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Engineering

समृद्ध और चुंबकीय नैनोकणों के साथ दुर्लभ प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का विस्तार

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58640
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,4
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 2Institute for Cell Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 3Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 4Department of Pathology, School of Medicine, Johns Hopkins University

Summary

प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं को अपने बेहद कम आवृत्ति के कारण चिकित्सा में विशेषता या उपयोग करने के लिए मुश्किल हैं । साथ ही, हम एक चुंबकीय कण जो प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं को इन कोशिकाओं को समृद्ध और फिर उंहें विस्तार करने के लिए कई सौ-लक्षण वर्णन और चिकित्सा के लिए गुना बांध कर सकते है विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।

Abstract

हम दोनों को समृद्ध और प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए एक उपकरण विकसित किया है । यह ऐसे मामलों में मददगार हो सकता है जैसे A) antigen-विशिष्ट T कक्षों के अस्तित्व का पता लगाने, B) antigen-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं की गतिशीलता की जांच, C) कैसे antigen-विशिष्ट प्रतिसाद प्रतिरक्षा जैसे रोग स्थिति को प्रभावित कैसे समझते हैं, D) रहस्यमय नहीं रखना विषम antigen-विशिष्ट T कक्षों के लिए प्रतिसाद, या ई) antigen-विशिष्ट कक्षों का उपयोग चिकित्सा के लिए । उपकरण एक चुंबकीय कण है कि हम संयुग्मी प्रतिजन-विशिष्ट और टी सेल सह stimulatory संकेतों पर आधारित है, और है कि हम शब्द के रूप में कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं (aAPCs) पेश । नतीजतन, चूंकि प्रौद्योगिकी के उत्पादन के लिए सरल है, यह आसानी से अंय प्रयोगशालाओं द्वारा अपनाया जा सकता है; इस प्रकार, हमारे यहां उद्देश्य के लिए विस्तार से निर्माण और aAPCs के बाद के उपयोग में वर्णन है । हम aAPCs के लिए antigen-विशिष्ट और सह-stimulatory संकेतों को अनुलग्न करने के लिए कैसे समझाते हैं, उंहें antigen-विशिष्ट t कक्षों के लिए समृद्ध करने के लिए उपयोग कैसे करें, और antigen-विशिष्ट t कक्षों का विस्तार कैसे करें । इसके अलावा, हम निस्र्पक प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के साथ हमारे अनुभव के प्रायोगिक और जैविक जानकारी के आधार पर इंजीनियरिंग डिजाइन विचार पर प्रकाश डाला जाएगा ।

Introduction

कई immunotherapies के उदय के साथ, वहां एक की जरूरत है करने के लिए विशेषताएं और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करने में सक्षम हो । विशेष रूप से, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की वजह से कोशिकाओं की विशिष्टता और स्थायित्व की ब्याज की है । हाल ही में, chimeric-प्रतिजन-रिसेप्टर टी सेल चिकित्सा कैंसर चिकित्सा के लिए अनुमोदित किया गया है; हालांकि, antigen-रिसेप्टर्स सामांय कक्ष सतह antigen CD19, कैंसर1के लिए विशिष्ट एंटीजन के बजाय बंद आधारित हैं । विशिष्टता से परे, immunotherapies भी नियंत्रण की कमी से पीड़ित कर सकते हैं, और कैंसर या प्रतिरक्षा के भीतर गतिशील प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को समझने सीमित ।

antigen-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने की चुनौतियों में से एक उनके बहुत कम आवृत्ति है, जैसे, प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं प्रत्येक 104 से 106 टी कोशिकाओं2,3के 1 हैं । इस प्रकार, जो टी कोशिकाओं मौजूद है या जवाब की जांच करने के लिए, कोशिकाओं को या तो समृद्ध और विस्तार, या उनके संकेत को परिलक्षित होने की जरूरत है की जरूरत है । यह महंगा है और मौजूदा तकनीकों का उपयोग कर फीडर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए मुश्किल है कि प्रतिजन-विशिष्ट कोशिकाओं के विस्तार पर ध्यान केंद्रित । वर्तमान तकनीक है कि प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के संकेत बढ़ाना पर ध्यान केंद्रित, एंजाइम से जुड़े immunospot (ELISPOT) परख की तरह, उन टी कोशिकाओं के पुनः उपयोग की सीमा4। अंत में, कम संवेदनशीलता के कारण, अक्सर इन दो तकनीकों antigen-विशिष्ट गणन के लिए संयोजित करने की आवश्यकता है ।

इन समस्याओं को हल करने के लिए, हम चुंबकीय nanoparticle-आधारित कृत्रिम antigen प्रस्तुत कक्ष (aAPC)5,6,7,8विकसित किया है । aAPC एक प्रतिजन-विशिष्ट संकेत-पेप्टाइड भरी हुई प्रमुख histocompatibility जटिल (pMHC) और सह stimulatory अणुओं-जैसे, एक विरोधी CD28 एंटीबॉडी-दोनों को समृद्ध प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के साथ कार्यात्मक किया जा सकता है और फिर बाद में उनके विस्तार को उत्तेजित (चित्रा 1) । कणों इस प्रकार एक लागत प्रभावी बंद-the-शेल्फ उत्पाद है कि दोनों प्रतिजन-विशिष्ट उत्तेजना अभी तक प्रयोगों और रोगियों में मानकीकृत को पूरा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता हो सकता है । हजारों करने के लिए सैकड़ों में संवर्धन और विस्तार प्रक्रिया परिणाम प्रदर्शन प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं का विस्तार गुना और आवृत्तियों में परिणाम कर सकते हैं ६० प्रतिशत तक सिर्फ एक सप्ताह के बाद, बड़े के लक्षण वर्णन या चिकित्सीय उपयोग को सक्षम करने कक्षों की संख्या । साथ ही, हम वर्णन कैसे nanoparticle aAPCs बनाने के लिए, nanoparticle गुणों को चुनने में कुछ महत्वपूर्ण डिजाइन विचार, और अलग और दुर्लभ प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं के विस्तार में इन कणों के उपयोग से कुछ विशिष्ट परिणाम प्रदर्शित करता है ।

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Protocol

सभी चूहों जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित दिशा निर्देशों के प्रति बनाए रखा गया ।

1. लोड Dimeric प्रमुख Histocompatibility जटिल Immunoglobulin फ्यूजन प्रोटीन (MHC-़) वांछित प्रतिजन पेप्टाइड अनुक्रम के साथ ।

नोट: यदि H-2Kb: ़ का उपयोग कर रहा है, तो चरण १.१ में विस्तृत प्रोटोकॉल का पालन करें; यदि H-2Db: ़ का उपयोग कर रहा है, तो चरण १.२ में विस्तृत प्रोटोकॉल का पालन करें ।

