antigen-specifikke celler i en prøve ved at fratrække procentdelen af Dimer + af beslægtet MHC-Ig pletten fra ikke-cognate MHC-Ig bejdse.
    3. Ved hjælp af denne procentdel af antigen-specifikke celler formere det med antallet af celler tælles, giver antallet af antigen-specifikke celler resulterende fra berigelse og udvidelse.
      Bemærk: Kompensation vil skulle sættes op på flow-Flowcytometret, da der er spektrale overlapning med fluorophores anvendes i dette panel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at fuldføre en vellykket berigelse og udvidelse af antigen-specifikke T-celler, bør peptid-læsset MHC-Ig og co-stimulatory molekyler være korrekt knyttet til aAPC partikel. Baseret på de 3 metoder af partikel vedhæftet fil, leverer vi nogle repræsentative data for et vellykket konjugation procedure resultat (figur 5a). Faktisk, hvis ligand tæthed er for lav, så der vil ikke være effektiv stimulation af antigen-specifikke CD8 + T celler hvor dette sker omkring lineær afstand mellem ligander over 100 nm i vores erfaring (figur 5b)7.

Udover både kvantitative fluorescerende antistof readouts og transgene CD8 + T celle udvidelser, kan nanopartikel aAPCs kontrolleres for kvalitetskontrol af doping i beslægtet transgene antigen-specifikke CD8 + T celler. Dette kan gøres ved at isolere CD8 + T celler fra et Transgene mus som en Pmel-mus, der har gp100-specifikke antigen-specifikke CD8 + T celler og doping til en B6 baggrund i forholdet 1:1000. Optælling og farvning før og efter berigelse tillader tælling af både fold berigelse (figur 6a) og procent opsving (fig. 6b)6. I disse repræsentative resultater vise vi at signal-1 kun aAPCs give den de fleste effektiv berigelse (næsten 10-fold) og ca. 80% celle opsving, der er forbedret over traditionelle signal 1 og 2 aAPCs, som har ikke-specifikke anti-CD28 på partiklen så godt.

Endnu en partikel aAPCs er blevet tilstrækkeligt karakteriseret og kvalitet kontrolleres, så de kan bruges i berigelse og udvidelse af sjældne antigen-specifikke CD8 + T celler fra vildtype mus. For nøjagtige resultater er det afgørende at have funktionelle påvisning reagenser, såsom biotinylated dimer. Kvalitetskontrol af biotinylated dimer kan også gøres på transgene CD8 + T-celler til at kontrollere farvning. Her, viser repræsentative resultater positive farvning med gp100-specifikke CD8 + T celler med B6 CD8 + T-celler som baggrund kontrol (figur 7). Figur 7 viser også, at hvis der er for høje niveauer af biotinylated dimer, så det vil sænke dens aviditet, som det vil konkurrere med sig selv og udstille mono-valent bindende.

Efter berigelse og udvidelse af musen CD8 + T celler i syv dage, kan man forvente mellem 5 og 50 procent antigen-specifikke CD8 + T celler, med næsten 20.000 til 200.000 antigen-specifikke CD8 + T celler efter start med 5 x 106 CD8 + T celler pr. betingelse (Figur 8) 6. specielt, når farvning for antigen-specifikke CD8 + T celler, det er afgørende at kende baggrunden farvning af biotinylated dimer, hvor i dette tilfælde det var 4,15%; enhver procent lavere end dette fra beslægtet pletten betragtes som et negativt resultat (figur 8a). Derudover vil det vise hvor man kan tegne flow flowcytometri gates for at bestemme den faktiske procentdel af antigen-specifikke CD8 + T celler. Dette er vigtigt i tilfælde, hvor antigen-specifikke CD8 + T celler ikke har forskellige populationer (som vist i figur 8a) men kan vises som en lang smøre.

Den samme proces kan bruges til at isolere og stimulere menneskelige antigen-specifikke CD8 + T celler. Lignende kvalitetskontrol og resultater bør ses hvor betydelige stigninger i procenter og tal af antigen-specifikke CD8 + T celler er observeret efter kun en uge efter udvidelse efter berigelse (figur 9)5.

Figure 1
Figur 1 : Skematisk af antigen-specifikke berigelse og udvidelse ved hjælp af nanopartikler kunstige antigen-præsenterer celler. Først, komplet en no touch CD8 + T celle isolation. Derefter tilføje nanopartikel aAPCs til CD8 + T-celler. Berige med et magnetisk felt, kultur, og stimulere med aAPCs. Endelig, opdage beriget og udvidet antigen-specifikke CD8 + T celler ved flowcytometri. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: skematisk for de tråddannende peptid-læsset MHC-Ig og co-stimulatory molekyler på overfladen af amin-belagt magnetiske partikler. Kort, Sulfo-Investeringsfondene crosslinker bruges til at functionalize den magnetiske partikel overflade med maleimide funktionelle grupper. MHC-Ig og co-stimulatory molekyler er samtidig functionalized med Trauts reagenser til at producere thiol funktionelle grupper. Aktiveret partikler og protein signaler er reagerede sammen og derefter vaskes for at producere antigen-specifikke kunstige antigen-præsenterer celle magnetiske nanopartikler. Dette tal er blevet ændret fra supplerende materiale i vores laboratorium publikation i Nano bogstaver7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: skematisk for de tråddannende peptid-læsset MHC-Ig og co-stimulatory molekyler på overfladen af NHS-belagt magnetiske partikler. Kort, NHS-belagt partiklerne er reageret peptid-læsset MHC-Ig og co-stimulatory molekyler og derefter vaskes for at producere antigen-specifikke kunstige antigen-præsenterer celle magnetiske nanopartikler. Dette tal er blevet ændret fra supplerende materiale i vores laboratorium publikation i Nano bogstaver7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Skematisk for de tråddannende peptid-læsset MHC-Ig og co-stimulatory molekyler på overfladen af biotin-belagt magnetiske partikler. MHC-Ig og co-stimulatory molekyler er functionalized med NHS-biotin til at fremstille biotin funktionsgrupper. Så de biotin-belagt partikler er reagerede functionalized peptid-læsset MHC-Ig og co-stimulatory molekyler. Disse partikler er bagefter, vaskes for at producere antigen-specifikke kunstige antigen-præsenterer celle magnetiske nanopartikler. Dette tal er blevet ændret fra supplerende materiale i vores laboratorium publikation i Nano bogstaver7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Konjugation effektivitet er kritisk for berigelse og udvidelse af antigen-specifikke T-celler. (a) repræsentative data for konjugation effektivitet med de tre konjugation metoder til tre forskellige basere magnetiske partikler beskrevet i papiret: Amin-belagt partikler, NHS-belagt partikler og biotin-belagt partikler. Hvert datapunkt repræsenterer en anden partikel forberedelse teknik mens fejllinjer S.E.M. (b) hvordan ligand tæthed påvirker transgene CD8 + T-celle stimulation, hvor ligand tæthed er repræsenteret som lineær afstand mellem ligander i nanometer på 600 nm og 50 nm aAPCs (n = 5 og fejllinjer repræsenterer S.E.M.). Dette tal er blevet ændret fra vores laboratorium publikation i Nano bogstaver7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Kvalitetskontrol af aAPC berigelse. Transgene Pmel gp100-specifikke CD8 + T celler var dopede i på et 1:1000 forhold til vildtype B6 CD8 + T celler. a fold berigelse blev målt ved hjælp af flowcytometri efter berigelse af farvning congenic markør Thy1.1 og CD8. Her var en sammenligning mellem signal 1 eneste partikler eller Db-Ig fyldt med gp100, traditionelle signal 1 og 2 partikler eller Db-Ig fyldt med gp100 og anti-CD28 og ikke-cognate signal 1 og 2 partikler. b celler blev også talt før og efter at måle celle opsving af hver af metoderne. Data repræsenterer tre uafhængige forsøg og fejl barer repræsenterer S.E.M. Data kombineret blev målt af en-vejs ANOVA med Tukeys post-test (*p< 0,05, **p< 0,01). Dette tal er blevet ændret fra vores laboratorium publikation i Nano bogstaver6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Kvalitetskontrol af biotinylated dimer. Gp100-specifikke CD8 + T celler blev isoleret fra en transgene Pmel mus og farves i 100 µL af PBS med tre koncentrationer af biotinylated Db-Ig fyldt med gp100 og APC anti-CD8a, ved hjælp af vildtype B6 CD8 + T celler som en negativ kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8 : Berigelse og udvidelse af antigen-specifikke CD8 + T celler. B6 vildtype CD8 + T celler blev beriget med enten signal 1 kun (Kb-Ig fyldt med TRP2) eller signal 1 og 2 (Kb-Ig fyldt med TRP2 og anti-CD28 konjugeret til overfladen af en partikel). Signal 2 blev derefter føjes til den berigede brøkdel af signal 1 eneste aAPCs og alle celler blev kulturperler i 7 dage. a CD8 + T celler farves og låge på en live/døde fluorescerende plet, så gated CD8 + og KbTRP2 +, og i forhold til en ikke-cognate Kb-Ig til at opdage antigen-specifikke CD8 + T celler. b procentdelen og (c) antal TRP2-specifikke CD8 + T celler kunne således bestemmes, hvor højere procentsatser og numre af antigen-specifikke CD8 + T celler kunne påvises fra signal 1 eneste berigelse tilgang (n = 7, fejllinjer repræsenterer standardafvigelse, to-sidet parret t-test *p < 0,05, **p < 0,01). Dette tal er blevet ændret fra vores laboratorium publikation i Nano bogstaver6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9 : Berigelse og udvidelse af menneskelige antigen-specifikke CD8 + T celler. a en repræsentant flow flowcytometri parceller på dag 0 før berigelse og dag 7 viser de dramatiske virkninger af berigende og udvide antigen-specifikke CD8 + T celler fra raske donorer med traditionelle nanopartikel aAPCs hvor A2-Ig fyldt med NY-ESO1 og A2-Ig fyldt med MART1 antigener er vist. (b) dette genererer høje procenter (~ 10-20%) og tal (0,5-1 x 106) af antigen-specifikke CD8 + T celler af dag 7 (n = 3 fra uafhængige donorer, fejllinjer repræsenterer S.E.M.). Dette tal er blevet ændret fra vores laboratorium publikation i ACS Nano5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1-Box 1. Venligst klik her for at downloade denne fil. 