  1. एच में पेप्टाइड अनुक्रम के सक्रिय लोडिंग-2Kb: आइजी ।
    1. आवश्यक बफ़र्स तैयार करें । विकार बफर १५० मिमी NaCl और 15mM ना2CO3 में से एक समाधान बनाने के द्वारा तैयार है और फिर ११.५ करने के लिए पीएच समायोजन । renaturation बफर को २५० mM Tris एचसीएल का सॉल्यूशन बनाकर पानी में घोल तैयार करें और पीएच को ६.८ पर एडजस्ट करें ।
      नोट: सामान्यतया, यह के बारे में 5 मिलीलीटर की आवश्यकता होगी विकार और renaturation बफ़र्स के लिए 1 मिलीग्राम H-2Kb: ़.
    2. स्वभाव H-2Kb: ़ बढ़ाया पेप्टाइड बाइंडिंग की अनुमति देने के लिए । एच-2Kb: आइजी एकाग्रता के बीच में लाने के लिए 0.5-2 मिलीग्राम/एमएल के साथ फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) । तो एच-2Kb: ़ 100-200 µ जी के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पतला/विकार बफर के 5-10 मात्रा समकक्ष के साथ और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन की अनुमति देते हैं ।
    3. जोड़ें ५० दाढ़ पेप्टाइड अनुक्रम की अतिरिक्त (आमतौर पर स्टॉक पेप्टाइड 1 मिमी पर रखा जाता है-८० ° c) H-2Kb: ़ समाधान करने के लिए.
      नोट: आमतौर पर पेप्टाइड एंटीजन के भीतर भंग किया जा करने के लिए की आवश्यकता होगी कम से 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) और फिर धीरे से जोड़ा गया करने के लिए पंजाब में घुलनशील रहने के लिए. एमिनो एसिड अनुक्रम के आधार पर, DMSO की मात्रा को बढ़ाने की आवश्यकता हो सकती है ।
    4. renature एच-2Kb: Ig के साथ पेप्टाइड । तुरंत पेप्टाइड के अतिरिक्त निंनलिखित, renaturation बफर जोड़कर ७.४ के एक पीएच करने के लिए समाधान लाने के लिए । बेअसर समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर ४८ ज के लिए मशीन की अनुमति दें ।
    5. ध्यान लगाओ और पेप्टाइड-लोड एच-2Kb धो: ़. एक ५० केडीए आणविक वजन कट-ऑफ (MWCO) के साथ एक केंद्रापसारक ध्यानी का उपयोग, निर्माता के निर्देशों का पालन करने के लिए पेप्टाइड-भरी एच-2Kb: ़ समाधान 3 बार पंजाबियों के साथ, ध्यान केंद्रित करने के लिए ंयूनतम 1 मिलीग्राम/ और एक spectrophotometer पर एकाग्रता को बढ़ाता है ।
  2. एच में पेप्टाइड अनुक्रम के सक्रिय लोडिंग-2Db: आइजी ।
    1. आवश्यक बफ़र्स तैयार करें । १३१ mm साइट्रिक एसिड, १५० mM NaCl, और १२४ mm Na2HPO4 का समाधान करने के लिए विकार बफर तैयार करें और फिर पीएच को ६.५ से एडजस्ट करें । renaturation बफर को १२० mM Tris एचसीएल का सॉल्यूशन बनाकर पानी में घोल तैयार करें और पीएच को ८.८ पर एडजस्ट करें ।
      नोट: आम तौर पर, यह के बारे में 5 मिलीलीटर की आवश्यकता होगी विकार बफर और 1 मिलीग्राम के लिए renaturation बफर के 1 एमजी H-2Db: ़.
    2. स्वभाव H-2Db: ़ बढ़ाया पेप्टाइड बाइंडिंग की अनुमति देने के लिए । एच-2Db: आइजी एकाग्रता के लिए 0.5 के अंतिम एकाग्रता लाओ-2/ फिर, पतला H-2Db: ़ 100-200 µ जी के अंतिम एकाग्रता के लिए/एमएल विकार बफर की 5-10 मात्रा समकक्ष के साथ ।
    3. जोड़ें ५० दाढ़ पेप्टाइड अनुक्रम की अतिरिक्त (आमतौर पर स्टॉक पेप्टाइड 1 मिमी पर रखा जाता है-८० ° c) H-2Db करने के लिए: ़ समाधान और 1 के लिए मशीन की अनुमति दें ३७ डिग्री सेल्सियस पर एच.
    4. जोड़ें β2 microglobulin और स्वभाव H-2Db: ़ with पेप्टाइड. β2 microglobulin के अतिरिक्त 2-गुना दाढ़ जोड़ें । फिर, renaturation बफर जोड़कर समाधान ७.४ के एक पीएच के लिए ले आओ । बेअसर समाधान की अनुमति दें 4 ° c पर 24 घंटे के लिए मशीन ।
    5. ध्यान लगाओ और धो पेप्टाइड-लोड एच-2Db: ़. एक ५० केडीए MWCO के साथ एक केंद्रापसारक ध्यानी का उपयोग, निर्माता के निर्देशों का पालन करने के लिए पेप्टाइड-लोड एच-2Kb: ़ समाधान 3 बार पंजाबियों के साथ, ध्यान केंद्रित करने के लिए कम से 1 मिलीग्राम/ एक spectrophotometer पर एकाग्रता ।

2. संयुग्मी MHC-पेप्टाइड परिसरों और सह Stimulatory अणुओं चुंबकीय नैनोकणों की सतह के लिए Nanoparticle कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं को पेश करने के लिए फार्म । कण के आकार और आवेदन के आधार पर तीन अलग तरीकों में से एक का उपयोग करें ।

नोट: विभिन्न तकनीकों की एक संख्या कणों की सतह के लिए प्रोटीन संयुग्मी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस के साथ, 3 अलग दृष्टिकोण वर्णित हैं: अमीन लेपित कणों (चरण २.१), N-hydroxysuccinimide (एन एच एस)-लेपित कणों (चरण २.२), और विरोधी-बायोटिन-लेपित कणों (चरण २.३) । इन प्रक्रियाओं को भी6,7प्रकाशित दो पत्रों के तरीकों खंड के भीतर विस्तार से वर्णित किया गया है । बाँझ समाधान के साथ एक सुरक्षा धुएं हुड में सभी कदम प्रदर्शन स्टॉक aAPC कणों की बाँझ बनाए रखने के लिए.

  1. कोट प्रतिजन-विशिष्ट और stimulatory संकेत करने के लिए अमीन लेपित चुंबकीय कणों (चित्रा 2) । यह प्रक्रिया १०० एनएम, अमीन लेपित superparamagnetic नैनोकणों के लिए वर्णित है ।
    नोट: एक अमीन लेपित कण की सतह के लिए एंटीबॉडी संलग्न के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल https://www.micromod.de/en/technotes-2.html में पाया जा सकता है, जहां Technote २०१ का वर्णन कैसे thiolate एंटीबॉडी और संयुग्मी maleimide functionalize के लिए कणों और २०२ maleimide कार्यात्मक समूहों के साथ functionalize अमीन लेपित कणों के लिए आवश्यक प्रक्रिया का वर्णन । यहां, MHC-आइजी और सह stimulatory इन कणों से जुड़ी संकेतों के लिए केवल मामूली संशोधनों पर प्रकाश डाला जाता है ।
    1. Thiolate Traut के एजेंट के साथ एंटीबॉडी (Technote २०१) ।
      1. एक 10x पंजाबियों-ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) बफर (०.१ एम पंजाबियों और १०० mM EDTA) तैयार करें । एक 1:10 अनुपात में एंटीबॉडी के लिए 10x पंजाबियों-EDTA बफर जोड़ें मुक्त thiols के ऑक्सीकरण को रोकने के लिए एंटीबॉडी को जोड़ा ।
      2. Traut के एजेंट के 20 दाढ़ अतिरिक्त जोड़ें (2-iminothiolane) एंटीबॉडी के लिए और मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर 2 ज के लिए गर्मी । एक रासायनिक धुएं डाकू के भीतर है Traut एजेंट (सूखा पाउडर) बाहर उपाय के लिए श्वसन से बचने के रूप में यह thiol समूहों के लिए अमीन समूहों धर्मांतरित ।
      3. 1x पंजाबियों-EDTA बफर के साथ अच्छी तरह से धो 3 बार एक ५० केडीए MWCO के साथ एक केंद्रापसारक ध्यानी का उपयोग कर, और निर्माता के निर्देशों का पालन करें, ५०० µ एल के एक अंतिम मात्रा तक ध्यान केंद्रित एंटीबॉडी समाधान की एकाग्रता का उपयोग कर एक spectrophotometer ।
    2. sulfosuccinimidyl 4 का उपयोग कर maleimide समूहों के लिए चुंबकीय nanoparticle पर अमीन कार्यात्मक समूहों कंवर्ट-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC, Technote २०२) ।
      1. कणों के लिए एक 1:10 अनुपात में एंटीबॉडी के लिए 10x पंजाबियों-EDTA बफर जोड़ें ।
      2. भंग पानी और भंवर में Sulfo-SMCC 1 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर resuspend करने के लिए । एक रासायनिक धुएं डाकू के भीतर Sulfo-SMCC (सूखा पाउडर) बाहर उपाय के लिए श्वसन से बचने के रूप में यह maleimide समूहों के लिए अमीन समूहों धर्मांतरित ।
      3. कणों की हर वर्ग मिलीमीटर सतह क्षेत्र के लिए Sulfo-SMCC समाधान के ०.०१६ nmol जोड़ें । १०० एनएम कणों की 1 मिलीग्राम के लिए, Sulfo-SMCC का उपयोग ०.३ मिलीग्राम । कमरे के तापमान पर १.५ ज के लिए प्रतिक्रिया करने की अनुमति दें ।
      4. 1x पंजाबियों के साथ कणों धो-EDTA बफर 3 बार एक चुंबकीय स्तंभ के साथ एक चुंबकीय क्षेत्र का उपयोग कर और ५०० µ में resuspend 1x पंजाबियों-EDTA बफर के एल ।
        नोट: यदि कणों का उपयोग कर २०० एनएम से छोटे, जैसे कि १०० एनएम कणों के साथ साथ वर्णित है, सबसे अधिक संभावना स्थाई मैग्नेट पर्याप्त शक्तिशाली धोने या ध्यान केंद्रित प्रयोजनों के लिए कणों खींचने के लिए नहीं होगा । इस प्रकार, छोटे कणों को धोने के लिए, चुंबकीय क्षेत्र को बढ़ाना ferromagnetic क्षेत्रों से बना एक चुंबकीय स्तंभ का उपयोग करें ।
    3. thiolated एंटीबॉडी (Technote २०१) के साथ maleimide-कार्यात्मक कणों प्रतिक्रिया.
      1. एक ग्लास जुटाना शीशी में कणों जोड़ें, एक मिनी चुंबकीय हलचल बार जोड़ने के लिए, एक चुंबकीय हलचल प्लेट के ऊपर सिर्फ एक इंच जगह है, और चुंबकीय कण समाधान के मिश्रण प्रेरित ।
      2. मिश्रण समाधान करने के लिए, जोड़ें thiolated एंटीबॉडी (०.५ मिलीग्राम एंटीबॉडी के हर 1 के लिए मिलीग्राम कणों की) dropwise. कमरे के तापमान पर रात भर प्रतिक्रिया करने की अनुमति दें ।
      3. 1x पंजाबियों बफर के साथ धो 3 बार एक चुंबकीय क्षेत्र का उपयोग कर और ५०० µ में resuspend 1x पंजाब के एल । लेबल और 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
        नोट: अधिकतम विकार दक्षता तब होती है जब maleimide-कार्यात्मक कणों तुरंत thiolated प्रोटीन के साथ मिश्रित कर रहे हैं ।
  2. कोट प्रतिजन-विशेष और stimulatory संकेत एन एस-लेपित चुंबकीय कणों के लिए (चित्रा 3) । इस प्रक्रिया के लिए वर्णित है २०० एनएम, एन एच एस-लेपित superparamagnetic नैनोकणों ।
    1. resuspension बफ़र, शमन बफ़र, और संग्रह बफ़र तैयार करें । 25 मिमी 2-(N-morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस) ०.०१% के बीच 20 पीएच ६.० के लिए समायोजित के साथ resuspension बफर है । शमन बफर पीएच ७.४ पर Tris-एचसीएल के १०० मिमी समाधान है । भंडारण बफर 10 मिमी पंजाबियों और पीएच ७.४ में ०.०१% के बीच का एक समाधान है ।
    2. resuspend बफ़र के 1 मिलीलीटर में lyophilized कणों resuspend । जब तक कोई समुच्चय दिखाई नहीं दे रहा है तो सख्ती से कम से 15 मिनट के लिए भंवर ।
    3. supernatant हटाने के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर चुंबकीय कणों प्लेस, पुनर्निलंबन बफर के ०.५ मिलीलीटर के साथ resuspend और एक गिलास जुटाना शीशी को हस्तांतरण । भंवर जब तक कोई समुच्चय दिखाई दे रहे हैं ।
    4. जोड़ें ०.१ के प्रति कुल प्रोटीन की मिलीग्राम 1 resuspend कणों की मिलीग्राम. भंवर मिश्रण करने के लिए और २.५ घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया जबकि मिश्रण ।
    5. शमन बफर के ०.१ मिलीलीटर जोड़ें और मिश्रण जबकि 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया ।
    6. एक चुंबकीय स्टैंड पर जुटाना शीशी रखें और कणों को धो लें । supernatant दूर करने के लिए स्पष्ट है जब तक प्रतीक्षा करें । चुंबकीय स्टैंड से कणों को दूर, कोई समुच्चय दिखाई दे रहे हैं जब तक resuspension बफर और भंवर के 1 मिलीलीटर जोड़ें । तीन बार इस प्रक्रिया को दोहराएँ और 1 मिलीलीटर resuspend बफ़र में कणों को पुनर्स्थगित । 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कणों की दुकान ।
  3. कोट प्रतिजन-विशिष्ट और stimulatory संकेत करने के लिए विरोधी बायोटिन लेपित चुंबकीय कणों (चित्रा 4) । 50-100 एनएम, एंटी-बायोटिन superparamagnetic नैनोकणों के लिए यह प्रक्रिया बताई गई है ।
    1. Biotinylate MHC-़ या सह-stimulatory अणु ।
      1. को समायोजित प्रोटीन एकाग्रता के लिए 0.5-2/ resuspend sulfo-एन एच एस-बायोटिन की एकाग्रता में 10 मिलीग्राम/मिलीलीटर पानी में और 20 गुना दाढ़ अतिरिक्त stimulatory एंटीबॉडी जोड़ें । ४५ मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
      2. पंजाब के साथ अच्छी तरह से धो 3 बार एक ५० केडीए MWCO के साथ एक केंद्रापसारक ध्यानी का उपयोग कर, निर्माता के निर्देशों का पालन करें, ५०० µ एल के एक अंतिम मात्रा तक ध्यान केंद्रित एक spectrophotometer का उपयोग एंटीबॉडी समाधान की एकाग्रता उपाय ।
    2. एंटी-बायोटिन नैनोकणों को संयुग्मी biotinylated MHC-आइजी और/या सह-stimulatory संकेत । शेयर विरोधी बायोटिन कणों के ५०० µ एल के लिए, stimulatory एंटीबॉडी के ०.५ nmol जोड़ें और 4 ° c रात भर में गर्मी ।
    3. धो संयुग्मित aAPC नैनोकणों । क्योंकि इन कणों से २०० एनएम छोटे हैं, एक चुंबकीय स्तंभ गीला और एक चुंबकीय स्टैंड पर डाल दिया ।
    4. स्तंभ के लिए कण/प्रोटीन निलंबन जोड़ें । सभी प्रोटीन/कणों को पूरी तरह से कॉलम में प्रवेश करने दें ।
    5. पंजाब के ०.५ मिलीलीटर तीन बार कॉलम को जोड़कर धो लें ।
    6. Elute ने चुंबकीय स्टैंड से कॉलम हटाकर, पंजाबियों के ०.५ मिलीलीटर कॉलम को जोड़कर, और गोताख़ोर का प्रयोग करते हुए, expulse कण aAPCs को एक गिलास जुटाई शीशी में डाल कर. 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर कणों ।
      नोट: कणों 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रहे हैं (जम नहीं होना चाहिए) अप करने के लिए 6 महीने के लिए. उच्च तापमान कणों की कार्यक्षमता में कमी और कुछ कण एकत्रीकरण मनाया गया है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । समय की विस्तारित अवधि के लिए कमरे के तापमान पर रखने के रूप में यह काफी कणों की शेल्फ जीवन कम हो जाती है मत करो ।

3. कृत्रिम प्रतिजन पर प्रोटीन सामग्री विशेषताएं फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी डिटेक्शन का उपयोग कर सेल नैनोकणों पेश ।

नोट: यह उत्पादित कृत्रिम antigen प्रस्तुत कोशिकाओं का एक उपयोगी गुणवत्ता नियंत्रण है । इसके अलावा, stimulatory संकेत की मात्रा बैचों और विभिन्न aAPC प्रकार (जैसे, विभिन्न आकारों) भर में समकक्ष aAPC खुराक का उत्पादन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

  1. लेपित aAPCs के कण एकाग्रता को मापने ।
    1. शेयर समाधान से unconjugated कणों का प्रयोग करें और अच्छी तरह से १०० µ एल के साथ एक ९६-अच्छी तरह से फ्लैट तली ऊतक संस्कृति की थाली भर में पंजाबियों के एक समाधान में एक 1:2 खुराक अनुमापन बनाते हैं ।
    2. एक ज्ञात कण एकाग्रता से एक मानक वक्र बनाने के लिए ४०५ एनएम पर एक थाली पढ़ने spectrophotometer पर कणों पढ़ें ।
    3. संयुग्मित aAPCs का एक नमूना ले, १०० µ एल की कुल मात्रा को पंजाबियों में पतला और spectrophotometer पर पढ़ें ।
  2. गढ़े aAPCs का एक नमूना निकालें और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ दाग ।
    1. कितना नमूना निकालने के लिए गणना करने के लिए, कण की सतह पर एंटीबॉडी की संख्या का अनुमान.
      नोट: इन तकनीकों के लिए, लगभग १००० एंटीबॉडी के एक घनत्व मान/µm2 कण सतह क्षेत्र के । करने के लिए प्रतिदीप्ति का पता लगाने में सक्षम हो, यह लगभग 1011 MHC-़ या CD28 फ्लोरोसेंट परीक्षण के अनुसार कुल अणुओं की आवश्यकता है ।
    2. पंजाब में १०० µ एल तक aAPCs की कुल मात्रा लाओ, एक 1:100 कमजोर पड़ने पर धुंधला एंटीबॉडी जोड़ने और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
      नोट: उदाहरण के एंटीबॉडी सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया FITC संयुग्मित चूहे-विरोधी माउस ़ λ1, λ2, λ3 प्रकाश श्रृंखला, क्लोन R26 ४६ का पता लगाने के लिए MHC-़, और FITC संयुग्मित माउस विरोधी आर्मेनियाई/सीरियाई हंसटर आईजीजी, क्लोन G192-1, विरोधी माउस CD28 का पता लगाने के लिए ।
  3. कणों को धोने और एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर पर प्रतिदीप्ति पढ़ें ।
    1. चुंबकीय धो (के रूप में चरण 2 में वर्णित) सना aAPC अंश तीन बार पंजाब के ०.५ मिलीलीटर के साथ ।
    2. Elute ने पंजाब के ०.५ मिलीलीटर के साथ धोया aAPCs ।
    3. जोड़ें १०० µ eluted aAPCs के एल एक ९६-अच्छी तरह से फ्लैट तली हुई प्लेट के लिए चरण ३.१ में के रूप में अवशोषक का उपयोग कर एकाग्रता पढ़ें ।
    4. शेष ४०० µ एल लो, २ २०० µ एल aliquots में विभाजित है और एक काले, polystyrene ९६ में दो कुओं को जोड़ने-अच्छी तरह से, फ्लैट तली हुई थाली । अनुमापन समाधान के १०० µ एल लेने के द्वारा प्लेट नीचे एक 1:2 अनुपात में और अगले अच्छी तरह से है कि एक अच्छी तरह से चार बार में पंजाब के १०० µ एल है के साथ मिश्रण ।
      नोट: माप में शोर को कम करने के लिए माप की औसत से अधिक प्रतिकृति.
    5. एक ही काले ९६ पर अच्छी तरह से थाली, फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के एक मानक वक्र बनाने के दाग के लिए इस्तेमाल किया, यह 1:200 में एक अच्छी तरह से पंजाब और titrating के २०० µ एल के साथ में जोड़ने के द्वारा नीचे 1:2 अनुपात में कम 12 कुओं के लिए ।
    6. दोनों aAPC और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के बाद थाली पर हैं, एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर के साथ थाली पढ़ें ।
  4. प्रति कण प्रोटीन की मात्रा की गणना करें । मानक वक्र, जहां एंटीबॉडी एकाग्रता जाना जाता है के लिए मूल्यों की तुलना द्वारा एंटीबॉडी की एकाग्रता का निर्धारण, धुंधला एंटीबॉडी का पता लगाया एंटीबॉडी का एक 1:1 अनुपात संभालने । तो यह विभाजन का पता लगाया एंटीबॉडी के अवशोषण परख द्वारा निर्धारित कणों की एकाग्रता के साथ के कण प्रति एंटीबॉडी की संख्या देंगे ।

4. तैयार Nanoparticle कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं को पेश करने के साथ प्रतिजन विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं को समृद्ध ।

  1. सीडी 8 + टी कोशिकाओं को अलग ।
    1. ग्रीवा विस्थापन द्वारा पीछा isoflurane के लिए जोखिम से पशुओं Euthanize ।
    2. wildtype C57BL/6j चूहों और पंजाबियों के एक समाधान में जगह से तिल्ली और लिम्फ नोड्स निकालें । Macerate अंगों और elute के माध्यम से कोशिकाओं को बाँझ ७० µm सेल छलनी के साथ लगातार बहाकर पंजाबियों.
    3. नॉन-सीडी 8 + t कक्षों को समाप्त करने के लिए, नो-टच सीडी 8 + t सेल आइसोलेशन किट का उपयोग करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें.
      नोट: प्रत्येक antigen शर्त के लिए आवश्यक है ंयूनतम 3 x 106 सीडी 8 + T कक्ष ।
  2. सीडी 8 + T कक्षों में बाइंड करने के लिए nanoparticle aAPCs जोड़ें ।
    1. अलगाव के बाद, ०.५% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) और 2 मिमी EDTA के साथ पंजाब में १०० µ एल की एक मात्रा के लिए ध्यान केंद्रित ।
    2. प्रत्येक 106 सीडी 8 + टी कोशिकाओं के लिए 1011 aAPC-बाउंड, पेप्टाइड-लोडेड MHC-़ के अनुपात के आधार पर गणना करके जोड़ने के लिए aAPCs की संख्या निर्धारित करें ।
    3. एक बाँझ 5 मिलीलीटर polystyrene दौर नीचे ट्यूब में नित्य मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए aAPC कणों और सीडी 8 + टी कोशिकाओं की मशीन ।
  3. पूरक मीडिया और टी सेल विकास फैक्टर (TCGF) elute और कल्चर सीडी 8 + टी कोशिकाओं को तैयार करें ।
    1. अनुपूरक मीडिया के लिए, अनुपूरक पूर्ण RPMI १६४० मीडिया (glutamine के साथ) 1x गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 0.4 x विटामिन समाधान, ९२ µ एम 2-mercaptoethanol, 10 µ एम ciprofloxacin और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ ।
    2. TCGF बनाने के लिए, पहले से ही स्थापित प्रोटोकॉल का पालन करें और यहां संदर्भित9।
      नोट: TCGF एक में है मानव प्रतिरक्षा साइटोकिंस के घर कॉकटेल जो अतिरिक्त उत्तेजना विकसित करने के लिए आवश्यक संकेतों के साथ टी कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के लिए आवश्यक है । TCGF टी सेल stimulatory साइटोकिंस जैसे आईएल-2, आईएल-7, या आईएल-15 के लिए अदला-बदली की जा सकती है; हालांकि, प्रत्येक टी सेल प्रतिक्रिया तदनुसार ध्रुवीकरण हो सकता है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल इन कॉकटेल के साथ अनुकूलित नहीं किया गया है; TCGF10,11सूचीबद्ध उदाहरणों के साथ उपयोग नहीं किया जाता है, तो इस प्रकार अन्य तकनीकों सांद्रता और संयोजन के लिए परामर्श किया जाना चाहिए.
  4. aAPC और सीडी 8 + टी सेल मिश्रण को धोकर और समृद्ध करें ।
    1. चरण 2 में वर्णित के रूप में चुंबकीय कण aAPCs धो लें । हालांकि, पहले ०.५% BSA और 2 मिमी EDTA के साथ पंजाबियों बफर का उपयोग कर धो, दूसरा पूरक मीडिया का उपयोग कर, और तीसरे 1% TCGF के साथ पूरक मीडिया का उपयोग कर ।
    2. Elute aAPCs और समृद्ध सीडी 8 + टी कोशिकाओं में 1% TCGF के साथ पूरक मीडिया के ५०० µ l ।
    3. एक hemocytometer और प्लेट में एक ९६ U-तली हुई प्लेट में १६० µ एल में 1% TCGF के साथ पूरक मीडिया का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना २.५ x 105 सीडी 8 + टी कोशिकाओं/
    4. यदि केवल पेप्टाइड के साथ aAPCs का उपयोग कर अलग-MHC-़ सतह पर लोड (कोई सह stimulatory संकेत), तो पूरा कदम ४.५. दोनों पेप्टाइड-लोड MHC-़ सतह और सह-stimulatory संकेतों पर के साथ aAPCs का उपयोग कर अलग है, तो 5 कदम के लिए आगे बढ़ना ।
  5. सतह पर समृद्ध अंश के लिए सह-stimulatory संकेतों के साथ लेपित चुंबकीय कणों को जोड़ें और टी कोशिकाओं की सतह पर सह-क्लस्टर stimulatory संकेतों के लिए एक चुंबकीय क्षेत्र जोड़ें ।
    1. समृद्ध भागों के लिए, एक equimolar जोड़ें (या अधिक से अधिक आवेदन पर निर्भर करता है-नियंत्रण करने के लिए aAPC गुण के बारे में अनुभाग देखें) stimulatory एंटीबॉडी की संख्या के लिए पेप्टाइड-लोड MHC-़ कण पर.
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए समृद्ध सीडी 8 + टी कोशिकाओं को बाइंड करने के लिए सह-stimulatory चुंबकीय कणों की अनुमति दें ।
    3. लंबाई में १.९ सेमी (०.७५ इंच) की दो neodymium N52 डिस्क मैग्नेट के बीच कल्चरल प्लेट रखकर चुंबकीय क्षेत्र जोड़ें ।
      नोट: N52 डिस्क मैग्नेट एक अत्यंत मजबूत क्षेत्र है । देखभाल दोनों मैग्नेट के बीच स्पेसिंग के साथ उन्हें स्टोर करने के लिए लिया जाना चाहिए, क्योंकि यह एक दूसरे से दूर करने के लिए कठिन है, और जब उन्हें संस्कृति प्लेटों पर डाल. मशीन के धातु घटकों से चिपके हुए मैग्नेट को कम करने के लिए, उंहें ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब स्टायरोफोम कंटेनरों में नीचे और ऊपर दोनों पर रखें ।

5. का विस्तार करें और antigen-विशिष्ट सीडी 8 + T कोशिकाओं के साथ तैयार Nanoparticle कृत्रिम प्रतिजन पेश कोशिकाओं का पता लगाएं ।

  1. 3 दिनों के लिए एक humidified 5% CO2, ३७ ° c मशीन में aAPCs और सीडी 8 + T कोशिकाओं के साथ ९६ U-तली अच्छी प्लेट जोड़ें । 3 दिन पर, 2% TCGF के साथ पूरक मीडिया के प्रति अच्छी तरह से ८० µ एल के साथ कोशिकाओं को फ़ीड और 7 दिन तक मशीन में वापस जगह है ।
  2. 7 दिन पर, गिनती के लिए एक 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब में उत्तेजित कोशिकाओं फसल ।
  3. एक बार सभी समाधान के काटा है, काटा कोशिकाओं नीचे स्पिन के लिए ०.०५% सोडियम azide और 2% FBS के साथ पंजाब के ०.५ मिलीलीटर में resuspend । trypan नीले और एक hemocytometer पर गिनती के साथ धुंधला द्वारा व्यवहार्य कोशिकाओं गिनती ।
  4. निकालें 50000-500000 दो नए 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूबों के लिए प्रतिजन-विशिष्ट धुंधला में कोशिकाओं गिना । एक ट्यूब cognate पेप्टाइड-MHC दाग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, और अंय ट्यूब गैर के लिए इस्तेमाल किया जाएगा-cognate दाग पृष्ठभूमि धुंधला निर्धारित करने के लिए ।
  5. biotinylated MHC के 1 µ g जोड़ें-़ (चरण 2 में वर्णित तकनीक का उपयोग करते हुए) संबंधित cognate और गैर cognate ट्यूबों में पंजाब के १०० µ एल के साथ ०.०५% सोडियम azide और 2% FBS के साथ allophycocyanin (APC)-संयुग्मित चूहा विरोधी माउस CD8a, क्लोन 53-6.7 (के कमजोर पड़ने अनुपात 1:100) के लिए 1 ज 4 ° c.
  6. द्वितीयक streptavidin जोड़ें और मृत दाग रहते हैं । अतिरिक्त biotinylated MHC-़ के माध्यम से पंजाबियों के साथ बाहर धोने केंद्रापसारक । फिर phycoerythrin (पीई) के एक 1:350 अनुपात के साथ सभी नमूनों दाग-streptavidin और एक जीवित/मृत fixable ग्रीन मृत सेल 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए दाग के 1:1000 अनुपात लेबल ।
  7. विशिष्टता और antigen-विशिष्ट कक्षों की संख्या निर्धारित करने के लिए एक प्रवाह cytometer पर सभी नमूनों को पढ़ें ।
    1. अतिरिक्त माध्यमिक और जीने/मृत दाग से बाहर धोने और १५० ०.०५% सोडियम azide और 2% FBS के साथ पंजाबियों बफर के µ एल के साथ resuspend एक प्रवाह cytometer पर पढ़ने के लिए ।
  8. संख्या और डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के साथ antigen-विशिष्ट कक्षों का प्रतिशत निर्धारित करें ।
    1. antigen-विशिष्ट कक्षों का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए, संबंधित क्रम live +, लिम्फोसाइट + (साइड स्कैटर द्वारा अग्रेषित करें), सीडी 8 +, और डिमर + में निंन गेट्स का उपयोग । डिमर + गेट को नॉन-cognate की तुलना करके cognate दाग को निर्धारित करें ।
    2. गैर-cognate MHC-़ दाग से cognate MHC-़ दाग की डिमर + के प्रतिशत को घटाकर एक नमूने में antigen-विशिष्ट कक्षों का प्रतिशत निर्धारित करें ।
    3. antigen-विशिष्ट कक्षों के इस प्रतिशत का उपयोग करके, इसे गिने गए कक्षों की संख्या से गुणा करें, प्रतिजन-विशिष्ट कक्षों की संख्या को संवर्धन और विस्तार से परिणामी ।
      नोट: मुआवजा के प्रवाह cytometer पर स्थापित करने के बाद से वहां वर्णक्रमीय इस पैनल में इस्तेमाल fluorophores के साथ ओवरलैप है होगा ।

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Representative Results

प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के एक सफल संवर्धन और विस्तार को पूरा करने के लिए, पेप्टाइड लोड MHC-़ और सह stimulatory अणुओं aAPC कण के लिए सफलतापूर्वक संलग्न किया जाना चाहिए । कण लगाव के 3 तरीकों के आधार पर, हम एक सफल विकार प्रक्रिया परिणाम (आंकड़ा 5ए) के लिए कुछ प्रतिनिधि डेटा प्रदान करते हैं । वास्तव में, यदि ligand घनत्व बहुत कम है, तो वहां प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं के प्रभावी उत्तेजना है जहां यह हमारे अनुभव (चित्रा 5b)7में १०० एनएम से ऊपर लाइगैंडों के बीच रैखिक रिक्ति के आसपास होता है नहीं होगा ।

दोनों मात्रात्मक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी readouts और ट्रांसजेनिक सीडी 8 + टी सेल विस्तार के अलावा, nanoparticle aAPCs cognate ट्रांसजेनिक प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं में डोपिंग द्वारा गुणवत्ता नियंत्रण के लिए जाँच की जा सकती है. यह एक Pmel माउस जो gp100-विशिष्ट प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं है और एक 1:1000 अनुपात में एक बी-6 पृष्ठभूमि में डोपिंग के रूप में एक ट्रांसजेनिक माउस से सीडी 8 + टी कोशिकाओं को अलग करके किया जा सकता है । गिनती और पहले और बाद संवर्धन धुंधला दोनों गुना संवर्धन (चित्रा 6a) और प्रतिशत वसूली (चित्रा घमण्ड)6के गणन की अनुमति देता है । इन प्रतिनिधि परिणामों में, हम प्रदर्शित करते है कि संकेत-1 केवल aAPCs सबसे कुशल संवर्धन प्रदान (लगभग 10 गुना) और लगभग ८०% सेल वसूली, जो पारंपरिक संकेत 1 और 2 aAPCs जो गैर विशिष्ट विरोधी है पर बढ़ाया है CD28 कण पर के रूप में अच्छी तरह से ।

एक बार कण aAPCs गया है पर्याप्त विशेषता और नियंत्रित गुणवत्ता, तो वे संवर्धन और दुर्लभ प्रतिजन के विस्तार में इस्तेमाल किया जा सकता है-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं wildtype चूहों से । सटीक परिणाम के लिए, यह biotinylated डिमर जैसे कार्यात्मक डिटेक्शन एजेंट, है करने के लिए महत्वपूर्ण है । biotinylated डिमर की गुणवत्ता नियंत्रण भी ट्रांसजेनिक सीडी 8 + टी कोशिकाओं पर किया जा सकता है दाग सत्यापित करने के लिए । यहाँ, प्रतिनिधि परिणाम एक पृष्ठभूमि नियंत्रण (चित्रा 7) के रूप में बी-6 सीडी 8 + टी कोशिकाओं के साथ gp100-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं के साथ सकारात्मक दाग दिखा. चित्रा 7 यह भी दर्शाता है कि अगर वहाँ biotinylated डिमर के स्तर के बहुत अधिक हैं, तो यह अपने आप ही और प्रदर्शन मोनो-valent बंधन के साथ प्रतिस्पर्धा करेंगे के रूप में इसकी शौकीनता कम हो जाएगा.

संवर्धन और सात दिनों के लिए माउस सीडी 8 + टी कोशिकाओं के विस्तार के बाद, एक 5 और ५० प्रतिशत प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं के बीच की उम्मीद कर सकते हैं, लगभग २०,००० के साथ २००,००० प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं के साथ शुरू करने के बाद 5 x 106 सीडी 8 + टी कोशिकाओं शर्त प्रति (चित्रा 8) 6. विशेष रूप से, जब प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं के लिए धुंधला, यह biotinylated डिमर की पृष्ठभूमि धुंधला पता है, जहां इस मामले में यह ४.१५% था महत्वपूर्ण है; cognate दाग से इस से कम किसी भी प्रतिशत को नकारात्मक परिणाम (figure8a) माना जाता है । साथ ही, यह कहाँ प्रवाह cytometry गेट्स antigen-विशिष्ट सीडी 8 + T कक्षों का वास्तविक प्रतिशत निर्धारित करने के लिए आरेखित करने के लिए दिखाई देगा । यह उन मामलों में महत्वपूर्ण है जहां antigen-विशिष्ट सीडी 8 + T कक्षों में विशिष्ट आबादी नहीं है (जैसा आरेख 8aमें दिखाया गया है) लेकिन एक व्यापक धब्बा के रूप में प्रकट हो सकता है ।

एक ही प्रक्रिया को अलग और मानव प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । समान गुणवत्ता नियंत्रण और परिणाम देखा जाना चाहिए जहां प्रतिशत में काफी बढ़ जाती है और प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की संख्या संवर्धन के बाद केवल एक सप्ताह के विस्तार के बाद मनाया जाता है (9 अंक)5।

Figure 1
चित्रा 1 : antigen-विशिष्ट संवर्धन और विस्तार nanoparticle कृत्रिम प्रतिजन-पेश कोशिकाओं का उपयोग कर की प्रक्रिया की योजनाबद्ध । सबसे पहले, एक no-टच सीडी 8 + टी सेल अलगाव पूरा करें । उसके बाद, nanoparticle aAPCs सीडी 8 + T कक्षों में जोड़ें । एक चुंबकीय क्षेत्र, संस्कृति के साथ समृद्ध है, और aAPCs के साथ उत्तेजित । अंत में, का पता लगाने समृद्ध और विस्तारित प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: conjugating पेप्टाइड के लिए योजनाबद्ध-MHC-आइजी और सह stimulatory-अमीन लेपित चुंबकीय कणों की सतह के अणुओं लोड । संक्षेप में, Sulfo-SMCC crosslinker maleimide कार्यात्मक समूहों के साथ चुंबकीय कण सतह functionalize करने के लिए प्रयोग किया जाता है । MHC-आइजी और सह stimulatory अणुओं को एक साथ Traut के thiol कार्यात्मक समूहों का उत्पादन करने के लिए एजेंट के साथ कार्यात्मक रहे हैं । सक्रिय कणों और प्रोटीन संकेतों को एक साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है और फिर प्रतिजन-विशिष्ट कृत्रिम प्रतिजन-पेश सेल चुंबकीय नैनोकणों का उत्पादन करने के लिए धोया । यह आंकड़ा नैनो पत्र7में हमारी प्रयोगशाला के प्रकाशन के पूरक सामग्री से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: conjugating पेप्टाइड के लिए योजनाबद्ध-MHC-आइजी और सह-stimulatory अणुओं एन एच-लेपित चुंबकीय कणों की सतह के लिए । संक्षेप में, एन एच सी-लेपित कणों पेप्टाइड-लोडेड MHC-आइजी और सह stimulatory अणुओं के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है और फिर प्रतिजन-विशिष्ट कृत्रिम प्रतिजन पेश सेल चुंबकीय नैनोकणों का उत्पादन करने के लिए धोया । यह आंकड़ा नैनो पत्र7में हमारी प्रयोगशाला के प्रकाशन के पूरक सामग्री से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : conjugating पेप्टाइड-लोड MHC-आइजी और विरोधी-बायोटिन-लेपित चुंबकीय कणों की सतह के लिए सह stimulatory अणुओं के लिए योजनाबद्ध । MHC-आइजी और सह stimulatory अणुओं एन एच-बायोटिन के साथ कार्यात्मक है बायोटिन कार्यात्मक समूहों का उत्पादन । फिर विरोधी बायोटिन लेपित कणों कार्यात्मक पेप्टाइड लोड MHC-आइजी और सह stimulatory अणुओं के साथ एक साथ प्रतिक्रिया व्यक्त कर रहे हैं । बाद में, इन कणों को प्रतिजन-विशिष्ट कृत्रिम प्रतिजन-पेश कोशिका चुंबकीय नैनोकणों का उत्पादन करने के लिए धोया जाता है । यह आंकड़ा नैनो पत्र7में हमारी प्रयोगशाला के प्रकाशन के पूरक सामग्री से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : विकार दक्षता और प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के संवर्धन के विस्तार के लिए महत्वपूर्ण है । (एक) तीन अलग आधार चुंबकीय कणों के लिए तीन विकार तरीकों के साथ विकार दक्षता के लिए प्रतिनिधि डेटा कागज में वर्णित: अमीन लेपित कणों, एन एस-लेपित कणों, और विरोधी बायोटिन लेपित कणों । प्रत्येक डेटा बिंदु एक अलग कण तैयारी तकनीक और त्रुटि पट्टियों का प्रतिनिधित्व करता है S.E.M. (ख) कैसे ligand घनत्व को प्रभावित करता है ट्रांसजेनिक सीडी 8 + टी कोशिका उत्तेजना, जहां ligand घनत्व लाइगैंडों में ६०० के बीच रैखिक रिक्ति के रूप में प्रतिनिधित्व किया है nanometers एनएम और ५० एनएम aAPCs (एन = 5 और त्रुटि सलाखों S.E.M. प्रतिनिधित्व करते हैं) । यह आंकड़ा नैनो पत्र7में हमारी प्रयोगशाला के प्रकाशन से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : aAPC संवर्धन की गुणवत्ता नियंत्रण । ट्रांसजेनिक Pmel gp100-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं wildtype B6 सीडी 8 + टी कोशिकाओं में एक 1:1000 अनुपात में मैगनीज थे । (एक) गुना संवर्धन congenic मार्कर तेरा 1.1 और सीडी 8 धुंधला द्वारा संवर्धन के बाद प्रवाह cytometry का उपयोग कर मापा गया था । यहां संकेत 1 केवल कणों या db-़ gp100, पारंपरिक संकेत 1 और 2 कणों या db-़ gp100 और विरोधी CD28, और गैर cognate संकेत 1 और 2 कणों से भरी हुई के साथ भरी हुई के साथ लोड के बीच एक तुलना की गई थी । (ख) कोशिकाएँ प्रत्येक विधि द्वारा कोशिका वसूली को मापने के पहले और बाद में भी गिनी जाती थीं. डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों और त्रुटि पट्टियों का प्रतिनिधित्व करता है S.E.M. डेटा संयुक्त Tukey के बाद परीक्षण (*p< 0.05, * *p< 0.01) के साथ एक-तरफ़ा ANOVA द्वारा मापा गया था । यह आंकड़ा नैनो पत्र6में हमारी प्रयोगशाला के प्रकाशन से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : biotinylated डिमर की गुणवत्ता नियंत्रण । Gp100-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं एक ट्रांसजेनिक Pmel माउस से अलग थे और µ Db के तीन सांद्रता-़ biotinylated और APC विरोधी Gp100 के साथ भरी हुई है, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में CD8a बी-6 wildtype + टी कोशिकाओं का उपयोग कर के साथ पंजाब के १०० सीडी 8 एल में दाग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 : संवर्धन और प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं का विस्तार । बी-6 wildtype सीडी 8 + टी कोशिकाओं या तो संकेत 1 केवल (केबी-़ TRP2 से भरी हुई) या संकेत 1 और 2 (केबी-़ TRP2 और विरोधी CD28 संयुग्मित कण की सतह के साथ भरी हुई) के साथ समृद्ध थे । संकेत 2 तो संकेत के समृद्ध अंश में जोड़ा गया था 1 केवल aAPCs और सभी कोशिकाओं को 7 दिनों के लिए संस्कृति थे । (क) सीडी 8 + टी कोशिकाओं दाग और एक जीवित/मृत फ्लोरोसेंट दाग पर gated हैं, तो gated सीडी 8 + और KbTRP2 +, और एक गैर-cognate केबी-आइजी की तुलना में antigen-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए । (ख) प्रतिशत और (ग) TRP2-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की संख्या इस प्रकार निर्धारित किया जा सकता है, जहां उच्च प्रतिशत और प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की संख्या से पता लगाया जा सकता है संकेत 1 केवल संवर्धन दृष्टिकोण (n = 7, त्रुटि सलाखों मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं, दो-पुच्छेड t परीक्षण *p < ०.०५, * *p < ०.०१) । यह आंकड़ा नैनो पत्र6में हमारी प्रयोगशाला के प्रकाशन से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9 : संवर्धन और मानव प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं का विस्तार । (क) प्रतिनिधि प्रवाह cytometry भूखंड पर 0 दिन संवर्धन और 7 दिन से पहले समृद्ध और विस्तार के नाटकीय प्रभाव दिखाने के पारंपरिक nanoparticle aAPCs के साथ स्वस्थ दाताओं से प्रतिजन विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं जहां a2-़ हिंदी अनुवाद के साथ भरी-ESO1 और a2-़ MART1 एंटीजन के साथ लोड दिखाया जाता है । (ख) यह उच्च प्रतिशत (~ 10-20%) और संख्या (0.5-1 x 106) प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं के दिन 7 से उत्पंन (n = 3 स्वतंत्र दाताओं से, त्रुटि पट्टियां S.E.M. प्रतिनिधित्व करते हैं) । यह आंकड़ा ACS नैनो5में हमारी प्रयोगशाला के प्रकाशन से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक फ़ाइल 1-बॉक्स 1 । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए । 

अनुपूरक फ़ाइल 2-बॉक्स 2 । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए । 

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Discussion

हम एक उपंयास प्रतिजन-विशिष्ट टी सेल अलगाव प्रौद्योगिकी nanoparticle कृत्रिम प्रतिजन पेश कोशिकाओं (aAPCs) पर आधारित बनाया है । Nanoparticle aAPCs की सतह पर पेप्टाइड-लोड MHC है जो antigen-विशिष्ट T कक्ष बाइंडिंग और सक्रियण को सह-stimulatory सक्रियण के साथ अनुमति देता है । aAPCs भी paramagnetic हैं, और इस प्रकार एक चुंबकीय क्षेत्र का उपयोग कर दुर्लभ प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हम अनुकूलित और आकार, ligand घनत्व के प्रमुख nanoparticle गुणों का अध्ययन किया है, और ligand पसंद और बंधन, संवर्धन, सक्रियकरण, और सेल संवर्धन पर उनके प्रभाव (अनुपूरक फ़ाइल 1-बॉक्स 1) ।

इस प्रकार, संवर्धन और विस्तार प्रक्रिया के परिणाम प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी सेल विस्तार के कई हजार गुना उत्पादन प्रतिजन-विशिष्ट प्रतिशत के रूप में उच्च ६०% और, दोनों murine और मानव सेटिंग्स में इस्तेमाल किया जा सकता है (अनुपूरक फ़ाइल 2-बॉक्स 2 ). इस तरह के उच्च संख्या और प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के प्रतिशत रोगों के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लक्षण वर्णन सक्षम (जैसे, कैंसर, स्व-प्रतिरक्षित, आदि), उपंयास प्रतिरक्षा लक्ष्य और तंत्र की खोज के लिए अनुमति देते हैं, और करने के लिए अवसर की पेशकश दत्तक immunotherapy में प्रयुक्त । एक विशेष आवेदन का एक उदाहरण के लिए एक रोगी के ट्यूमर अनुक्रम है, उत्परिवर्तनों की पहचान, उत्परिवर्ती दृश्यों से संभावित MHC बाँधने का पता लगाने, उन शीर्ष उंमीदवार प्रतिजनों के साथ aAPCs उत्पादन, और फिर aAPCs का उपयोग करने के लिए निर्धारित है कि क्या रोगी किसी भी ट्यूमर-विशिष्ट neoantigens ।

दरअसल, methodological सीमाओं का अध्ययन करने और प्रतिजन-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा रहा है । वर्तमान तकनीक (a) पर्याप्त समय की आवश्यकता है-और काम के गहन प्रक्रियाओं, (ख) ऐसे ऑटोलॉगस वृक्ष कोशिकाओं को इकट्ठा करने की आवश्यकता के रूप में सेल लाइनों को बनाए रखने में वर्तमान कठिनाई, (ग) टी सेल विस्तार के सप्ताह की आवश्यकता से पहले परिणाम प्राप्त करने के लिए, (घ) परिणाम कम विशिष्टताओं में (1-2%) और प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की कम संख्या, (ई) अक्सर महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि संकेत के साथ, और (च) सीडी 8 + टी कोशिकाओं है कि अक्सर उत्पादित कर रहे हैं या आगे की परख में अध्ययन नहीं किया जा सकता है । एक विधि प्रतिजन के साथ प्रतिरक्षण की आवश्यकता है ELISPOT करने से पहले प्रतिजन-विशिष्ट प्रतिक्रिया14,15,16,17की उपस्थिति को चिह्नित करने के लिए । एक अन्य विधि मिलकर का उपयोग-मिनी-जीन अभिव्यक्ति plasmids करने के लिए transfect antigen प्रस्तुत कोशिकाओं cytokine के साथ division tetramer दाग की आवश्यकता है + प्रतिक्रियाओं जैसे IFNγ संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए18. यहां तक कि पेप्टाइड स्पंदन अंतर्जात प्रतिजन में कोशिकाओं को पेश इन विट्रो संस्कृति में, केवल परिणाम में ०.५% वृद्धि में प्रतिजन विशिष्टता15।

हमारे दृष्टिकोण इन methodological सीमाओं को हल करती है और इस प्रकार एक नैदानिक और चिकित्सीय उपकरण के रूप में कार्य कर सकते हैं । antigen-विशिष्ट सीडी 8 + T सेल संवर्धन और विस्तार सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं 1) प्रभावी रूप से लोड MHC-़ के साथ पेप्टाइड प्रतिजन, 2) संयुग्मी stimulatory संकेतों नैनोकणों की सतह के लिए, 3) बाइंड कणों के लिए टी कोशिकाओं, 4) को बाध्य कोशिकाओं को समृद्ध एक चुंबकीय क्षेत्र के साथ नैनोकणों, 5) संस्कृति में eluted nanoparticle-बाउंड टी कोशिकाओं का विस्तार, और 6) biotinylated, पेप्टाइड-भरी MHC के साथ दिन 7 पर प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं का पता लगाने ।

मुख्य समस्याओं है कि संवर्धन और विस्तार प्रोटोकॉल में उभरने या तो अनुचित उत्पादन या समाप्त डिटेक्शन एजेंट या nanoparticle aAPCs से उत्पंन होता है । biotinylated डिमर antigen-विशिष्ट सीडी 8 + t कक्ष ट्रांसजेनिक antigen-विशिष्ट सीडी 8 + t कक्षों पर परीक्षण के साथ दाग कर सकते है कि सुनिश्चित करें । अगर पेप्टाइड-MHC-़ एक संगत ट्रांसजेनिक माउस मॉडल नहीं है, यह एक सकारात्मक नियंत्रण पेप्टाइड लोड और लोड हो रहा है सत्यापित करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण का परीक्षण करने के लिए उपयोगी हो सकता है. हालांकि, कुछ पेप्टाइड्स MHC-आइजी में लोड नहीं हो सकता है; यह MHC जैसे नेट-MHC, या RMAS के साथ प्रयोग-सेल आधारित परख13के रूप में लोड हो रहा है एल्गोरिदम के साथ अनुकरणीय किया जा सकता है । aAPC कण स्थिरता 6 महीने के बाद कम हो सकती है, तो अगर वहां संवर्धन और विस्तार के परिणामों में कुछ परिवर्तनशीलता है, तो एक और फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर परख के लिए स्थिरता की पुष्टि किया जा सकता है ।

भविष्य के काम में, हम क्षमताओं, चौड़ाई, और परख की गहराई का विस्तार उद्देश्य । हम एक ९६-well प्लेट प्रारूप में एक समय में जांच की एकाधिक प्रतिजनों के साथ मल्टीप्लेक्स के लिए क्षमता और दोनों का प्रवाह बढ़ाने पर काम कर रहे हैं । वर्तमान में, एक मुख्य सीमा है कि केवल कुछ एंटीजन एक साथ जांच की जा सकती है । हम इस काम कर रहे है जांच कैसे कण aAPC और ligand घनत्व के आकार संवर्धन को प्रभावित करता है । इसके अतिरिक्त, हम कैसे अलग सेल रचनाएं प्रभाव सीडी 8 + संस्कृति के भीतर टी सेल विस्तार की जांच कर रहे हैं । अंत में, हम MHC वर्ग द्वितीय के भीतर इस तकनीक की नकल करने के लिए समृद्ध और प्रतिजन विशिष्ट CD4 + टी कोशिकाओं का विस्तार करने में सक्षम हो उद्देश्य ।

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Disclosures

लेखक निंनलिखित प्रतिस्पर्धा वित्तीय ब्याज की घोषणा (ओं): NexImmune और जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय के बीच एक लाइसेंस समझौते के तहत, जोनाथन Schneck इस में वर्णित उत्पादों की बिक्री पर विश्वविद्यालय द्वारा प्राप्त रॉयल्टी के एक हिस्से के हकदार है आलेख. वह NexImmune के संस्थापक भी थे और कंपनी में इक्विटी के मालिक हैं । वह NexImmune के निदेशक और वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड के एक सदस्य के रूप में कार्य करता है । इन व्यवस्थाओं की शर्तों की समीक्षा की गई है और अपनी ब्याज नीतियों के विरोध के अनुसार जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित ।

Acknowledgments

J.W.H. धंयवाद NIH कैंसर नैनो NanoBioTechnology के लिए जॉंस हॉपकिंस संस्थान में प्रशिक्षण केंद्र, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन स्नातक रिसर्च फैलोशिप (डीजीई-१२३२८२५), और फैलोशिप समर्थन के लिए आर्क्स फाउंडेशन । यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से समर्थन द्वारा वित्त पोषित किया गया (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/मैरीलैंड नवाचार पहल, और कल्टर फाउंडेशन (JPS) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein BD Biosciences 551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig BD Biosciences 551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein BD Biosciences 550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932257
Purified Human Beta 2 Microglobulin Bio-Rad PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles Micromod 79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm Ocean Nanotech SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure Miltenyi 130-105-637
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217
Sulfo-SMCC Crosslinker  ProteoChem c1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene Corning 3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46   BD Biosciences 553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1 BD Biosciences 554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice Jackson Laboratory 005023
C57BL/6J (B6 wildtype) mice Jackson Laboratory 000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi 130-104-075
MS Columns Miltenyi 130-042-201
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE Biolegend 405203
N52 disk magnets of 0.75 inches  K&J Magnetics DX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 Biolegend 100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation  ThermoFisher L-34969

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References

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अभियांत्रिकी अंक १४१ नैनोकणों चुंबकीय संवर्धन कृत्रिम प्रतिजन-पेश कोशिकाओं टी कोशिकाओं immunotherapy कैंसर दुर्लभ कोशिका संवर्धन टी सेल विस्तार दत्तक टी सेल थेरेपी Neoantigen immunoengineering इंजीनियरिंग
समृद्ध और चुंबकीय नैनोकणों के साथ दुर्लभ प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का विस्तार
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Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (141), e58640, doi:10.3791/58640 (2018).

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