Supplerende fil 2-Box 2. Venligst klik her for at downloade denne fil. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har lavet en roman antigen-specifikke T-celle afsondrethed teknologi baseret på nanopartikel kunstige antigen præsentere celler (aAPCs). Nanopartikel aAPCs har peptid-læsset MHC på den overflade, der giver mulighed for antigen-specifikke T-celle bindende og aktivering sammen med co-stimulatory aktivering. aAPCs er også Paramagnetiske, og dermed kan bruges til at berige sjældne antigen-specifikke T-celler ved hjælp af et magnetfelt. Vi har optimeret og studerede centrale nanopartikel egenskaber størrelse, ligand tæthed, og ligand valg og deres indflydelse på bindende, berigelse, aktivering og celle-berigelse (Supplerende fil 1-Box 1).

Således, de berigelse og udvidelse procedure resultater i antigen-specifikke CD8 + T celle ekspansion af flere fremstiller thousand-fold antigen-specifikke procenter så høj som 60% og kan anvendes i både murine og menneskelige indstillinger (Supplerende fil 2-Box 2 ). Sådanne høje tal og procenter af antigen-specifikke T-celler aktiverer karakterisering af immunrespons for sygdomme (fx., cancer, autoimmune, etc.), mulighed for opdagelsen af roman immun mål og mekanismer, og tilbyder mulighed for at være bruges i adoptive immunterapi. Et eksempel på et bestemt program er at sekvens en patients tumor, identificere mutationer, finde potentielle MHC-ringbind fra de mutante sekvenser, producere aAPCs med disse top kandidat antigener og derefter bruge aAPCs for at afgøre, om patienten har nogen tumor-specifik neoantigens.

Metodologiske begrænsninger har været en afgørende barriere til at studere og at identificere antigen-specifikke svar. Aktuelle teknikker kræve (a) betydelig tid - og arbejdsintensiv procedurer, (b) nuværende vanskeligheder med at opretholde cellelinjer såsom behovet for at indsamle autolog dendritiske celler, (c) kræver uger af T celle ekspansion forud for at opnå resultater, (d) resultat i lav særtræk (1-2%) og lavt antal af antigen-specifikke CD8 + T ikke kan celler, (e) ofte med betydelige baggrund signal, og (f) af CD8 + T celler, der er produceret ofte bruges eller studeret i yderligere assays. Én metode kræver immunisering med antigen før ELISPOT at karakterisere tilstedeværelsen af antigen-specifikke svar14,15,16,17. En anden metode udnytter tandem-mini-genekspression plasmider at transfect antigen præsentere celler kræver multiplexing tetramer pletter med cytokin + svar som IFNγ at øge følsomheden18. Selv peptid pulserende endogene antigen præsentere celler i in vitro- kultur, kun resulterer i en stigning på 0,5% i antigen specificitet15.

Vores tilgang løser disse metodologiske begrænsninger og kan således fungere som et diagnostisk og terapeutisk værktøj. Afgørende skridt til at sikre antigen-specifikke CD8 + T-celle berigelse og udvidelse er til 1) effektivt indlæse MHC-Ig med peptid antigen, 2) konjugat stimulerende signaler på overfladen af nanopartikler, 3) binder partiklerne til T-celler, 4) berige de celler, der er bundet til nanopartikler med et magnetisk felt, 5) udvide elueret nanopartikel-bundet T celler i kultur og 6) opdage antigen-specifikke CD8 + T celler på dag 7 med biotinylated, peptid-læsset MHC.

De vigtigste problemer, der opstår i den berigelse og udvidelse protokol skyldes enten forkert produktion eller udløbne påvisning reagenser eller nanopartikel aAPCs. Sikre, at biotinylated dimer kan plette antigen-specifikke CD8 + T celler med test på transgene antigen-specifikke CD8 + T celler. Hvis peptid-MHC-Ig ikke har en tilsvarende transgene musemodel, kan det være nyttigt at indlæse en positiv kontrol peptid og teste den positive kontrol for at kontrollere lastning. Men nogle peptider kan ikke indlæse i MHC-Ig; Dette kan simuleres med MHC-loading algoritmer som Net-MHC, eller med RMA-celle baseret eksperimentelt assays13. aAPC partikel stabilitet kan falde efter 6 måneder, så hvis der er nogle variation i berigelse og udvidelse resultater, så en anden fluorescerende plade læser assay kan udføres for at kontrollere stabiliteten.

I fremtiden arbejde, vi sigter mod at udvide kapaciteter, bredde og dybde i analysen. Vi arbejder på at øge overførselshastigheden og evnen til at multiplex med flere antigen undersøgt på én gang i en 96-brønd plade format. I øjeblikket er en væsentligste begrænsning, at kun et par antigener kan undersøges samtidigt. Det arbejder vi ved at undersøge, hvordan størrelsen af partikel aAPC og ligand tæthed påvirker berigelse. Derudover undersøger vi hvordan forskellige celle kompositioner effekt CD8 + T celle ekspansion inden for kultur. Endelig, vi sigter mod at efterligne denne teknologi inden for MHC klasse II skal kunne berige og udvide antigen-specifikke CD4 + T-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer den følgende konkurrerende finansielle interest(s): under en licensaftale mellem NexImmune og The Johns Hopkins University, Jonathan Schneck er berettiget til en del af royalty modtaget ved universitetet på salg af produkter, der er beskrevet i dette artikel. Han var også medstifter af NexImmune og ejer aktier i selskabet. Han fungerer som medlem af Neximmunes bestyrelse og videnskabelige rådgivende bestyrelse. Vilkårene for disse ordninger er gennemgået og godkendt af The Johns Hopkins University i overensstemmelse med dens interessekonflikt politikker.

Acknowledgments

J.W.H. tak NIH kræft nanoteknologi Training Center på Johns Hopkins Institute for nanobioteknologi, National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1232825) og BUER foundation for fellowship støtte. Dette arbejde blev finansieret med støtte fra National Institutes of Health (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/Maryland Innovation initiativ og Coulter Foundation (JPS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein BD Biosciences 551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig BD Biosciences 551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein BD Biosciences 550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932257
Purified Human Beta 2 Microglobulin Bio-Rad PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles Micromod 79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm Ocean Nanotech SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure Miltenyi 130-105-637
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217
Sulfo-SMCC Crosslinker  ProteoChem c1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene Corning 3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46   BD Biosciences 553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1 BD Biosciences 554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice Jackson Laboratory 005023
C57BL/6J (B6 wildtype) mice Jackson Laboratory 000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi 130-104-075
MS Columns Miltenyi 130-042-201
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE Biolegend 405203
N52 disk magnets of 0.75 inches  K&J Magnetics DX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 Biolegend 100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation  ThermoFisher L-34969

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. ,, et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).

Tags

Engineering sag 141 nanopartikler magnetiske berigelse kunstige antigen-præsenterer celler T-celler immunterapi kræft sjældne celle berigelse T-celle ekspansion adoptiv T-celleterapi Neoantigen immunoengineering bioteknologi
Berige og udvide sjældne Antigen-specifikke T-celler med magnetisk nanopartikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich … More

Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (141), e58640, doi:10.3791/58640 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter